专利名称：一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测基因芯片、检测系统及检测方法
技术领域：
本发明属于基因芯片应用技术领域，具体地，本发明涉及一种基于rRNA基因种专 一序列的非酶扩增检测基因芯片、检测系统及检测方法。
背景技术：
基因芯片是利用平行分析原理将大量不同序列的核酸分子作为分析样品中靶基 因的探针，以微点阵方式固化在硅片，玻璃，尼龙膜等基质上，从而制成通常意义上的基因 芯片，也称为DNA微阵列。感染性病原体诊断芯片就是将待测病原体的特征基因片段(靶基因)固定于玻片 上制成芯片，将从病人血液、组织或细胞中抽提出病原体的DNA或RNA，在制备靶基因的合 成中掺入了核苷单体dNTP及一部分与生物素一类的标记物或荧光基因共价偶联的核苷单 体dNTP，从而合成带有各种信号标记并被扩增的cDNA靶基因，经扩增标记荧光后与芯片进 行杂交，然后将带有标记物来自不同细胞组织标本的cDNA靶杂交到基因芯片上固定的探 针片段上，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析，判断阴阳性。靶基因的制备和标记是基因芯片技术流程的一个重要环节，目前的通用技术是在 靶基因在与芯片探针结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯 片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录 过程中实现对靶基因的标记。细菌核糖体RNA(rRNA)是原核生物的标志，其16S rRNA基因是以多拷贝形式存在 于所有细菌染色体基因中，该序列在原核生物中保守性极强，某些序列片段为所有细菌共 有，对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差，但其种间序列上的差异足 以进行物种鉴定。并且每个细胞中含有rRNA拷贝数大约为10，000个，使得绕过前面对目 标序列的扩增，直接进行低浓度样本和开拓分子检测应用成为可能。在分子检测领域中，所使用的检测设备为半导体装置，而捕获探针是在溶液中制 备、标记，这样捕获探针不能直接连接于基质。例如，CN 200810117952. 6公开了一类分子 检测系统，其公开了微生物病原体的非扩增检测实例，其捕获探针并非直接固定于基质上， 而是与多聚物偶联后再间接固定到芯片基质，这种方法虽然实现非酶扩增检测，但是多聚 物偶联步骤繁琐、增加检测成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测基因芯片。本发明的再一目的是提供一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测系统。本发明的再一目的是提供一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测方法。根据本发明的基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测基因芯片，其包括1)基质；
2)捕获探针，所述捕获探针为基于原核生物rRNA基因种的16SrRNA专一序列，直 接固定于基质表面，构成基因芯片微点阵；3)报告探针，所述报告探针是基于rRNA基因种间的高度保守序列，其末端被标 记。根据本发明的芯片，所述基质可以为基因芯片领域的常规基质，如硅片，玻璃，尼 龙膜等。捕获探针的获得及固定根据不同病原菌的种属16SrRNA专一序列片段，设计并 合成一段特异性寡核苷酸探针，固定于基因芯片固相表面，构成基因芯片微点阵。该探针可 以是，但不局限于以下病原菌的特异性寡核苷酸片段包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道临 床常见病原菌以及临床样品中常见的非致病菌rDNA基因片段。上述寡核苷酸捕获探针是通过对所有病原菌的rDNA序列的比对分析获得的，每 种病原菌获得η (η < 10)条特有的16-25个碱基候选条序列片段，经过进一步杂交验证后， 最终每种病原菌确定1条特有序列，称为“种专一捕获探针”。将捕获探针结合在芯片基质表面可以通过多种途径实现，例如可以在表面引入环 氧基团，以与共联探针的羟基或氨基反应，还可以将表面用多聚赖氨酸处理，以结合点在表 面上的捕获探针，紫外照射可以将探针结合在如载玻片或电子设备临近的钝化层等基质 上，寡核苷酸可以被结合在引入醛基、氨基或异硫氰酸酯基的传感器表面。阵列的制造机制 可以是针点、喷点或芯片上直接合成，所述基质为玻璃或CMOS图像传感器表面。报告探针的获得基于rDNA序列保守区设计并筛选出每种病原菌种间同源性最 高的30个碱基候选条序列片段，并在序列5’端标记生物素，经过进一步杂交验证后，最终 确定1条寡核苷酸通用序列，称为“通用性报告探针”，优选其长度为17-45个碱基。杂交单一样本来源的靶rRNA与标记的报告探针和基因芯片上的捕获探针同时 杂交，形成“捕获探针_靶rRNA-报告探针”杂交复合物，然后加入特异性酶，与报告探针的 标记物(如生物素)进行反应，在底物催化下即可发出信号。根据本发明的基因芯片，其中，所述rRNA来源于致病病原体或非致病病原体，所 述致病病原体包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道疾病相关致病病原体。根据本发明的基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测系统，其包括1)基质；2)捕获探针，所述捕获探针为基于原核生物rRNA基因种的16SrRNA专一序列，直 接固定于基质表面，构成基因芯片微点阵；3)报告探针；4)图像传感器。可以通过数字图象或者说“机器视觉”传感技术来读取阵列上结合的待检物信号， 其具有低背景和相对高信噪比的特点，是一种强化的检测待检物的生物传感器系统。具体 的说这种生物传感器系统应用了包括有子板上的数字图象传感器、阵列、带有传感器降温 装置的低光外壳和待检物信号的积分方法等的信号传感技术。阵列所产生的光学信号可以被数字图象传感器检测，其中数字图象传感器包括光 敏元件的矩阵，点制的捕获探针通过共价或非共价结合于数字图象传感器的表面形成阵 列。用另一种方式，捕获探针可以点制在可以靠近数字图象传感器的载玻片上，而在载玻片
4和传感器直接存在有光纤耦合器。阵列上单个探针点的局部区域可以大于数字图象传感器的单个光敏元件。同样探针点大小可以与单个光敏元件一致。根据本发明的检测系统，可以使用数字图象传感器检测捕获探针_靶rRNA-报告 探针杂交后产生的信号，其中数字图象传感器包括光敏元件的矩阵。数字图象传感器可以是CMOS活性像素传感器，其每个像素对应连接有数字转换 器、放大器和寄存器的光敏二极管。CMOS活性像素传感器的顶层是钝化层，如可以充分透光 的二氧化硅，以作为隔绝阵列检测的待检物溶液和半导体线路的屏障。适用的光学检测包括检测荧光、化学发光、生物发光和量子点等方法，标记物或信 号分子附着在报告探针上，包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、化学发光体、生物发光 剂、酶、抗体、颗粒如磁珠和量子点。用于检测待检物的信号分子包括放射性同位素，荧光染 料如Cy3、Cy5、Alexa Fluor488、荧光素、罗丹明、得克萨斯红、玫瑰红、丹磺酰氯、溴化乙啶、 萘胺、pyrenes、卟啉，化学发光系统如鲁米诺、发光氨、吖啶苯酯、钌盐、生色团，和比色探针 如胶体金、偶氮染料、喹啉染料、花青染料。标记物包括拮抗剂和对抗剂、毒素、抗原决定基、激素、抗体、多肽、酶、寡核苷酸、 肽核酸、凝集素、碳水化合物、蛋白和药物，例如用于ELISA检测的酶可以用来进行荧光检 测，另外，荧光标记的抗生物素或链酶亲和素。对一种特定的待检物可以通过多种标记物形成多种检测方法，例如报告探针可以 连接多种荧光或化学发光标记物，此外，报告探针也能够结合多种靶点，因此报告探针可以 连接多种靶点结合分子和多种不同的标记物。对于荧光检测，荧光物的激发光可以由靠近阵列或者靠近CMOS传感器外壳的LED 面板提供，在阵列附近阵列点与光敏二极管之间的窄带滤光片可以从阵列的读取信号中去 除激发信号，而对发射光进行检测。另一种方法是待检物信号可以通过光学检测化学发光来读取测定信息。化学发光 来自于化学反应产生的光，可以被没有滤光片的宽带探测器所检测，如CMOS活性像素传感 器，阵列点发出的光直接被检测，背景信号主要来自于“暗电流”。待检物可以标记上化学发 光标签用于化学发光检测，如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。检测效率一部分依赖于对标 记的选择性或特异性附着效率，标记识别物可以是生物素或地高辛抗体此类的能被酶检测 系统识别的物质，然后发生化学发光反应通过化学键断裂释放能量产生离散波长的光子。本发明中的阵列信号检测可以使用数字图象传感器，也可以使用电荷耦合装置 (CCD)、光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管来完成，待检物的检测也可以通过，例如电导 检测来完成不同的阵列方案。根据本发明，可以直接把阵列构建在数字图象传感器上以增强其检测的信号，这 是通过检测形成在数字图象传感器顶部薄的钝化层上的阵列所发射的化学发光来实现的， 信号可以被接近于阵列的数字图象传感器感光原件方便的增强。根据本发明的基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测方法，其包括以下步骤1)制备多种形式样品中的rRNA的粗品；2)在芯片基质上直接固定一种或一种以上捕获探针，所述捕获探针为基于原核生 物rRNA基因种的16SrRNA专一序列，直接固定于基质表面；
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3)报告探针和捕获探针在规定的杂交条件下与同一个样本的rRNA杂交，所述报 告探针是基于rRNA基因种间高度保守序列，设计和筛选的通用性寡核苷酸片段，长度为 17-45个碱基，5’端经生物素(biotin)标记，构成通用性报告探针，可直接与靶rRNA进行 杂交，然后加入特异性酶，与报告探针的标记物(如生物素)进行反应，在底物催化下即可 发出信号，检测信号直接从图像传感器得到数据。本发明提供了一套操作简便、灵敏度高和实现信号放大的操作技术，是一种双探 针(捕获探针和报告探针)基因芯片信号放大技术。根据本发明的技术，可以直接检测多 种形式粗略样品中的核酸，而不需要核酸的抽提和扩增环节；捕获探针直接连接到芯片基 质表面，简化检测步骤、减少检索成本，同时具有极高的检测灵敏度，这种全新的发明可能 会改变或替代目前针对临床核酸样品或其它核酸样品应用领域的基因分型、基因突变和基 因表达图谱的应用现状。
图1在临床样本1中检测到脑膜炎奈瑟菌。图2在临床样本2中检测到李斯特菌。图3对可引起脑膜炎的4种病原菌同时检测。
具体实施例方式实施例1脑脊液中微生物病原体的非扩增检测月市炎球菌(streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)、李其j 特菌(listeria monocytogenes)禾口 流感嗜血杆菌(hemophilus influenzae)等细菌是引起新生儿脑膜炎的主要病原菌。利用本发明中的检测系统，临床上 在无菌条件下抽取脑脊液作为临床样品，无需PCR扩增，即可对细菌基因进行非扩增放大 检测，实现快速确诊。根据细菌16S rRNA基因兼有保守性和变异性的特征，设计出能与所有细菌 16SrRNA杂交的报告探针，以及4种脑膜炎常见病原菌的捕获探针。以下探针均由北京奥科 生物技术有限责任公司合成。
临床样品的处理及靶基因的制备将2份不同病人的脑脊液各ImL分别加入到 ImL含有2% SDS的PBS缓冲液和ImL (体积)的玻璃珠混合，用最高速度在漩涡器上旋转 混勻，然后用台式超声破碎机破碎一分钟，重复4次以上，将超声破碎产物离心，取上清。
基因芯片的制备将捕获探针溶于20mM NaBO3 (pH 9. 0)/5mM NaCl/20% DMSO中， 采用基因芯片点样仪进行点样，每个芯片点6个阵(4种捕获探针以及阴、阳性对照)，按照 常规方法来制备芯片。杂交A 首先在点有6个阵的芯片加入封闭液I (6X SSPE/90%甲酰胺/lmg/ml BSA)， 于室温静置30min ；B 吸出封闭液I，加入杂交液(在IOyL上清液加入IOyL含有90%甲酰胺和 6XSSPE的溶液并加入1 μ L生物素报告探针)，室温静置1小时；C 然后转到直接结合了捕获探针的感受芯片上，于30°C杂交1小时。D 吸出杂交液，用洗液(0. IX SSPE/lmg/ml BSA/1%甘油)洗涤3次，每次5min ；E 加入封闭液II (IX TBS/5% BSA/1%甘油 /0. 05% Tween-20)静置 30min ；F 吸出封闭液 II，加入浓度为 1 500 的 Straptavidine-HRP，反应 30min ；G:以洗液(IX TBS/1%甘油/lmg/ml BSA)洗去未结合的 Straptavidine-HRP，洗 涤3次，每次5min。检测然后将芯片传感器插入检测仪，加入底物催化，发出信号，检测信号直接从 图像传感器得到数据。根据信号强弱确定病原菌的存在结果表明从临床样本1脑膜炎奈瑟菌的所在的 阵有明显的亮点，说明样本1的脑脊液中存在脑膜炎奈瑟菌(结果见图1)；从临床样本2中 检测到李斯特菌，并且该阵亮度较高，说明该病原菌在脑脊液中含量较高(结果见图2)。另外，本系统不但可对单一病原菌进行检测，亦可对4种病原菌同时进行检测，将 4种病原菌，肺炎球菌、脑膜炎奈瑟菌、李斯特菌和流感嗜血杆菌稀释至10，000cfu/mL,等 体积混合后，取0. 3mL与0. 3mL含有2 % SDS的PBS缓冲液和0. 3mL (体积)的玻璃珠混合， 用最高速度在漩涡器上旋转混勻，离心、取上清作为制备的靶基因，然后即可按上述程序进 行杂交、检测。图3中明确显示出对4种病原菌同时检测的结果。实施例2沙眼衣原体(CT)和淋球菌(NG)的检测在对于最常见的性传染疾病CT/NT进行临床检测时，一般是用棉花球插入阴道取 样。取样后的棉花球可用PBS缓冲液将大部分细胞清洗下来，然后重悬在ImL的PBS中，取 0. 3mL与0. 3mL含有2% SDS的PBS缓冲液和0. 3mL (体积)的玻璃珠混合，然后用最高速 度在漩涡器上旋转混勻，离心、取上清即为制备的靶基因溶液。捕获探针的设计与制备基于CT和NG菌种间16S rRNA特异性基因组序列，各设 计一条捕获探针，3’端标记-NH2，交予北京奥科生物技术有限责任公司合成。探针连接采 用氨基化探针与环氧活化的芯片共价结合的方法。序列如下CT-Pb 5' -GTTACTCGGATGCCCAAATATCGCC-NH2-3'NG-Pb 5' -GGATAGCGCAAGGCCCGAA-NH2-3‘报告探针的设计与制备在GenBank查得多种常见细菌16S rRNA基因序列，在保 守区用寻找一段大多数常见细菌共有保守序列，并在5’端偶联上生物素，然后将序列提交 北京奥科生物技术有限责任公司合成，作为报告探针。其序列为5' -Biotin-CGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACA-3杂交与检测按实施例1操作程序进行杂交和信号检测，杂交温度为30°C，时间为1小时。我们在对10份临床样本进行基因芯片检测的同时，也对样本进行了 CT/NG的PCR 扩增，结果表明亮点位置准确、清晰。有4份样本呈现出CT/NG双阳性杂交信号，其中2份 检测到CT强阳性，NG信号较弱；其余6人为阴性。此结果与PCR扩增结果完全一致，说明 本检测方法特异性强，灵敏度高。实施例3污水中细菌的快速检测食品企业污水中含有各种无机污物和有机污物，其中夹带的致病菌能导致多种疾 病的爆发和流行。现行的检测方法主要是利用传统微生物学方法、血清学方法和PCR方法， 其方法多存在一些限制培养时间长、不能区别亲缘关系相近的细菌、灵敏度低等。而本发 明提供的基因芯片技术可以实现快速、准确、特异性的检测。选取食品污水中常见的大肠杆 菌(escherichia coli)、肠球菌(enterococcus)、志贺氏菌(shigella flexneri)、沙门氏 菌(salmonella enterica)共计4种菌作为检测对象。在16s RNA可变区分别设计4种特异性的捕获探针；在16s RNA的稳定区设计通
用性的报告探针，其序列如下表 靶基因的制备将采集的污水样品IOmL置于台式超声破碎机破碎一分钟，重复4 次以上，离心取上清。杂交与检测按实施例1操作程序进行杂交和信号检测，杂交温度为30°C，时间为 1小时。我们同时对不同地区采集的5份污水样本进行了基因芯片检测和细菌培养检测 的比对，结果表明基因芯片检测结果与细菌培养结果基本一致，并且基因芯片比细菌培养 具有更高的灵敏度。具体结果见下表。
这种检测技术为以后更大规模的检测研究奠定了良好的技术基础，可以推广应用 于环境监测、食品卫生监督、商品检验检疫等许多领域。
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权利要求
一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括1)基质；2)捕获探针，所述捕获探针为基于rRNA基因种的16S rRNA专一序列，直接固定于基质表面，构成基因芯片微点阵；3)报告探针，所述报告探针是基于rRNA基因种间高度保守序列，其末端被标记。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述捕获探针的长度为16-25个碱基。
3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述报告探针的长度为17-45个碱基。
4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述rRNA来源于致病病原体或非致 病病原体。
5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述致病病原体包括血液、呼吸道、 消化道和泌尿生殖道疾病相关致病病原体。
6.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基质为玻璃或CMOS图像传感器表面。
7.一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测系统，其特征在于，所述检测系统包括1)基质；2)捕获探针，所述捕获探针为基于rRNA基因种的16SrRNA专一序列，直接固定于基质 表面，构成基因芯片微点阵；3)报告探针，所述报告探针是基于rRNA基因种间的高度保守序列，其末端被标记；4)图像传感器。
8.根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述图像传感器为CMOS图像传感器。
9.一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测方法，其特征在于所述方法包括以 下步骤1)制备多种形式样品中的rRNA的粗品；2)在芯片基质上直接固定一种或一种以上捕获探针，所述捕获探针为基于rRNA基因 种的16S rRNA专一序列，直接固定于基质表面；3)报告探针和捕获探针在规定的杂交条件下与同一个样本的rRNA杂交，所述报告探 针是基于rRNA基因种间的高度保守序列，其末端被标记；4)检测信号，检测信号直接从图像传感器得到数据。
全文摘要
本发明属于基因芯片应用技术领域，具体地，本发明涉及一种基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测基因芯片、检测系统及检测方法。根据本发明的基于rRNA基因种专一序列的非酶扩增检测基因芯片，其包括1)基质；2)捕获探针，所述捕获探针为基于原核生物rRNA基因种的16SrRNA专一序列，直接固定于基质表面；3)报告探针，所述报告探针是基于rRNA基因种间的高度保守序列，其末端被标记。根据本发明的技术，可以直接检测多种形式粗略样品中的核酸，而不需要核酸的抽提和扩增环节；捕获探针直接连接到芯片基质表面，简化检测步骤、减少检索成本，同时具有极高的检测灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK101899512SQ20101022875
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者刘治平, 栾升, 甘一迪 申请人:北京九州泰康生物科技有限责任公司