专利名称：一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸疫苗，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗及其制 备方法。
背景技术：
鸡传染性喉气管炎是一种急性、高度接触性上呼吸道传染病。本病特征为呼吸困 难，喘气，咳出带血分泌物，喉部和气管黏膜肿胀、出血，并形成糜烂。该病急性爆发时，发病 率可达100%，死亡率一般在20%左右，产蛋鸡的产蛋量明显下降，被国际兽疫局列为B类 疾病。自1925年美国报道该病以来，现已遍及世界各国，我国于50年代发现有本病的存在。目前国内外防制ILT的主要措施是采用减毒疫苗。减毒疫苗存在毒力偏强、潜伏 感染、易于返祖等弊端，长期使用减毒疫苗不利于ILTV的根除，因此国内外研究人员都在 不断致力于ILTV新型疫苗的研制，并已取得了一定的进展。哈尔滨兽医研究所张绍杰等以 鸡痘病毒(FPV)为载体，构建了含ILTV糖蛋白gB基因的重组FPV，该重组病毒可稳定表达 ILTV糖蛋白gB，该重组病毒的免疫保护性效果与常规的ILTV弱毒疫苗相当，是一种很有希 望的预防ILT疫苗。由于活载体疫苗存在宿主对载体本身免疫的限制，通常不能进行多次 免疫接种，因此研究人员正在积极探索其它新型疫苗的研制。自从1990年出现基因免疫以来，许多病毒的不同基因导入各种动物体内，产生了 较好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗，因其既有亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫 苗的有效性而受到研究人员的瞩目。目前基因疫苗已在多种人和动物的传染病、寄生虫病、 抗肿瘤等方面取得进展。在禽病基因疫苗研究方面，许多学者对AIV、IBDV、IBV、NDV等的 基因免疫已进行了研究。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低，还不能完全有效抵抗 致死剂量病原体的攻击，因此，如何增强DNA疫苗的免疫保护率成为急需解决的问题。许 多研究表明，细胞因子能够增强抗原的免疫原性，这些细胞因子包括IL-2、IFN- y , IL-6和 IL-18等。研究表明，将编码细胞因子的质粒DNA与DNA疫苗同时插入到一个真核表达载体 中，使细胞因子与抗原在机体中同时表达，利用细胞因子在免疫应答中的免疫调节功能来 调节和增强DNA疫苗的免疫效果，从而发挥细胞因子的佐剂作用。质粒pIRES为双顺反子真核表达载体，在其多克隆位点MCS A和MCS B之间设计 有微小RNA病毒的内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site，IRES)，由IRES 连接的两个开放阅读框架，其转录产物在翻译时核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游 及下游的两个转录子。用于转录后修饰的SV40mRNA早期PolyA信号肽位于MCS B下游，确 保克隆入多克隆位点内的两个外源基因共同转录，所翻译出的目的蛋白各自具有独自的空 间结构和生理活性，而不是融合蛋白。白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是近年来新发现的一种重要的细胞免 疫调节因子，它可刺激Thl细胞高水平诱生IFN- y、GM-CSF, IL-2等细胞因子，促进T细胞 的增殖，显著增强Thl细胞和NK细胞的细胞毒作用等免疫调节功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种增强免疫效果的鸡传染性喉气管炎双价核 酸疫苗及其制备方法。本发明的技术方案是一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，在真核表达载体 PlRES的2个多克隆位点中分别插入了 ILTV願1株gB和ChIL_18完整基因，所述双价核酸 疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因。鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗的制备方法，它的步骤如下(1)设计并合成1对扩增ChIL-18的引物，上游引物Yl 为5，-GTAGGATCCATGAGCTGTGAAGAGAT-3’,下游引物Y2 为5，TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3’,上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点，预期扩增长度为615bp ；设计并合成1对扩增ILTV gB的引物，上游引物Y3 为5，-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3，，下游引物Y4 为5，-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3，,上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，预期扩增长度为2. 6kb ；分别以质粒pGEM-T-IL-18和pGEM_T_gB为模板，应用PCR技术，通过引物Y1/Y2 扩增ChIL-18，通过Y3/Y4扩增gB基因；通过每对引物的限制性酶切位点，把gB和ChIL-18 分别插入PlRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-gB/IL18重组质粒；(2)真核重组表达载体的构建将PCR产物ChIL-18，经BamHI和Sal I双酶切回收后插入真核表达载体pIRES的 MCSB位点上，得到pIRES-IL18，重组质粒pGEM-T-gBl，经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB 基因插入重组真核表达质粒PIRES-IL18的MCS A位点上，构建成重组质粒pIRES_gB/IL18， 制成鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗。重组质粒pIRES_gB/IL18经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了重组质粒 pIRES-gB/IL18 ；将构建成功的重组质粒pIRES_gB/IL18用脂质体法转染鸡胚成纤维细胞， 以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，经RT-PCR检测到两种目的基因的转 录；间接免疫荧光试验检测到gB蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光， 证明蛋白得到表达。本发明的有益效果是本发明采用的真核双表达载体PlRES在启动子下游的MCS A和MCS B的多克隆酶切位点分别插入鸡传染性喉气管炎病毒HNl株gB基因片段和鸡白介 素-18基因片段，获得真核双表达质粒pIRES-gB/IL18。避免两种质粒共同免疫时可能存在 的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答 潜伏期，为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。本发明鸡传染性喉气管炎病毒HNl株gB基因和鸡IL-18基因双价核酸疫苗的制 备方法，简称共表达ILTV HNl株gB和ChIL-18双价核酸疫苗的制备方法，本发明根据哺乳 动物细胞真核表达载体pIRES MCS A、MCS B多克隆位点的序列和ILTV HNl株gB和ChIL-18 基因阅读框架，分别设计并合成了针对ChIL-18和gB的引物Y1/Y2，Y3/Y4。利用引物Yl/ Y2，PCR扩增ChIL-18基因。将PCR产物ChIL-18经BamHI与Sal I双酶切回收后，插入 PlRES的MCS B位点上，得到真核表达质粒pIRES-IL18 ；利用引物Y3/Y4，PCR扩增gB基因，克隆到pGEM-T Easy载体。PCR、酶切和测序鉴定正确的重组质粒pGEM_T_gBl经Xho I与 Mlu I双酶切后，回收的gB基因插入同样处理的重组真核表达质粒pIRES-IL18的MCS A位 点上，得到真核表达质粒pIRES-gB/IL18。经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了共表 达质粒pIRES-gB/IL18。将构建成功的重组质粒pIRES_gB/IL18用脂质体法转染鸡胚成纤 维细胞，以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，经RT-PCR检测到两种目的基 因的转录；间接免疫荧光试验检测到gB蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿 色荧光，证明蛋白得到表达。本发明中采用的真核双表达载体plRES能在细胞基因组外扩增表达目的基因。 质粒PlRES含有人巨细胞病毒启动子、脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite, IRES)，IRES连接两个开放阅读框，其转录产物在翻译时，核糖体能同 时进入并开始翻译IRES上游及下游的两个转录子。本研究利用的真核双表达载体plRES 在启动子下游的MCS A的酶切位点Xho 1与Mlu I之间插入鸡传染性喉气管炎病毒HNl株 gB基因片段，在MCS B的酶切位点BamHI与Sal I之间插入鸡白介素_18基因片段，获得真 核双表达质粒pIRES-gB/IL18。避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问 题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期。该核酸疫苗免 疫机体后，表达的gB糖蛋白可刺激机体产生针对鸡传染性喉气管炎病毒的免疫保护作用， 同时表达的鸡白介素-18可以发挥明显的免疫调节，两者协同作用增强免疫效果，为ILTV 新型疫苗的研究奠定了基础。通过对鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗免疫学试验可以得出，pIRES-gB/IL18诱 导的血清抗体，都高于pIRES-gB免疫组，差异不显著(P > 0. 05)，而在诱导外周血T淋巴 细胞亚群数量上，都要优于pIRES-gB，差异显著(P < 0. 05)，这表明IL-18能增强Thl型免 疫应答。此外，在诱导T淋巴细胞亚群数量和特异性抗体上，pIRES-gB/IL18免疫组都要明 显优于pIRES-gB免疫组，表明gB基因和IL-18共表达能更加有效的刺激机体产生全面的 免疫应答。IL-18与抗原基因共表达而对免疫效果的加强作用，可能是由于共表达可以使 IL-18和抗原基因存在于同一个微环境中，从而对免疫应答反应起了促进作用。攻毒试验结果表明，鸡传染性性喉气管炎病毒DNA疫苗免疫组的试验鸡都获得了 较高的保护率，但通过攻毒后每组鸡的发病情况统计结果可以看出，pIRES-gB/IL18组的试 验鸡的发病数量少，并且发病症状较轻，恢复比较快。这些结果表明，鸡IL-18能明显地增 强DNA疫苗pIRES-gB诱导细胞免疫的作用，提高鸡传染性性喉气管炎病毒DNA疫苗的免疫 保护。pIRES-gB/IL18免疫组的保护率为93%。
图1为鸡IL-18全基因的PCR扩增；图2为plRES载体图；图3为真核共表达质粒pIRES-gB/IL18载体的构建流程图；图4为重组质粒pIRES-IL18的PCR和酶切鉴定图其中，M.DNA marker λ -EcoTHI ；1. Sail 单酶切；2. BamH I+Sall 双酶切；3.重组 质粒的PCR产物；图5为ILTV gB基因的PCR扩增结果
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其中，M.DNA Marker λ -EcoT14I ；1-2. PCR 产物；3.阴性对照；图6为重组质粒pIRES-gB/IL-18的菌液PCR扩增其中，M.DNA marker DL2000 ；1. gB 基因 PCR 产物；m. DNA Marker DL2000 ；2.鸡 IL-18基因PCR产物；3.阴性对照；图7为重组质粒pIRES_gB/IL18的PCR和酶切鉴定图其中，M.DNA marker λ -EcoT14I ； ISal I 单酶切；2. BamHI+Sal I 双酶切；3.重组 质粒的 PCR 产物；m. DNA Marker DL2000 ；图8为重组质粒pIRES_gB/IL18的酶切鉴定图其中，M.DNA marker λ -EcoT14I ；IMlu I 单酶切；2. Xho I 和 Mlu I 双酶切；图9为真核表达质粒pIRES_gB/IL18转录产物的RT-PCR检测其中，M.DNA marker λ-EcoT 14 digest ； 1. gB 引物；2. IL-18 引物；图10为间接免疫荧光检测gB基因在CEF中的表达其中，A 重组质粒pIRES_gB/IL18 ；B 阴性对照；图11为免疫后鸡外周血中⑶3+T淋巴细胞的动态变化；图12为免疫后鸡外周血中⑶4+T淋巴细胞的动态变化；图13为免疫后鸡外周血中⑶8+T淋巴细胞的动态变化；图14为免疫后各试验组鸡外周血抗ILTV血清ELISA抗体水平的动态变化(η = 5)。
具体实施例方式实施例一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点 中分别插入了 ILTV HNl株gB和ChIL-18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉 气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因。鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗的制备方法，它的步骤如下(1)设计并合成1对扩增ChIL-18的引物，上游引物Yl 为5，-GTAGGATCCATGAGCTGTGA AGAGAT-3，，下游引物Y2 为5，-TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3，，上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点(下划线部分)，预期扩增长度为 615bp ；设计并合成1对扩增ILTV gB的引物，上游引物Y3 为5，-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3，，下游引物Y4 为5，-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3，，上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点(下划线部分)，预期扩增长度为 2. 6kb ；分别以质粒pGEM-T-IL-18和pGEM_T_gB为模板，应用PCR技术，通过引物Y1/Y2 扩增ChIL-18，通过Y3/Y4扩增gB基因；通过每对引物的限制性酶切位点，把gB和ChIL-18 分别插入PlRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-gB/IL18重组质粒，该质粒经酶切、 PCR及测序鉴定；
(2)真核重组表达载体的构建将PCR产物ChIL-18，经BamHI和Sal I双酶切回收后插入真核表达载体pIRES的 MCSB位点上，得到pIRES-IL18，重组质粒pGEM-T-gBl，经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB 基因插入重组真核表达质粒PIRES-IL18的MCS A位点上，构建成重组质粒pIRES_gB/IL18， 经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES-gB/IL18 ；(3)真核重组质粒pIRES_gB/IL18的转染将构建成功的重组质粒pIRES-gB/IL18用脂质体法转染鸡胚成纤维细胞，以 RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，经RT-PCR检测到两种目的基因的转录； 间接免疫荧光试验检测到gB蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证 明蛋白得到表达。本发明中，详细实验过程如下1 材料1. 1质粒、毒株及实验动物pGEM-T Easy载体等Promega公司，鸡IL-18的克隆质粒pGEM_T-IL_18购自河 南省动物性食品安全重点实验室，ILTV HNl株gB基因的克隆质粒pGEM-T-gB购自河南省 动物性食品安全重点实验室。真核表达质粒载体PlRES购自上海捷瑞生物工程公司，质粒 pIRES-gB和ILTV HNl株购自河南省动物性食品安全重点实验室。21日龄雏鸡购自河南农 业大学种鸡场。1. 2主要试剂及仪器Premix Ex TaqDNA 聚合酶，DNA Marker λ-EcoT14I，Χ-gal 和 IPTG，限制性内切 酶Xho I、Mlu I、Sal I、BamHI等购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA Marker DL2000 购自博大泰克。DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司(V-gene) ；DNA marker DL2000和质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 T4DNA 连接酶禾口 Wizard PureFection Plasmid DNA Purification 为 Promega 公司产 品；Lipofectamine 2000Reagent 为 Invitrogen 公司产品；EZ Spin Column Total RNA Isolation Kit和AMV Single Step RT-PCR Kit均购自BBI公司。淋巴细胞分离液、邻苯 二胺(0PD)、吐温20(Tween-20)、牛血清白蛋白(BSA)等购自上海华舜生物公司，其它常规 试剂为进口或国产分析纯。流式细胞仪(BDFACSCalibur，BD Biosciences)；酶标仪(Model 680，BI0-RAD)。1. 3 抗体鸡传染性喉气管炎阳性血清购自河南省动物性食品安全重点实验室；FITC标记 的兔抗鸡IgG(二抗)为Sigma公司产品。PE标记的⑶4+和⑶8+及SPRD标记的⑶3+均购 自美国 Southern Biotech 公司。2 方法2. 1真核表达质粒pIRES-IL18载体的构建2. 1. IChIL-IS全基因目的片段引物设计与合成根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS B多克隆位点的序列和重组质粒 pGEM-T-IL-18中ChIL-18基因阅读框架，设计1对引物，上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点(下划线部分)，跨幅为615bp，上游引物位于起始密码子之前，下游引物位于终止密码子之后，两引物间包括完整的IL-18基因阅读框架(597bp)，引物本身不形成发夹结 构，2条引物间不形成二聚体。引物由上海生物工程有限公司合成。上游引物Y 1 为 5，-GTAGGATCCATGAGCTGTGAAGAGAT-3’,下游引物Y2 为 5，-TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3’。2. 1. 2ChIL-18 基因的扩增以pGEM-T-IL-18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μ L，1 μ L模板质粒，上、下游引物各1 μ L，补超纯水至50 μ L0混勻后于PCR仪 上进行扩增另设无DNA对照。扩增程序为94°C预变性5min ；然后进入94°C 40s, 56°C 30s, 72°C lmin，进行30个循环；最后72°C延伸IOmin后置4°C保存。反应结束后取5 μ L PCR产 物，以0. 8%琼脂搪凝胶电泳观察结果。2. 1. 3ChIL-18片段的酶切回收取回收的目的DNA 50μ L 于 200μ L 反应管中，加入 IOXbuffer(H) 10μ L、BamHI 5 μ L.Sal I 5 4 1^，加灭菌水至10(^1^，置371水浴中消化811。电泳切下所需的目的条带， 参照V-geneDNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。2. 1. 4真核表达载体pIRES的酶切回收取真核表达载体pIRES 30μ L于200μ L反应管中，加入10Xbuffer(H)5y L、 BamHI 2. 5 μ L.Sal I 2. 5 μ L，加灭菌水至50 μ L，置37°C水浴中消化3h。电泳切下所需的 目的条带，参照V-geneDNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回 收情况。2. 1. 5ChIL-18目的片段与真核表达载体pIRES的连接取酶切回收的IL-18目的片段7 μ L、pIRES载体1 μ L于200 μ L反应管中，加入 IOXligation buffer 1 μ L、T4DNA连接酶1 μ L，混勻后置16°C连接过夜，构建重组质粒 PIRES-IL18。2. 1.6连接产物的转化取目的片段与真核表达载体的连接产物10 μ L转化到50 μ L Ε. coli DH5 α感受 态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37°C过夜培养12-16h。挑取白色菌落， 提取真核重组表达质粒。2. 1. 7重组表达质粒pIRES-IL18的PCR及双酶切鉴定取重组表达质粒1 μ L做模板，PCR扩增体系和反应条件参照2. 1. 2进行，同时设 以PIRES载体质粒为模板的阴性对照。上述PCR扩增产物各取5 μ L进行电泳分析。取PCR扩增初步鉴定为阳性的重组质粒10 μ L，加入200 μ L反应管中，同时加入 IOXbuffer (H)lyL,BamHI IyL, Sal I 1 μ L，加灭菌水至 20 μ L，离心混合均勻，置 37°C水 浴消化3h。电泳观察酶切结果。2. 1. 8重组表达质粒pIRES-IL18的测序鉴定将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒PIRES-IL18送往宝生物工程(大连)有限 公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。2. 2真核表达质粒pIRES_gB/IL18载体的构建2.2. IgB全基因目的片段引物设计与合成根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS B多克隆位点的序列和重组质粒
8pGEM-T-gB中gB基因阅读框架，应用Primer (Version 5. 0)基因分析软件设计1对引物， 上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点(下划线部分)。该对引物扩增长度为 2. 6kb，上游引物位于起始密码子之前，下游引物位于终止密码子之后，两引物间包括完整 的gB基因阅读框架(2622bp)，引物本身不形成发夹结构，2条引物间不形成二聚体。引物 由上海生物工程有限公司合成。上游引物Y3 为5，-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3，，下游引物Y4 为5，-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3，,2. 2. 2gB全基因目的克隆应用设计的引物，以pGEM-T-gB为模板，扩增ILTV gB全基因。反应体系为25 μ L PremixEx Taq DNA聚合酶，1 μ L模板DNA，上、下游引物各1 μ L，补灭菌去离子水至50 μ L。 PCR扩增条件为94°C预变性5min，然后进入94°C lmin，54°C 50s, 72°C 3. 5min循环，进行 36个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物 的回收。回收的PCR产物按说明书方法与pGEM-T Easy Vector载体连接，构建重组质粒 pGEM-T-gB 1，转化E. coli JM109感受态细胞，挑选白色菌落接种含有Amp的LB液体培养基。 提取重组质粒进行PCR扩增、酶切及测序鉴定。2. 2. 3gB全基因片段的酶切回收取鉴定正确的重组质粒pGEM-T-gB150 yL于200yL反应管中，加入 IOXbuffer (H) 10 μ L.Mlu I 5 μ L,Xho I 5 μ L，加灭菌水至 100 μ L，置 37°C水浴中消化8h。 电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA 条带。电泳观察回收情况。2. 2. 4真核重组表达质粒pIRES-IL18的酶切回收取重组表达质粒？11 5-11^183(^1^于20(^1^反应管中，加入10\13吐€6『01)5口1^、 Mlu I 2. 5yL、Xho I 2. 5 μ L，灭菌水至50 μ L，置37°C水浴中消化3h。电泳切下所需的目 的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回 收情况。2. 2. 5gB目的片段与重组表达质粒pIRES-IL18的连接取Mlu I和Xho I双酶切的质粒pIRES/IL-181 μ L、Mlu I和Xho I双酶切回收 的gB目的片段7μ L于200μ L反应管中，加入IOXligation buffer 1 μ L、T4DNA连接酶 1 μ L，混勻后置16°C连接过夜，构建重组质粒pIRES-gB/IL18。2. 2. 6连接产物的转化取目的片段与表达质粒的连接产物IOyL转化到100 μ L E. coli DH5a感受态细 胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37°C过夜培养12-16h。2. 2. 7重组真核表达质粒pIRES_gB/IL18的PCR及双酶切鉴定取重组表达质粒各1 μ L做模板，鸡IL-18基因PCR鉴定扩增体系和反应条件参照 2. 1.2。鸡传染性喉气管炎病毒gB基因PCR鉴定扩增体系和反应条件参照2. 2.2，同时设以 PlRES质粒为模板的阴性对照。上述PCR扩增产物各取5 μ L进行电泳分析。取PCR扩增初步鉴定为阳性的重组质粒各10yL，分别加入4个200yL反 应管中，其中一管同时加入10Xbuffer(H)2y L，Mlu I 1 μ L, Xho I IyL; —管加入 10 Xbuffer (H) 2 μ L, Mlu I 1 μ L ；—管同时加入 10 Xbuffer (H) 2 μ L，BamHI 1 μ L, Sal I
91 μ L ；另一管加入10 Xbuffer (H) 2 μ L，Sail 1 μ L，都加入灭菌水至20 μ L，离心混合均勻， 置37°C水浴消化3h。电泳观察酶切结果。2. 2. 8重组表达质粒pIRES-gB/IL18的测序鉴定将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-gB/IL18送往宝生物工程(大连)有 限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。2. 3真核表达质粒的转染及表达产物的检测参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification 使用说明进行重组质粒 pIRES-gB/IL18的纯化。转染时，先用DMEM培养液洗涤已长成80%的单层鸡胚成纤维细胞 (Chicken embryofiber, CEF)，按 Lipofectamine 2000Reagent 试剂盒的使用说明进行转 染。转染细胞经37°C培养36 48h后，对其表达产物进行检测。2. 3. IRT-PCR以EZ Spin Column Total RNA Isolation Kit提取转染后48h及阴性对照的CEF 细胞总RNA，用gB和鸡IL-18基因的特异性引物，按AMV Single Step RT-PCR kit试剂盒 说明书进行RT-PCR检测。电泳检测扩增结果。2. 3. 2间接免疫荧光试验待细胞转染48h后，用O.Olmol/L PBS(pH7. 4)洗涤1次，自然干燥；用100%丙酮 固定5-lOmin，自然干燥后用PBST洗涤3次；10% BSA封闭30min，再PBST洗涤3次；用PBS 将ILTV阳性血清作1 40稀释，滴加于6孔培养板上，置湿盒内37°C lh。取出后用PBST 洗涤3遍，每次5min，再用去离子水冲洗1遍后，自然干燥；用PBS将FITC标记的兔抗鸡 IgG (二抗)稀释到工作浓度，滴加在6孔培养板上，置湿盒内37°C lh，用PBST洗涤3遍，每 次5min，再用去离子水冲洗1遍，自然干燥，在荧光显微镜下观察。2. 4鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗免疫学试验2. 4. 1真核表达质粒的制备将pIRES-gB、pIRES_gB/IL18及空载体pIRES真核表达质粒分别转化JM109菌于 LB培养基中(含氨苄青霉素50μ g/ml)大量扩增培养，参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification使用说明进行质粒的纯化，纯化后测定其浓度，适当稀释后用于动物免疫。2.4. 2动物分组免疫将1000只21日龄雏鸡随机分为4组，250只/组。其中A为pIRES-gB免疫组，B 为pIRES-gB/IL18免疫组，C为空白pIRES质粒组，D为PBS对照组。采用腿部肌肉多点注 射，2周后再加强免疫1次。2. 4. 3淋巴细胞亚群测定方法免疫前、免疫后0、1、2、3、4、5、6周，从各试验组中随机抽取4羽经翅静脉采血2mL， 柠檬酸钠抗凝，按常规方法分离淋巴细胞，用PBS溶液将细胞数调至5. OX IO6Hir1。一管加 入鼠抗鸡CD3-SPRD、CD4-PE单克隆抗体各10 μ L，另一管加入CD3-SPRD、CD8-PE单克隆抗 体各10 μ L，相应对照管加入鼠抗人IgG-FITC、IgG-PE单克隆抗体各10 μ L，再分别加入淋 巴细胞悬液50 μ L，混勻，4°C避光作用20min。加入PBS溶液500 μ L，混勻，室温避光作用 IOmin0重悬细胞，流式细胞仪检测。2. 4. 4ELISA抗体效价的测定
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免疫前、免疫后0、1、2、3、4、5、6周，从各试验组中随机抽取5羽经翅静脉采血， 37°C放置lh，然后置4°C冰箱过夜，分离血清，56°C灭活30min，-20°C保存备用。抗IBV血 清ELISA抗体效价的测定采用间接ELISA方法，按常规步骤进行。2. 4. 5攻毒保护试验各组试验鸡于二免疫后第3周，每组选取15只应用ILTV HNl株强毒通过口、鼻途 径进行攻击，IOOELD5tl/羽。攻毒后观察各组试验鸡群的发病、死亡情况，连续观察14d后全 部扑杀，取喉气管组织用常规的PCR进行病毒的检测，并计算攻毒保护率。2. 4. 6数据处理用SPSS11.5 for Windows及Microsoft Excel统计软件将所得的数据进行统计 学处理，计算其平均值。3结果与分析3. 1重组表达质粒pIRES-IL18的构建与鉴定3. 1. 1鸡IL-18基因的扩增利用特异性引物，采用PCR技术，从重组载体pGEM-T-IL-18质粒为模板中扩增出 约600bp的片段，与预期增片段大小吻合，如图1所示。3. 1. 2真核表达质粒pIRES-IL18的构建将扩增的鸡白细胞介素-18基因与真核表达载体pIRES(如图2所示)分别经用 BamH I和Sal I双酶切后连接，构建重组表达质粒pIRES_IL18。重组表达质粒的构建路线 如图3所示。3. 1. 3真核表达质粒pIRES-IL18的酶切和PCR鉴定提取重组质粒PIRES-IL18，进行PCR扩增，扩增出了 1条0. 6kb左右的目的条带， 经BamHI和Sal I双酶切后，出现了 2条带，其中1条带为载体条带，位置约为6100bp，另1 条为插入的目的条带，位置约为600bp，经SalI单酶切只切出了 1条约6700bp的条带，与预 期结果相符，如图4所示。3. 1. 4重组表达质粒pIRES-IL18的序列鉴定及分析将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-IL18送往宝生物工程(大连)有限 公司进行序列测定，结果显示，插入的鸡IL-18基因核苷酸序列为597bp，包含一个完整的 开放阅读框，编码198个氨基酸，与重组质粒pGEM-T-IL18中鸡IL-18基因核苷酸序列完全 一致。证明重组质粒PIRES-IL18中插入了鸡IL-18基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。3. 2真核表达质粒pIRES_gB/IL18载体的构建与鉴定3. 2. IILTV gB基因的扩增、克隆及鉴定利用特异性引物，以pGEM-T-gB作为模板，利用PCR技术扩增出gB基因。产物经 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测，在约2. 6kb处有1条清晰带，与预期结果相符，如图5所示。回收的PCR产物按说明书方法与pGEM-T Easy Vector载体连接，构建重组质粒 pGEM-T-gB 1，转化E. coli JM109感受态细胞，挑选白色菌落接种含有Amp的LB液体培养基。 经PCR扩增、酶切鉴定正确的重组质粒pGEM-T-gBl进行测序测定，结果显示插入的gB基因 核苷酸序列为2642bp，包含一个完整的开放阅读框(2622bp)，编码873个氨基酸，与重组质 粒pGEM-T-gB中gB基因核苷酸序列完全一致。证明重组质粒pGEM-T-gBl中插入了 gB基 因的核苷酸序列及阅读框完全正确。
3. 2. 2 重组质粒 pIRES_gB/IL18 的构建重组质粒pGEM-T-gBl经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB基因与Mlu I和Xho I双酶切回收的真核重组表达质粒PIRES-IL18进行连接，构建重组表达质粒pIRES-gB/ IL18，重组表达质粒的构建路线如图3所示。3. 2. 3重组质粒pIRES_gB/IL18的菌液PCR扩增利用ILTV gB基因和鸡IL-18基因的特异性引物，采用PCR技术，以重组载体 pIRES-gB/IL18质粒为模板，分别进行PCR扩增，电泳结果在约2. 6kb和0. 6kb处出现特异 性条带，与预期两条扩增片段大小吻合，如图6所示。3. 2. 4真核表达质粒pIRES_gB/IL18的酶切鉴定重组质粒pIRES-gB/IL18经BamHI和Sal I双酶切后，出现了 2条带，其中1条带 为载体条带，位置约为8. 7kb，另1条为插入的目的条带(ChIL-18)，位置约为0. 6kb，经Sal I单酶切只切出了 1条9. 3kb的条带，应用扩增鸡IL-18的特异引物，以重组质粒为模板进 行PCR扩增、电泳，出现1条约0. 6kb的特异性条带，如图7所示，与预期结果相符；重组质 粒pIRES-gB/IL18经Xho I和Mlu I双酶切后，得到约2. 6kb和6. 7kb的2条带，用Mlu I 单酶切得到1条约9. 3kb的带，如图8所示，与预期结果相一致。3. 2. 5重组表达质粒pIRES_gB/IL18的序列鉴定及分析将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-gB/IL18送往宝生物工程(大连)有 限公司，进行序列测定，结果所测序列与重组质粒pGEM-T-gB中gB基因核苷酸序列相一致。 证明重组质粒pIRES-gB/IL18中插入了 gB基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。3. 3真核表达质粒pIRES_gB/IL18转染后转录产物的鉴定3. 3. IRT-RT 检测结果表明，转染pIRES-gB/IL18的细胞中均能扩增出特异的gB和鸡IL-18基因片 段，如图9所示，而以未转染重组质粒的CEF细胞总RNA为模板进行PCR扩增时则没有相应 的片段。3. 3. 2间接免疫荧光检测转染细胞48h后，转染了真核表达质粒pIRES_gB/IL18的CEF细胞显示出黄绿色 荧光，而转染PlRES的细胞没有显示出任何特异荧光，如图10所示，表明构建的真核表达质 粒pIRES-gB/IL18能在细胞中表达ILTV gB糖蛋白。3. 4鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗免疫学试验3. 4. 1⑶3+T淋巴细胞亚群数量的动态变化如图11所示，首次免疫后第7d，pIRES-gB和pIRES_gB/IL18组的外周血CD3+T淋 巴细胞百分比显著高于PlRES和PBS水对照组(P < 0. 05)。ILTV疫苗组免疫后第7d迅速 升高。在整个试验过程中，pIRES-gB/IL18组都高于pIRES-gB组，免疫后14、28d时差异极 显著(P < 0.01), 35、42d 差异显著(P < 0. 05)。3. 4. 2⑶4+T淋巴细胞亚群数量的动态变化如图12所示，所有疫苗组的外周血⑶4+T淋巴细胞百分比在免疫后迅速升高。二 免后所有疫苗组⑶4+T淋巴细胞百分比显著升高，攻毒后继续上升。pIRES-gB和pIRES-gB/ IL18组一直高于空载体pIRES和PBS对照组，其中pIRES_gB/IL18组都高于pIRES-gB组， 差异显著(P < 0. 05)。
3. 4. 3⑶8+T淋巴细胞亚群数量的动态变化如图13所示，所有疫苗组在免疫7d后⑶8+T淋巴细胞都明显的升高，都高于对 照组及空载体组。二免后所有疫苗组⑶8+T淋巴细胞百分比迅速升高，攻毒后继续上升。 pIRES-gB/IL18 组一直高于 pIRES-gB 组，差异显著(P < 0. 05)。3. 4. 4ELISA抗体效价的测定如图14所示，各疫苗组在免疫后7d开始出现抗体，随着免疫时间的延长，其抗体 水平逐渐增加。二免后其抗体水平稍有下降，然后逐渐升高。ILTV疫苗组免疫后第7d抗体 水平达到较高水平。各疫苗组在整个检测过程中都高于对照组，其中pIRES-gB/IL18组高 于pIRES-gB，差异不显著(P > 0. 05)。表明鸡IL-18在提高鸡传染性喉气管病毒基因疫苗 pIRES-gB抗体水平方面差异不显著。3. 4. 5攻毒保护各组试验鸡于二免疫后第3周，用ILTV强毒进行攻击。攻毒后每组鸡发病、死亡 及保护情况的统计见表1和表2。各组均有不同程度的鸡只死亡，解剖后均具有典型的ILT 病变，保护率13% 93%。对攻毒后14d扑杀的鸡只，取喉气管组织进行病毒的PCR检测， 所有疫苗组均有不同数量的鸡只在喉气管组织中检测到IBV。其中pIRES-gB/IL18免疫组 保护率为93%，要高于pIRES-gB组(80%)。表1 ILTV願1株攻毒后每组鸡的发病情况统计
权利要求
一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，其特征在于在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了ILTV HN1株gB和ChIL 18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB蛋白和鸡IL 18蛋白。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗的制备方法，其特征在于它 的步骤如下(1)设计并合成1对扩增ChIL-18的引物，上游引物 Yl 为5’ -GTAGGATCCATGAGCTGTGA AGAGAT-3，， 下游引物 Y2 为5’ -TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3，， 上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点，预期扩增长度为615bp ； 设计并合成1对扩增ILTV gB的引物， 上游引物 Y3 为5’ -GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3，， 下游引物 Y4 为5，-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3’， 上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，预期扩增长度为2. 6kb; 分别以质粒pGEM-T-IL-18和pGEM_T-gB为模板，应用PCR技术，通过引物Y1/Y2扩增 ChIL-18，通过Y3/Y4扩增gB基因；通过每对引物的限制性酶切位点，把gB和ChIL-18分别 插入PlRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-gB/IL18重组质粒；(2)真核重组表达载体的构建将PCR产物ChIL-18，经BamHI和Sal I双酶切回收后插入真核表达载体pIRES的MCSB 位点上，得到PIRES-IL18，重组质粒pGEM-T-gBl，经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB基因 插入重组真核表达质粒PIRES-IL18的MCS A位点上，构建成重组质粒pIRES_gB/IL18，制成 鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了ILTV HN1株gB和ChIL-18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因。本发明采用的真核双表达载体pIRES在启动子下游的MCS A和MCS B的多克隆酶切位点分别插入鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因片段和鸡白介素-18基因片段，获得真核双表达质粒pIRES-gB/IL18。避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期，为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。
文档编号C12N15/79GK101972482SQ20101022865
公开日2011年2月16日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者刘金朋, 崔保安, 朱前磊, 王子馨, 王淑娟, 邵攀峰, 钞安军, 陈红英, 魏战勇 申请人:河南农业大学