专利名称：新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因重组融合蛋白及其DNA编码序列，尤其涉及人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和人单核细胞趋化激活因子(hMCAF)的融合蛋白及其DNA编码序列。
hGM-CSF与hMCAF都具有提高人体免疫能力及杀伤某些肿瘤的作用，并且两种因子都可通过激活单核细胞来杀伤肿瘤。目前，两种因子已分别通过基因重组技术获得了表达，而某种细胞因子单独用于临床治疗，往往存在以下不足，即缺乏特异性、应用剂量较大和易引起较大的毒副作用。由基因重组技术重组的hGM-CSF与hIL-3的融合蛋白存在着特异性不强的缺点(Curtis，B.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，885809)。
本发明的目的在于提供一种hGM-CSF与具有趋化作用的hMCAF的融合蛋白，该融合蛋白具有协同或增强的生物功能，且能特异趋化单核细胞到病灶部位，从而可能降低临床治疗的使用剂量，减小毒副作用。
本发明的目的可以通过以下方案得以实现。
分别合成含有hGM-CSF及hMCAF的DNA片段，由于引物序列设计的不同，所以两种因子的基因片段在进行连接时，产生两种排列顺序的连接反应物，其中一种连接反应物的排列顺序为hGM-CSF/MCAF；另一种连接反应物的排列顺序为hMCAF/GM-CSF。分别构建含有hGM-CSF/MCAF连接反应物或含有hMCAF/GM-CSF连接反应物的表达载体，将两种表达载体分别转到受体菌或受体细胞中，得到能够表达目的基因的重组菌或重组细胞，经培养表达，可分别得到两种排列顺序的新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF，培养产物进行表达水平测定、提取、纯化、复性，所得到的纯品分别进行MCAF的趋化特异性、GM-CSF的生物活性的测定，并且进行体内外抗肿瘤试验。本发明涉及真核或原核系统表达的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白及其DNA编码序列、引物DNA序列、表达载体、受体细胞或受体菌，还涉及有关生产的方法。
本发明所提供的新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的融合蛋白具有协同或增强的生物功能，由于hMCAF的趋化作用，使该融合蛋白具有较强的特异性，为降低临床治疗的使用剂量、减小毒副作用打下了良好基础。
图1、图2分别为PCR扩增hGM-CSF基因的上游引物序列；图3、图4分别为PCR扩增hGM-CSF基因的下游引物序列；图5、图6分别为PCR扩增hMCAF基因的上游引物序列；图7、图8分别为PCR扩增hMCAF基因的下游引物序列；图9为融合蛋白hGM-CSF/MCAF的DNA编码序列图10为融合蛋白hMCAF/GM-CSF的DNA编码序列；hGM-CSF/MCAF融合蛋白表达质粒的构建利用PCR技术扩增hGM-CSF基因的上游引物序列(图1)及下游引物序列(图3)分别含有EcoRI及XbaI位点。提取质粒pCD-hGM-CSF(Lee，F.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，824360)，并以其为模板，以上述合成的上、下游引物序列为引物，经PCR反应扩增出长约400bp的含hGM-CSF基因的DNA片段。同样利用PCR技术扩增hMCAF的上游引物序列(图5)以及下游引物序列(图7)分别含有XbaI及BamHI位点，下游引物序列还含有双串联终止密码子。提取质粒pMCOl(叶棋浓等，中华微生物学与免疫学杂志，1994，1429)，并以其为模板，以上述合成的两引物序列为引物，经PCR反应扩增出长约250bp的含MCAF基因的DNA片段。电泳回收上述PCR合成的hGM-CSF及hMCAF基因的DNA片段(Sambrook、J.et al，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，含hGM-CSF基因的DNA片段以EcoRI和XbaI进行酶切，含hMCAF基因的DNA片段以XbaI和BamHI酶切，选择质粒载体pBV220(张智清等，病毒学报，1990，6111)，并以EcoRI和BamHI酶切，将酶切后的含hGM-CSF和hMCAF基因的DNA片段及酶切后的pBV220进行连接反应，连接反应物转化E.coli DH5α。转化子经用hGM-CSF基因和hMCAF基因作探针进行菌落原位杂位筛选、DNA酶切鉴定后得到欲表达hGM-CSF/MCAF的重组质粒，命名为pGM。以双链重组质粒pGM为模板，按PharmaciaT7 Sequencing kit说明书测定hGM-CSF/MCAF的编码序列(图9)，其中hGM-CSF编码序列与hMCAF编码序列间的接头序列为GGTGGTTCTAGA。
hMCAF/GM-CSF融合蛋白表达质粒的构建利用PCR技术扩增hGM-CSF基因的上游引物序列(图2)及下游引物序列(图4)分别含有XbaI及BamHI酶切位点。提取质粒pCD-hGM-CSF，并以其为模板，以上述合成的上、下游引物序列为引物，经PCR反应扩增出长约400bp的含hGM-CSF基因的DNA片段。同样利用PCR技术扩增hMCAF基因的上游引物序列(图6)及下游引物序列(图8)分别含有EcoRI及XbaI酶切位点，提取质粒pMC01，并以其为模板，以上述合成的上、下游引物序列为引物，经PCR反应扩增出长约250bp的含hMCAF基因的DNA片段。电泳回收上述PCR合成的hGM-CSF及hMCAF基因的DNA片段，含hGM-CSF基因的DNA片段以XbaI和BamHI进行酶切，含hMCAF基因的DNA片段以EcoRI和XbaI进行酶切，选择质粒载体pBV220，并以EcoRI和BamHI酶切。将酶切后的含hGM-CSF及hMCAF基因的DNA片段和经酶切的pBV220进行连接反应，连接反应物转化E.coli DH5α，转化子经用hGM-CSF基因和hMCAF基因作探针进行菌落原位杂位筛选、DNA酶切鉴定后得到欲表达hMCAF/GM-CSF的重组质粒，命名为pMG。以双链重组质粒pMG为模板，按Pharmacia T7 Sequencing kit说明书测定hMCAF/GM-CSF的编码序列(图10)，其中hMCAF编码序列与hGM-CSF编码序列间的接头序列为GGTGGTTCTAGA。
表达hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的菌株的构建将E.coli DH5α培养到对数生长期，冰浴10min，离心后将细胞重悬在原初培养物体积一半的预冷的50mM CaCl2和10mM Tris·Cl溶液中，冰浴15min后离心，将细胞重悬在1/15原初体积的预冷的50mM CaCl2和10mM Tris·Cl溶液中，按0.2ml一份分装在预冷的小管中，作为感受态细胞，向上述小管中加入重组质粒pGM或pMG，冰浴30min，转移到预热至42℃的水浴中2min，然后加1.0ml LB培养基，在30℃保温30℃min，取上述细胞涂布在琼脂培养板上，30℃过夜培养即产生转化子，转化子即为能表达hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的重组菌株。
新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF在受体菌中的培养表达。
将含有pGM的重组菌或含pMG的重组菌分别进行培养，培养方法及条件如下重组菌于30℃振荡培养繁殖，于42℃诱导表达。离心收集菌体，用1XSDS样品缓冲液悬浮(Sambrook，J.et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，煮沸5min，离心取上清进行SDS-PAGE分析，结果表明含有pGM的重组菌表达出分子量约为26kD的hGM-CSF/MCAF融合蛋白，含有pMG的重组菌表达出分子量约为26kD的hMCAF/GM-CSF融合蛋白。经薄层扫描分析，hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF的表达水平分别为33.4％和15.6％。
新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF的分离纯化。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF在大肠杆菌中以包涵体形式存在，经培养表达的重组菌离心收集后，超声破碎，沉淀即为包涵体，用含2mol/L尿素的50mmol/L Tris·Cl、1mmol/L EDTA溶液洗涤，离心取沉淀，沉淀用6mol/L盐酸胍、20mmol/L Tris·Cl、1mmol/LEDTA、5mmol/L DTT的溶液溶解，用20mmol/L Tris·Cl、lmmol/L EDTA、2mmol/L GSH、0.2mmol/L GSSG透析复性。透析产物上样到用20mmol/L Tris·HCl、1mmol/L EDTA平衡的SephadexG-75层析柱(2×60cm)中，上样后用上述溶液洗脱，流速为12ml/h，收集所需组分，用20mmol/L NaAc、1mmol/L EDTA透析后，上样到CM-Sepharose FF层析柱(1.5×20)中，用含0-0.5mol/L NaCl的起始缓冲液样度洗脱，hGM-CSF/MCAF约在0.18mol/L NaCl时被洗脱。
纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE分析，结果表明纯度达到电泳纯。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的Western blot鉴定。
纯化的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF进行SDS-PAGE后，将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，然后用3％BSA封闭1h，再与GM-CSF抗体或MCAF抗体反应1-2h，与HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG反应1h，用DAB显色。结果表明，纯化的hGM-CSF/MCAF和hMCAF/GM-CSF既能与GM-CSF抗体又能与MCAF抗体发生特异反应。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的生物学活性测定采用以下方法分别测定hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的生物学活性，选用hGM-CSF依赖的细胞株TF1，以MTT染料掺入法测定GM-CSF活性。(Kitamura T et al.，J.Cell physiol.，1989，140323)。调整传代培养的TF1细胞浓度为2×105/ml，取100μl加到96孔细胞培养板上，再加入按一定比例稀释的样品，置37℃ 5％CO2孵箱中培养48h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)染料，继续培养4h，加入100μl裂解液(20％SDS，50％二甲基甲酰胺)，37℃过夜，在酶联仪上测定OD490值，经过与标准品比较，测得纯化的hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF融合蛋白的比活性约为1.8×107u/mg。
纯化的hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF的MCAF单核细胞趋化活性采用琼脂糖平板法进行测定(Nelson，R.D.et al.，J.Immunol.，1975，1151650)，人外周血单个核细胞的分离按杨景山等的方法进行(杨景山等，医学细胞化学与细胞生物技术，1989，6)。取1.8％琼脂糖与等体积的含小牛血清的2×RPMI 1640培养基混匀，浇注于灭菌平皿内的载玻片上，凝固后用孔径为2mm的打孔器打孔，每列分上、中、下三孔，取10μl单个核细胞悬液(含1×106细胞)加入中孔，上孔加10μl按一定比例稀释的样品，下孔加10μl RPMI 1640，在CO2孵箱中温育12-14h，用甲醇固定30min，细心剥除琼脂糖凝胶，Giemsa染色镜检，测得hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF融合蛋白表现出趋化活性的最小浓度为40ng/ml。
以上结果说明，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF中GM-CSF和MCAF的功能不但相容，而且都具有较高的生物学活性。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的体内外抗肿瘤试验取传代培养的肿瘤细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，取100μl加到96孔细胞培养板上，再加入按一定比例稀释的样品，培养板于37℃、5％CO2孵箱中培养3天，观察纯化的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF分别对人早幼粒细胞白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、黑色素瘤Bowes和胃癌Kato3细胞株的直接毒性，结果表明，在浓度为0.002-20ng/ml范围内，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF不能直接杀伤上述这些肿瘤细胞。鉴于此，我们又测定了hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF介导单核细胞杀伤肿瘤细胞的能力(Matsushima，K.et al.，J.Exp.Med，1989，1691485)。从人外周血白细胞悬液分离单个核细胞后，将细胞浓度调整为3-5×106/ml，取100μl加到96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2中培养1h，洗去非贴壁细胞，换用新鲜培养基，用按一定比例稀释的样品刺激单核细胞12h后，加入肿瘤细胞100μl，于37℃5％CO2孵箱中培养。结果表明，在一定浓度范围内(0.002-2ng/ml)，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF能介导单核细胞杀伤肿瘤细胞，且杀伤率随浓度的增加而增加。hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF对HL-60、A549的杀伤率比单用相同剂量的GM-CSF、MCAF或联合使用GM-CSF和MCAF具有更大的杀伤率(p＜0.01)。hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF对SMMC-7721，Bowes有一定杀伤率，但没有表现出上述增强功能，另外，它对Kato3似乎没有杀伤效应。
上述结果表明，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF中GM-CSF和MCAF具有协同或增强功能，激活单核细胞后可选择性杀伤肿瘤细胞。
以裸鼠为实验模型，我们研究了hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF体内抗肿瘤效应。裸鼠背部皮下注射1×106的肺癌细胞A549，4天后实验组在注射肿瘤细胞周围分别注射1μg和0.1μg纯化的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/hGM-CSF，每天一次，连续5天，对照组为注射生理盐水，结果表明(两只动物的结果)，对照组两只均长出较大肿瘤，1μg的实验组二只未长出肿瘤，0.1μg的实验组两只均长出较小肿瘤，由此可以看出，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF在体内也有一定程度的抗肿瘤作用，提示hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF有较大的应用前景。
权利要求
1.一种用于表达新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列，其特征在于所述融合蛋白的DNA序列同时含有人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和人单核细胞趋化激活因子的基因序列。
2.根据权利要求1所述的用于表达新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列，其特征在于所述融合蛋白的DNA序列如图9或图10所示。
3.一种DNA序列，其特征在于该DNA序列与权利要求1或权利要求2所述的用于表达新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列互补。
4.一种用于合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的上游引物DNA序列，其特征在于该上游引物序列具有如下DNA序列(如图1或图2所示)。
5.一种用于合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的下游引物DNA序列，其特征在于该下游引物序列具有如下DNA序列(如图3或图4所示)。
6.一种用于合成人单核细胞趋化激活因子的上游引物DNA序列，其特征在于该上游引物DNA序列具有如下DNA序列(如图5或图6所示)。
7.一种用于合成人单核细胞趋化激活因子的下游引物DNA序列，其特征在于该下游引物DNA序列具有如下DNA序列(如图7或图8所示)。
8.一种表达载体，其特征在于该表达载体含有如权利要求1所述的用于表达新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于该表达载体含有如权利要求2所述的用于表达新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于该表达载体含有质粒载体pBV220。
11.一种转化菌，其特征在于该转化菌含有如权利要求8所述的表达载体。
12.根据权利要求11所述的转化菌，其特征在于该转化菌含有如权利要求9所述的表达载体。
13.根据权利要求12所述的转化菌，其特征在于该转化菌含有如权利要求10所述的表达载体。
14.根据权利要求13所述的转化菌，其特征在于该转化菌由E.coli DH5α构建而成。
15.一种生产新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括如权利要求9所述的表达载体的构建、权利要求12所述的转化菌的构建、培养表达及表达产物的提纯、复性及生物活性的测定。
16.一种新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是按照权利要求15所述的生产新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的方法得到的目的基因产物。
全文摘要
本发明涉及新型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的融合蛋白及其DNA编码序列。该融合蛋白为人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)与人单核细胞趋化激活因子(hMCAF)的融合蛋白，其中包括两种排列顺序的融合蛋白，即为hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF。研究结果表明，本发明所涉及的融合蛋白的生物活性较高，具有协同或增强的生物功能，并且由于单核细胞趋化激活因子的趋化作用，提高了对人单核细胞发挥功能的特异性，这为将来减小临床用药剂量，减轻毒副作用打下了良好的基础。
文档编号C12N15/62GK1144845SQ95101538
公开日1997年3月12日 申请日期1995年3月1日 优先权日1995年3月1日
发明者叶棋浓, 苏国富, 黄翠芬 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所