ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法

ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法
【专利摘要】本发明提供了一种ddPCR技术监测伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼继发耐药的方法，及其在监控伊马替尼(格列卫)/尼罗替尼治疗慢性粒细胞白血病过程中的应用。本发明首先对慢性粒细胞白血病患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中ABL基因的耐药突变位点T315I，或PDGFRα基因的耐药突变位点T674I的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。
【专利说明】
ddPCR技术监测伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼继发耐药的 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医学和生物技术领域，具体地涉及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技 术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆中ABL基因或roGFR α基因位点突变的方法，及其在监 控慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生继发性耐药等方面的应用。
【背景技术】
[0002] 慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML)是一种起源于造血干 细胞的恶性增殖性疾病，以9号和22号染色体异位形成费城染色体（Ph)为特征，该异位 形成一种新的BCR-ABL融合基因，此基因编码的融合型蛋白能导致髓系造血的异常克隆性 增殖。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI)的出现是CML治疗史上的一 座里程碑，目前TKI成为新诊断的CML慢性期（CML-CP)患者的标准治疗方案。
[0003] 伊马替尼（imatinib)通过竞争性地与BCR-ABL激酶上的ATP结合位点结合，抑 制其酪氨酸激酶活性，阻断激酶自身磷酸化及底物磷酸化水平，从而特异性地抑制BCR-ABL 阳性细胞增生并诱导其凋亡，是首个成功治疗靶向抑制BCR-ABL的TKI，目前已成为CML患 者的一线治疗方案，取得了良好的疗效，已经在许多国家得到越来越广泛的应用。大多数 CML慢性期患者对伊马替尼有着显著的血液学和细胞遗传学缓解。但随着伊马替尼广泛的 应用，临床上出现的耐药病例逐渐增多。
[0004] 绝大部分的伊马替尼耐药是由于BCR-ABL激酶位点突变造成的，该位点变异可能 破坏伊马替尼和BCR-ABL的联系或者使激酶失去其非活性构象，进而导致下游有害的信号 转导和细胞恶性克隆增生。突变主要分布在BCR-ABL激酶的如下4个簇：P-环簇、T315近 侧簇、酶促反应簇和A-环簇，其中在P-环和T315I的突变作用最强，可完全阻断伊马替尼 与ATP的结合。另外，BCR-ABL融合基因的扩增和过度表达导致酪氨酸激酶活性更强，使原 有剂量的伊马替尼不足以控制。耐药可直接导致治疗失败，大大降低了伊马替尼的利用价 值。因此，对于BCR-ABL激酶位点突变进行实时监测，能够有效地指导CML患者用药。然而 传统的需要以肿瘤组织的基因组DNA为模板，这为患者在治疗过程中的多次检测和实时监 控带来了困难。
[0005] 血浆游离DNA (cfDNA)含有循环肿瘤DNA (ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定 性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控 肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。
[0006] 研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片 段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。
[0007] 然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高 效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段（如测序、数字PCR)，仍难以准 确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠 癌患者中循环游离DNA的平均含量（4771ng/ml)与健康人的平均含量（0.85ng/ml)存在显 著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原（CEA)的检测只有47%检测结果对诊断有意义。
[0008] 因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令 人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。
[0009] 综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可 靠性地检测患者中肿瘤相关突变（如ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变）的方法。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的是提供一种能够用非肿瘤组织（如血液或血浆样品）检测患者ABL 基因 T315I，或TOGFRa基因 T674I突变的方法。
[0011] 本发明的第一方面，提供了一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，所述方法 包括步骤：
[0012] (1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；
[0013] (2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其 中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于 30ng/微升的提取液；
[0014] (3)以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR (ddPCR)，从而获 得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和
[0015] (4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比 例；
[0016] 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或TOGFRa基因。
[0017] 在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或TOGFRa T674I。
[0018] 在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。
[0019] 在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本。
[0020] 在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。
[0021] 在另一优选例中，所述的预处理包括：
[0022] (a)将采集的外周血至于非肝素的抗凝管（如EDTA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝 管））中；
[0023] (b)经一级离心处理，去除沉淀，分离获得液相（血浆）；
[0024] (c)对上一步骤的获得的液相进行二级离心，去除沉淀，分离获得液相作为用于提 取DNA的检测样本。
[0025] 在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：
[0026] (b~i)2000-5000rmp ；
[0027] (b-ii)离心约 1-15 分钟；
[0028] (b-i i i)温度 0-8°C，较佳地 4 ± 2°C。
[0029] 在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：
[0030] (c-i) 10000-15000rmp ；
[0031] (c-ii)离心约 5-30 分钟；
[0032] (c-i i i)温度 0-8°C，较佳地 4 ± 2°C。
[0033] 在另一优选例中，在步骤（3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~ lOOngo
[0034] 在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。
[0035] 在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突 变位点的探针。
[0036] 在另一优选例中，ddPCR中所用的PCR扩增引物对为包含ABL T315I或TOGFRa T674I突变位点的特异引物对。
[0037] 在另一优选例中，所述的扩增引物对为用于扩增选自下组的位点的特异引物对： ABL T315I 突变型、ABL T315I 野生型、PDGFRa T674I 突变型、PDGFRaT674I 野生型。
[0038] 在另一优选例中，所述用于扩增ABL T315I的特异引物对的序列如SEQ ID N0:3 和 SEQ ID NO :4 所示。
[0039] 在另一优选例中，所述用于扩增ABL T315I的特异引物对的序列如SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO :8 所示。
[0040] 在另一优选例中，所述用于扩增roGFRa T674I的特异引物对的序列如SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示。
[0041] 在另一优选例中，所述用于扩增、TOGFRa T674I的特异引物对的序列如SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 所示。
[0042] 在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生 型特异探针。
[0043] 在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；
[0044] 或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。
[0045] 在另一优选例中，所述的ABL T315I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0046] 在另一优选例中，所述的ABL T315I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0047] 在另一优选例中，所述的ABL T315I野生型HEX探针的序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0048] 在另一优选例中，所述的ABL T315I野生型HEX探针的序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0049] 在另一优选例中，所述的TOGFR a T674I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO:9 所示。
[0050] 在另一优选例中，所述的TOGFR a T674I突变型FAM探针的序列如SEQ ID NO: 13 所示。
[0051] 在另一优选例中，所述的TOGFRa T674I野生型HEX探针的序列如SEQ ID NO: 10 所示。
[0052] 在另一优选例中，所述的TOGFRa T674I野生型HEX探针的序列如SEQ ID NO: 14 所示。
[0053] 在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50~100ng， 2XddPCR SuperMix for Probes(Bio_Rad Laboratories) 10 μ 1，ABL T315I 或 PDGFRa T674I的特异引物对（9 μ M)及探针（5 μ M)各2 μ 1。
[0054] 在另一优选例中，所述的样本来自于慢性粒细胞白血病患者。
[0055] 在另一优选例中，在所述步骤（2)中，所述的抽提处理包括步骤：
[0056] (2a)将血浆样本，用蛋白酶Κ进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；
[0057] 在另一优选例中，蛋白酶K的加入量为200 μ g/100微升检测样本。
[0058] 在另一优选例中，（2a)中还包括：在消化结束后，对蛋白酶K进行灭活。
[0059] (2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合 液；
[0060] 在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0. lng/100微升检测样本。
[0061] 在另一优选例中，步骤（2b)的放置时间为5-10分钟。
[0062] (2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得 吸附有DNA的固相载体；
[0063] (2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱 液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
[0064] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量为20-100ng/微升；和 /或所述含洗脱DNA的洗脱液的体积为20-100微升。
[0065] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的大小为100-250bp， 更佳地为150-200bp。
[0066] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占 DNA总量的 80-100 %，较佳地 90-100 %。
[0067] 在另一优选例中，所述的固相载体为娃膜。
[0068] 在另一优选例中，所述的洗脱包括:AVE洗脱。
[0069] 在另一优选例中，在步骤（2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的 片段大小。
[0070] 本发明的第二方面，提供了一种基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0071] (a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物 对；
[0072] (b)RNA carrier ；
[0073] (c)使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法，
[0074] 其中，所述的突变位点包括ABL T315I，或TOGFRa T674I。
[0075] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括：
[0076] (d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。
[0077] 在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生 型特异探针。
[0078] 在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4中所示。
[0079] 在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
[0080] 在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示。
[0081] 在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示。
[0082] 在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示， 且所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；
[0083] 或所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 13所示，且所述的野生 型探针的序列如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 14所示。
[0084] 在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；
[0085] 或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。
[0086] 本发明的第三方面，提供了一种基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0087] (a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物 对；
[0088] (b)RNA carrier ；
[0089] (c)使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方 法；
[0090] (d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的 用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；
[0091] 其中，所述引物对的序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4中所示，或所述引物对的 序列如 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID N0:12 所示；
[0092] 所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:5所示，且所述的野生型 探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；
[0093] 或所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 13所示，且所述的野生 型探针的序列如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 14所示；
[0094] 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或TOGFRa T674I。
[0095] 在另一优选例中，所述的第一容器内还含有用于特异性扩增野生型位点的特异引 物对，且所述的引物对的序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示；或所述的引物对的序列 如 SEQ ID N0:15 和 SEQ ID N0:16 所示。
[0096] 在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；
[0097] 或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。
[0098] 本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面或本发明第三方面所述的试剂 盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿 瘤患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适 合使用或继续使用伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼进行治疗的试剂盒。
[0099] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者包括慢性粒细胞白血病患者。
[0100] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者为人。
[0101] 在另一优选例中，所述是检测包括在给予伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼之前、之 中、或之后进行检测。
[0102] 本发明的第五方面，提供了一种肿瘤患者伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性的 检测方法，所述方法包括步骤：用如本发明第一方面所述的方法进行基因耐药突变位点检 测；和
[0103] 若检测结果为阳性，则判定患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药；若检测结 果为阴性，则判定患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼敏感；
[0104] 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或TOGFRa T674I。
[0105] 在另一优选例中，所述的肿瘤为慢性粒细胞白血病。
[0106] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性为伊马替 尼（格列卫）/尼罗替尼继发性耐药。
[0107] 本发明的第六方面，提供了一种肿瘤患者治疗方法，包括步骤：
[0108] (a)用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象进行基因耐药突变位点检测，并 对检测结果为阴性的对象，采用伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼进行治疗；
[0109] (b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如本发明第一方面所述的方法，对所 述对象再次进行基因耐药突变位点检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用伊马替尼 (格列卫）/尼罗替尼进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用伊马替尼（格列 卫）/尼罗替尼进行治疗；
[0110] 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或roGFRa T674I。
[0111] 在另一优选例中，在步骤（b)中还包括：记录首次检测到ABL T315I，或H)GFRa T674I突变阳性的时间。
[0112] 在另一优选例中，所述的治疗周期为3-6周。
[0113] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0114] 图1是ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果显示。图中蓝色代表微滴中只含有突变 型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中 既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵 坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中图1A显示了 H)GFRa (T674I)突变阳性的检测结果，图（1B)显示了 ABL(T315I)突变阳性的检测结果， 图（1C)显示了 H)GFRa (T674I)突变阴性的检测结果，图1D显示了 ABL(T315I)突变阴性 的检测结果。
[0115] 图2是ddPCR仪微滴数目结果显示。图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数， 蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表 荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示了 H)GFRa (T674I)突变阳性的检测 结果，图2B显示了 ABL(T315I)突变阳性的检测结果，图2C显示了 H)GFRa (T674I)突变阴 性的检测结果，图2D显示了 ABL(T315I)突变阴性的检测结果。
[0116] 图3为实施例中的血浆游离DNA跑胶图。
【具体实施方式】
[0117] 本发明人经过长期而深入的研究，通过对于大量方法和试剂的筛选，意外地发现， 通过改进的血浆样本制备和添加特定的富集剂（如RNA carrier)，并结合微滴式数字PCR 技术和高特异性的引物序列和探针序列，居然可以用外周血浆样本高效地提取到的肿瘤 相关性的DNA分子，从而高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中ABL基因 T315I，或 roGFRa基因 T674I突变，从而可辅助判断患者是否对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生 耐药。基于上述发现，发明人完成了本发明。
[0118] 术语
[0119] 如本文所用，术语"肿瘤相关突变"指与肿瘤的发生、进展、治疗、和/或预后相关 的基因突变，尤其是与肿瘤治疗的耐药性相关的DNA突变。
[0120] 如本文所用，术语"本发明突变"、"本发明的耐药性突变"可互换使用，指ABL和 TOGFRa基因突变，即ABL蛋白的T315I突变（在蛋白质水平，ABL蛋白第315号氨基酸由苏 氨酸（T)突变为异亮氨酸（I))以及导致该氨基酸突变的相应的核苷酸突变（基因水平）， 或TOGFRa蛋白的T674I突变（在蛋白质水平，PDGFRa蛋白第674号氨基酸由苏氨酸（T) 突变为异亮氨酸（I))以及导致该氨基酸突变的相应的核苷酸突变（基因水平）。研究表 明，通过检测上述两种突变位点的突变情况，对于肿瘤患者是否采用或继续采用伊马替尼 (格列卫）/尼罗替尼治疗，有指导作用；优选地，在本发明中，当上述两个突变位点均为阴 性时，表示患者未对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生耐药；当上述两个突变位点中的一 个或两个为阳性时，表示患者已对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生耐药。
[0121] 如本文所用，术语"非肿瘤组织"指与肿瘤组织不同的组织。在本发明中，对于实 体瘤而言，血液和血浆可视为"非肿瘤组织"。
[0122] 如本文所用，术语"RNA Carrier"为一种市售的、用于协助分离RNA的试剂。其成 分为ployG偶联到DNAmate-种高分子化合物。研究表明，RNA Carrier能特异吸附低浓 度RNA，并且有助于减少提取过程中RNA被RNase降解。然而，研究表明，RNA Carrier对于 常规双链DNA的提取无促进作用。
[0123] 本发明的目的是提供一种利用ddPCR技术检测血浆中基因位点突变从而监测慢 性粒细胞白血病患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼继发耐药的方法。
[0124] 本发明的另一个目的是实时监控服药靶向药物后ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变的突变率，确保在超早期发现患者是否产生继发性耐药突变。
[0125] 本发明的最终目的是通过ddPCR技术，定期检测患者血浆中ABL基因 T315I或 TOGFRa基因 T674I突变的突变情况，以此来判定患者是否已产生继发性耐药，有效的指导 患者进行下一步的治疗。
[0126] 外周血样本中提取DNA模板
[0127] 由于外周血样本中可用于有效检测肿瘤相关性的DNA的量非常少，因此需通过一 定的富集手段对外周血游离DNA进行富集，以得到能够用于检测量的DNA。
[0128] 本发明中，优选的DNA的抽提方法如下：
[0129] (2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；
[0130] (2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合 液；
[0131] 在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0. lng/100微升检测样本。
[0132] 在另一优选例中，步骤（2b)的放置时间为5-10分钟。
[0133] (2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得 吸附有DNA的固相载体；
[0134] (2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱 液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
[0135] 完成上述抽提后，所得到的的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量通常为20-100ng/ 微升，所述含洗脱DNA的洗脱液的体积通常为20-100微升。
[0136] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的平均大小通常为 彡313bp(即基本由游离DNA组成），较佳地为100-250bp，更佳地为150-200bp。
[0137] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占 DNA总量的 80-100 %，较佳地 90-100 %。
[0138] 在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。
[0139] 在另一优选例中，所述的洗脱为AVE洗脱，优选为干燥后直接用AVE洗脱。
[0140] 在另一优选例中，在步骤（2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的 片段大小。
[0141 ] 慢性粒细胞白血病相关基因耐药突变位点的检测
[0142] 数字PCR (digital PCR，dPCR)技术被称为"第三代PCR"技术，是一项检测和定量 核酸分子的新技术，在不依靠任何校准物或外标的情况下，可直接进行单个目标分子的计 数，以实现绝对定量。微滴式数字PCR系统（droplet digital PCR，ddPCR)将含有核酸分 子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标 基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏 度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离DNA。与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确 度、准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检靶分子的绝对数目，特别适合 拷贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。
[0143] 在本发明中，优选的DNA模板是用外周血分离的血浆提取的，较佳地，在提取DNA 模板前，将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4°C，之后将离心获得的 血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4°C，弃沉淀，上清即为所 需抽提DNA的血浆。
[0144] 优选的本发明实施例中，DNA模板的提取方法如下：
[0145] (i)抽提血浆中的游离DNA ;
[0146] (ii)对样本进行裂解、富集、过柱洗脱和AVE洗脱，得到待扩增的DNA模板；
[0147] 任选地，所述方法还包括步骤测试所述DNA模板的片段大小。
[0148] 本申请的PCR方法中，所使用的引物对为包含ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点的特异引物。在本发明的一个优选实施例中，当待检测的位点为ABL基 因 T315I 时，所述的特异引物具有如 SEQ ID N0:3，GAGCCCCCGTTCTATATC 和 SEQ ID N0:4， TGAGTGGCCATGTACAGC 所示的序列，或具有如 SEQ ID N0:7, TTGTTGGCAGGGGTCT 和 SEQ ID NO: 8，TTGCACTCCCTCAGGTAGT 所示的序列。
[0149] 在本发明的另一个优选实施例中，当待检测的位点为TOGFRa基因 T674I 时，所述的特异引物具有如 SEQ ID N0:11，ATCTCCTAACGGCTTTTG 和 SEQ ID N0:12， CAGGAAGCTATCCCTATTCT 所示的序列，或具有如 SEQ ID NO: 15, CGGCTTTTGTCCCCATA 和 SEQ ID NO: 16, GCTCAGGAAGCTATCCCTA 所示的序列。
[0150] 本申请的PCR方法中，还包括使用一条或多条用于检测突变型的突变型特异探 针，和一条或多条用于检测野生型的野生型特异探针。优选地，突变型探针类型为FAM探 针，而野生型探针类型为HEX探针，反之亦可。在另一优选例中，所述的突变型探针的序列 如 SEQ ID NO:l(Probe-FAM:CATCATTGAGTTCATGACCTACGGG)或 SEQ ID N0:5(Probe-FAM:GC CCCCGTTCTATATCATCATTGAG)所示；所述的野生型探针的序列如 SEQ ID N0:2(Probe-HEX:CA TCACTGAGTTCATGACCTACGGG)或 SEQ ID N0:6(Probe-HEX:GCCCCCGTTCTATATCATCACTGAG)所 不。
[0151] 在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID N0:9(Probe-FAM:GGCCCCAT TTACATCATCATAGAGT)或 SEQ ID N0:13(Probe-FAM:TAGGCCCCAITTACATCATCATAGA)所示；所 述的野生型探针的序列如 SEQ ID N0:10(Probe-HEX:GGCCCCATTTACATCATCACAGAGT)或 SEQ ID NO: 14 (Probe-HEX: TAGGCCCCATTTACATCATCACAGA)所示。
[0152] 在本发明的一个优选例中，所述的微滴式数字PCR的反应液首先通过QX100微滴 发生器生成纳升级别的油包水的液滴，然后再进行PCR反应，最后将PCR板转移到QX100微 滴分析仪对所有样品孔进行荧光检测。
[0153] 在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应所使用的反应体系每20 μ 1 组成如下：待测肿瘤组织 DNA 50 ~100ng，2 X ddPCR SuperMix for Probes (Bio-Rad Laboratories) 10 μ 1，ABL基因 T315I或PDGFRa基因 T674I的特异引物及探针各1 μ 1，无 菌蒸馏水补足至20 μ 1。
[0154] 在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应的反应条件为：95°C变性10min ; 随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延伸10min，4°C保存。
[0155] 本发明的一个优选实施例中，检测ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果如图1所示， 图中，蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的 游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色 代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道 荧光信号强度。其中，图1A显示了 H)GFRa T674I突变阳性的检测结果，图1B显示了 ABL T315I突变阳性的检测结果，图1C显示了 TOGFRa T674I突变阴性的检测结果，图1D显示 了 ABL T315I突变阴性的检测结果。
[0156] 本发明的一个优选实施例中的ddPCR仪微滴数目检测结果如图2所显示。图中， 深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生 型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示 了 TOGFRa T674I突变阳性的检测结果，图2B显示了 ABL T315I突变阳性的检测结果；图 2C显示了 TOGFRa T674I突变阴性的检测结果，图2D显示了 ABL T315I突变阴性的检测结 果。
[0157] 伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性判断
[0158] 检测病人伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性相关基因位点是否突变成为实时 监测能否持续使用伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的必要前提条件。
[0159] 由于ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变阳性与患者（优选为慢性粒细胞 白血病患者）伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性相关，因此，本发明的检测方法可以用 于辅助判断患者是否对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生耐药。
[0160] 数字PCR(digital PCR，dPCR)检测技术灵敏度（可达0. 001% )，远高于目前基于 ARMS的检测技术或基于高分辨率溶解曲线HRM的检测技术，非常适合在体液中检测含量极 低的肿瘤游离DNA。
[0161] 微滴式数字PCR系统（droplet digital PCR，ddPCR)将含有核酸分子的反应体 系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的 DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，最后通过泊松分布概率密度函数 计算，无需做到每个微滴内不含靶分子或仅含1个靶分子也能实现准确定量。由于数字PCR 降低了对反应扩增效率的要求，采取终点法判读的方法，因此特别适合检测稀有突变、拷贝 数变异和基因相对表达等方面的检测。本申请利用ddPCR技术检测接受伊马替尼（格列 卫）/尼罗替尼治疗的慢性粒细胞白血病患者外周血浆中ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点的突变情况，根据检测结果判定患者是否对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼 耐药，并推测患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生继发耐药的时间，为调整慢性粒细 胞白血病患者治疗方案提供指导。
[0162] 在本发明的优选实施例中，取患者外周血样本并提取基因组DNA，以待测外周血浆 基因组DNA为模板，利用上述方法对ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点进行 检测，然后根据检测到ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点突变阳性的时间确 定患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼产生耐药的时间。
[0163] 由于本发明方法可以采用较易采样的外周血样本进行检测，因此，所述的检测可 以多次进行，从而在患者的治疗过程中实时监控。
[0164] 本发明方法既可以在用药前对患者的耐药性进行判断，也可以在用药过程中或之 后判断患者是否已经产生耐药性，从而为后续治疗提供指导。在本发明的优选实施例中，所 述的慢性粒细胞白血病患者可以是尚未使用伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼进行治疗的慢 性粒细胞白血病患者，也可以是已经开始使用伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼进行治疗的患 者。
[0165] 在本发明的一个优选例中，在每个治疗周期前后，取慢性粒细胞白血病患者外周 血样本，分离血浆并提取基因组DNA，以待测外周血浆基因组DNA为模板，利用ddPCR技术对 伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性相关位点（ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I) 进行检测，然后根据检测到ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点突变的阳性或 阴性，确定患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼是否产生耐药。
[0166] 具体地，所述的判断检测方法如下：
[0167] 提取慢性粒细胞白血病患者外周血浆基因组DNA ;
[0168] 以待测外周血浆基因组DNA为模板，用ABL T315I或TOGFR a T674I的特异探针 进行ddPCR扩增；
[0169] 根据ddPCR对目的基因位点突变情况的检测结果，分析患者对伊马替尼（格列 卫）/尼罗替尼的耐药情况；
[0170] 根据患者出现ABL T315I或TOGFRa T674I突变阳性或阴性，确定患者对伊马替 尼（格列卫）/尼罗替尼是否产生耐药。
[0171] 在本发明的一个优选实施例中，利用ddPCR技术通过检测外周血浆中基因突变以 监控慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药的方法包括如下步骤：
[0172] (1)提取慢性粒细胞白血病患者外周血浆基因组DNA。
[0173] (2)配制反应体系：
[0174] a.探针及引物设计：本发明采用常规的Taqman探针法进行设计，对ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点分别设计了野生型和突变型的探针，FAM荧光通道 标记突变型，HEX荧光通道标记野生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引 物。
[0175] b.20yl PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50~100ng，2XddPCR SuperMix for Probes (Bio-Rad Laboratories) 10 μ 1，ABL 基因 T315I 或]^GFRa 基因 T674I突变位点野生型和突变型的探针引物（已混合配制好）各1 μ 1，无菌蒸馏水补足至 20 μ 1〇
[0176] (3)制备微滴：
[0177] 在DG8?微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专 用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX100微滴发生器内进行反应，QX100微滴发生器最多 能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将 96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。
[0178] (4) PCR 扩增：
[0179] 将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条 件为：95°C变性10min ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延 伸 10min，4°C 保存。
[0180] (5)微滴检测：
[0181] PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪（Bio-Rad Laboratories USA) 上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行荧光检测。
[0182] (6)结果分析：
[0183] 实验中检测ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点，分别有1对共用的 PCR扩增引物和2对分别标记野生型和突变型的荧光探针。在野生型片段有扩增（在HEX 荧光信号区域有微滴分布）的前提下存在突变型片段的扩增（在FAM荧光信号区域有微滴 分布），则判断该基因有突变；反之则无。
[0184] 检测结果ABL基因 T315I和TOGFRa基因 T674I突变阴性，则患者对伊马替尼（格 列卫）/尼罗替尼敏感；ABL基因 T315I或TOGFRa基因 T674I突变位点突变阳性，则患者 对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药。
[0185] 本发明相对于现有技术，有以下优点：
[0186] (1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度（0. 001% )(即可以从10万个正常DNA 分子中检测到一个突变分子的存在），仅需使用l〇〇ng的DNA模板即可完成检测。
[0187] (2)本发明的检测方法仅需使用检测对象的外周血浆游离DNA即可完成检测，无 需采集肿瘤组织进行检测，操作简便，无创，可重复进行。
[0188] (3)使用本发明方法，可以准确地检测出慢性粒细胞白血病耐药性相关突变，且仅 需使用外周血样本即可完成检测。
[0189] (4)本发明方法可以用于在患者用药治疗的过程中，定期从患者的血浆中抽提 DNA以检测血浆中游离DNA突变，从而在超早期发现患者是否产生继发性耐药突变，可作为 后续治疗的辅助判断手段。
[0190] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0191] 通用方法血浆样本中游离DNA的提取
[0192] 血浆分离方法如下：
[0193] 将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4°C，之后将离心获得 的血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4°C，弃沉淀，上清即为 所需抽提DNA的血浆。
[0194] 提取DNA的过程如下：
[0195] a、裂解
[0196] 加入Proteinase K，使其终浓度为2mg/lml血衆，在60°C的条件下裂解去除蛋白 质从而将游离DNA释放出来。与此同时，加入ACL(carrier RNA)试剂，使DNase和RNase 失活，并使得游离核酸完全从结合的蛋白上释放出来。
[0197] b、过柱纯化
[0198] 在裂解好的血浆中加入ACB溶液（QIAGEN公司），使其终浓度为1. 血浆， 冰浴5min后，用硅胶柱进行过柱纯化。
[0199] c、洗脱
[0200] 过柱之后，加入相应的洗脱液对柱子进行洗涤，最后加入无水乙醇沉淀DNA分子。
[0201] d、溶解
[0202] 在干燥之后的吸附柱中加入30ul Buffer AVE进行溶解，室温放置一段时间后， 进行离心处理，得到纯化的基因组DNA。
[0203] e、对提取得到的血浆游离DNA进行质检，首先用Nanodrop检测其浓度，正常情况 下2ml血衆可抽提出30~50ng/ul的血衆游离DNA。之后通过Agilent bioanalysis 2100 检测其片段大小，以确定其为血衆游离DNA (<300bp)。图3为Agilent bioanalysis 2100 质检图，横坐标为Marker大小（其中35bp和~10000bp峰为外加标记物），纵坐标为峰值 强度，抽提得到的血浆游离DNA的片段大小主要集中在169bp左右，符合要求。
[0204] 各实施例中，所使用的引物对与探针序列如下所示：
[0205] ABL (T315I)
[0206] Probe-FAM:CATCATTGAGTTCATGACCTACGGG
[0207] Probe-HEX:CATCACTGAGTTCATGACCTACGGG
[0208] F:GAGCCCCCGTTCTATATC
[0209] R:TGAGTGGCCATGTACAGC
[0210] PDGFRa (T674I)
[0211] Probe-FAM:GGCCCCATTTACATCATCATAGAGT
[0212] Probe-HEX:GGCCCCATTTACATCATCACAGAGT
[0213] F:ATCTCCTAACGGCTTTTG
[0214] R:CAGGAAGCTATCCCTATTCT
[0215] 实施例1通过ddPCR技术检测血浆中ABL基因和TOGFRa基因突变从而监测慢性 粒细胞白血病患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼继发耐药
[0216] (1)某慢性粒细胞白血病患者开始进行伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼治疗前，抽 取患者外周血4mL，分离得到血衆，利用"QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit"对血衆 中游离DNA进行抽提。通过对样本的溶解、富集、过柱洗脱以及最后AVE洗脱获得高浓度/ 高纯度的DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定其片段大小（<313bp)，以保证抽提质量。
[0217] (2)反应体系配制
[0218] a.探针及引物设计：本发明采用常规的Taqman探针法进行设计，对ABL基因和 TOGFRa基因目的片段分别设计了野生型和突变型的探针，FAM荧光通道标记突变型，HEX 荧光通道标记野生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引物。
[0219] b. 20 μ 1 PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50~100ng，2 X ddPCR SuperMix for Probes(Bio_Rad Laboratories) 10 μ 1，ABL 基因 T315I 位点野生型和突变 型的探针引物和TOGFR α基因 T674I位点野生型和突变型的探针和引物（已混合配制好） 各2 μ 1，无菌蒸馏水补足至20 μ 1。
[0220] (3)制备微滴
[0221] 在DG8?微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专 用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX100微滴发生器内进行反应，QX100微滴发生器最多 能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将 96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。
[0222] (4) PCR 扩增
[0223] 将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条 件为：95°C变性10min ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延 伸 10min，4°C 保存。
[0224] (5)微滴检测
[0225] PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪（Bio-Rad Laboratories USA) 上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行荧光检测。
[0226] (6)结果分析
[0227] 检测结果如下表所述：
[0228]
[0229] 根据以上数据分析发现，该样本的TOGFRa (T674I)和ABL(T315I)未发生突变， 提示患者目前尚未产生对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，但应定期（每3-6 周）进行实时监控，一旦发现产生对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，及时指 导患者进一步的用药治疗。
[0230] 图1C、D和图2C、D为实施例1的检测结果图，图1C和图2C均显示TOGFRa (T674I) 基因在检测出野生型的背景下未检测出突变型，说明检测结果为突变阴性。图ID和图2D 均显示ABL(T315I)基因在检测出野生型的背景下未检测出突变型，说明检测结果为突变 阴性。
[0231] 根据以上数据分析发现，该样本的H)GFRa (T674I)和ABL(T315I)未发生突变， 提示患者目前尚未产生对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，但应定期（每3-6 周）进行实时监控，一旦发现产生对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，及时指 导患者进一步的用药治疗。
[0232] 实施例2通过ddPCR技术检测血浆中ABL基因和TOGFRa基因突变从而监测慢性 粒细胞白血病患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼继发耐药
[0233] (1)实施例1的患者经过开始进行伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼治疗6个月后， 用如实施例1相同的方法采集其外周血，分离血浆，提取基因组DNA并进行PCR扩增。检测 结果如下表所述：
[0234]
[0236] 根据以上数据分析发现，该样本的TOGFRa (T674I)和ABL(T315I)未发生突变， 提示患者目前尚未产生对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，但应定期（每3-6 周）进行实时监控，一旦发现产生对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，及时指 导患者进一步的用药治疗。
[0237] 实施例3通过ddPCR技术检测血浆中ABL基因和TOGFRa基因突变从而监测慢性 粒细胞白血病患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼继发耐药
[0238] (1)实施例1的患者经过开始进行伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼治疗12个月后， 用如实施例1相同的方法采集其外周血，分离血浆，提取基因组DNA并进行PCR扩增。
[0239] (2)结果分析：
[0240] 图1A、B和图2A、B为实施例3的检测结果图。图1 (A)和图2 (A)中， TOGFRa (T674I)均检测出了突变型和野生型。图1(B)和图2(B)中，ABL(T315I)均检测出 了突变型和野生型，说明TOGFRa (T674I)和ABL(T315I)均出现突变阳性。
[0241] 检测结果如下表所述：
[0242]
[0243] 根据以上数据分析发现，该样本的H)GFR α (T674I)基因发生了突变，突变率为 2.76%，ABL(T315I)基因发生了突变，突变率为6. 11%，由于该位点突变易产生对伊马替 尼（格列卫）/尼罗替尼的继发性耐药，因此提示患者可能产生伊马替尼（格列卫）/尼罗 替尼继发性耐药，应及时更换治疗方案。
[0244] 根据以上数据分析发现，该慢性粒细胞白血病患者外周血浆游离DNA中 ABL(T315I)或TOGFRa (T674I)突变阳性，患者已出现伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药。 产生耐药的时间是在开始伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼治疗第6个月到12个月之间。
[0245] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品； (2) 对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对 于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/ 微升的提取液； (3) 以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含 所述的耐药突变位点的扩增产物；和 (4) 对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例； 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL基因，或TOGFRa基因。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物 对，以及用于检测突变位点的探针。3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于慢性粒细胞白血病 患者。4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤（2)中，所述的抽提处理包 括步骤： (2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液； (2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液； (2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附 有DNA的固相载体； (2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液， 即为含抽提DNA的DNA抽提物。5. -种基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对； (b) RNA carrier ； (c) 使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法， 其中，所述的突变位点包括ABL T315I，或TOGFRa T674I。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括： (d) 位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。7. -种基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对； (b) RNA carrier ； (c) 使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法； (d) 位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于 检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针； 其中，所述引物对的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中所示，或所述引物对的序列 如 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示； 所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:5所示，且所述的野生型探针 的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示； 或所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 13所示，且所述的野生型探 针的序列如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 14所示； 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或TOGFRa T674I。8. -种如权利要求5或7所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特 征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼的耐药 性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用伊马替尼（格列卫）/尼罗替 尼进行治疗的试剂盒。9. 一种肿瘤患者伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药性的检测方法，其特征在于，包括 步骤：用如权利要求1-4任一所述的方法进行基因耐药突变位点检测；和 若检测结果为阳性，则判定患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼耐药；若检测结果为 阴性，则判定患者对伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼敏感； 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或TOGFRa T674I。10. -种肿瘤患者治疗方法，其特征在于，包括步骤： (a) 用如权利要求1所述的方法，对所述对象进行基因耐药突变位点检测，并对检测结 果为阴性的对象，采用伊马替尼（格列卫）/尼罗替尼进行治疗； (b) 在一个或多个治疗周期之中或之后，用如权利要求1所述的方法，对所述对象再次 进行基因耐药突变位点检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用伊马替尼（格列卫）/ 尼罗替尼进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用伊马替尼（格列卫）/尼罗替 尼进行治疗； 且所述的基因耐药突变位点选自下组：ABL T315I，或TOGFRa T674I。
【文档编号】C12Q1/68GK105838781SQ201510017299
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】易静, 许骋, 吴云鸣, 张桢珍, 丁飞飞, 楼敬伟, 王潍博, 李明峰, 何志杰, 张威浩, 易村犍
【申请人】上海宝藤生物医药科技股份有限公司, 上海张江转化医学研发中心有限公司, 上海宝藤医学检验所有限公司