控制香雪兰花色苷合成的查尔酮异构酶的cDNA的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属植物分子生物技术领域，具体涉及从红花香雪兰花瓣分离三条编码查尔酮异构酶(FhCHI)的cDNA。
【背景技术】
[0002]查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase, CHI)是类黄酮合成途径早期阶段的关键酶之一，是植物花色素苷生物合成所必需的酶，在CHI催化下，柚皮素查尔酮形成黄烷酮，黄烷酮再在其它酶的催化下转化为各种颜色类型的类黄酮化合物，从而形成不同花色。
[0003]进化分析显示CHI是由脂肪酸结合蛋白进化而来的立体专一性酶。CHI超家族包含四种类型蛋白。I型普遍存在于维管植物中，负责类黄酮的合成；II型是在豆科中参与异黄酮合成；111型是广泛存在于陆生植物中的脂肪酸结合蛋白；IV型蛋白功能未知。CHI催化分子内的环化反应，I型CHI利用柚皮素查尔酮(6’ -羟基查尔酮)为底物，使双环的查尔酮转变为具生物活性的三环(2S)-黄烷酮。
[0004]CHI有高度保守的结构域和活性位点氨基酸，但是他们在不同植物中也有差异。在豆科植物苜蓿中，CHI三维结构的分析表明有2组氢键起着主要的催化作用，第I组是保守的Thr48和Tyrl06与2个水分子之间的氢键，第2组是Asnll3和Thrl90与黄酮的7-羟基之间的氢键。对比分析这4个关键的氨基酸位点，发现它们在分支I和II中都是高度保守的。
[0005]CHI基因首先从法国豌豆中分离出来，目前已从沙梨、草莓、百脉根等上百种植物中克隆了 CHI基因，研究表明..CHI基因表达量的改变可导致类黄酮化合物合成的变化，已在烟草、大麻、马铃薯、番茄等植物中进行了转基因验证，改变了类黄酮化合物的含量。目前关于查尔酮异构酶的研究多集中在双子叶植物，单子叶植物当中缺鲜有报道，尤其是单子叶园艺花卉植物香雪兰未见报道。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明首次从红花香雪兰花瓣中克隆得到3条查尔酮异构酶(CHI)的cDNA，并确定了它的核苷酸序列和由此得出氨基酸序列。在香雪兰花朵着色过程中，三者基因表达和花色苷合成呈现明显的相关性，另外，将3个的真核表达载体转染到拟南芥CHI突变体中，其幼苗和种皮都恢复了表型。
[0008]所以，本发明的目的是提供具有功能的编码查尔酮异构酶(CHI)的新cDNA和由此推断的氨基酸序列。
[0009]本发明的技术方案:
为了从首次从香雪兰中克隆得到因，本发明人首先对红花香雪兰花瓣进行了转录组测序，拼接得到了 EST序列数据库，然后利用利用拟南芥查尔酮异构酶氨基酸序列进行本地tblastn检索，在香雪兰中得到了多条与拟南芥查尔酮异构酶基因高度同源的序列，通过同源比较和氨基酸保守性分析，确定了三条与花色苷合相关的序列，随后利用RT-PCR技术扩增得到了全长的cDNA序列，并在此基础上推测得到了其相关的氨基酸序列。3条序列分别被命名为FhCHim FhCHI5,納开放阅读框架687bp，编码228个氨基酸，蛋白质的分子量推测是24，417Da，等电点为9.23，与金花茶(nitidissima )的查尔酮异构酶(CHI)同源性最高，达88% ； /^^似开放阅读框架长771bp，编256个氨基酸，蛋白质的分子量推测是27，439Da，等电点为5.03，与中国水仙(Narcissustazetta var.chinensis)的CHI同源性最高，达到88%;开放阅读框架长834bp，编码277个氨基酸，蛋白质的分子量推测是29，832Da，等电点为5.14，与中国水仙(Narcissustazetta var.chinensis)的CHI同源性最高，达81%。香雪兰FhCHIs和苜蓿MsaCHIl相比较，有很多保守的氨基酸是一致的，根据文献报道，它们都具有4个高度保守的活性位点氨基酸精氨酸(Arg36)、苏氨酸(Thr48)、酪氨酸(Tyrl06)、天冬酰胺(Asnll3)。
[0010]分别构建携带FhCHIl，FhCHim /?⑶/5的真核表达载体，转入到农杆菌GV3101细胞中，利用蘸花法侵染拟南芥突变体。结果表明:3条香雪兰基因的导入都能够使突变体的表型得到不同程度的恢复，高效液相(HPLC)分析结果表明:野生型拟南芥含有4个花色苷吸收峰，CHI突变体则没有，而转入基因的拟南芥也有4个吸收峰，只是含量少于野生型。初步证明我们克隆得到的3条查尔酮异构酶基因都具有查尔酮异构酶的功能。
[0011]利用半定量RT-PCR技术分析了三个查尔酮异构酶基因在开花过程中的表达模式，同时利用高效液相质谱串联技术分析了香雪兰开花过程中花色苷积累的规律，二者的相关性分析表明基因的表达与花色苷的积累正相关。
[0012]3条香雪兰基因的cDNA的序列信息如下:
其中1:香雪兰基因的全长cDNA序列(SEQ ID N0.1)
TCTAATGACAACAACAACGCTCCAGCCATCGGCTCTGGTCATAACCAAACTGGTGATCGCCGGCTTCCTCTTC
CCTCCGGCGATCACACCGCCGCCCGGCGATCAGCCCACACTATTCCTCGCCGGCGCAGGACAGAGGGGATTGGATGT
GGGGGGCAAACTCGTAATTTTTACGGCCATCGGCGTGTACCTGGAGGAGTCGGCGGTCCCGTCACTCGCCGGTAAAT
GGGAGGGGAAGGCGGCGGAGGAGCTCCTCGTGTCCGATCATTTCTTCCGGGATATCTACACCGGTCCATTTGAGAGG
CTCACAAAGGTGACCATGGTCTTGCCACTGACGGGCAAAGAGTACTCGGATAAGGTGTCCGAGAACTGTGTGGCCTA
CTGGAAGGCTGTCGGGACCTACGACAGAGCTAAACACGCGGCGATAGTGAAGCTAAAAGAGGTCTTTAAGTCCAAGA
CCTTTTCTCATGGCGCATCGATCCTCTTCACTCACGAATCTTCTGGCTCTTTGACTATTGGATTTTTGAAGAACAAC
TCGATGCCCGATTCTGGGGGCACAGTTATAAGGAGTAAAGCTCTGTCGGAGGCGATCTTGGAGTCTATCATTGGCAA
GAATGGAGTGTCGCCTGCAGCGAAAGAAAGTTTGGCGAGACGCATTTCAGCACTAATGAAGGAAAGGATCACGTCGT
MGAA
其中2..电FhCHIl基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列(SEQ ID N0.2)
MTTTTLQPSALVITKLVIAGFLFPPAITPPP⑶QPTLFLAGAGQRGLDVGGKLVIFTAIGVYLEESAVPSLAGKWEGKAAEELLVSDHFFRDIYTGPFERLTKVTMVLPLTGKEYSDKVSENCVAYWKAVGTYDRAKHAAIVKLKEVFKSKTFSHGASILFTHESSGSLTIGFLKNNSMPDSGGTVIRSKALSEAILESIIGKNGVSPAAKESLARRISALMKERITS-
其中3..FhCHI2基因的全长cDNA序列(SEQ ID N0.3)
CTGCAAATGCCACAAAAGTAAAGGCAAAGCCAACCAATCCTCACACTCTTTGTTATAACTCCCTCAACAACCAAACTCACAAGCATCACTAGTTTCTGATGACAATGGTGGAGATGGAAGTGTCACATTTGGTTTCAGCAACAACCACAA
AGCAAGAAATGCCTTTGGTTTCAGCAACAACCAAATTAGAAGTGGAAGGAGTTCTCTTCCAACCTCACCTCACACCA
TCTGGTTCTCCCCATAATCATTTTCTCGCCGGTGCCGGTGTGAGAGGATTGGAGATTGGTGGCAAGTTCATAAGCTT
TACCGCGATCGGCATCTACTTAGAAACTGAAGCAGCCGTCGAAGCCCTCGCTGTCAAATGGAAGGGCAAGACTGCCG
AGGAGCTTGCGGCATCTGCCGACTTCTTTCGAGATATCTACACAGGACCATTTGAGAAATTCACTAGAGTGACAATG
ATTCTCCCACTGACCGGCCAGCAGTACGCCGAGAAGGTGACCGAGAACTGCGTCGCTTACTGGAAGGCCATCGGTAA
ATATACAGACGCAGAAGCTGCAGCTGTCGACAAGTTCAGCGAAGTCTTCAAGCCGGAGATTTTCCCTCCTGGCTCCT
CCATCCTCTTCACTCATTCCCCATCTGGTTCGCTGACGATTGCCTTCTCCAAGGATGACTCCATTCCTGAAGCTGGC
ACTGCGATTATCGATAACGCAATGCTGACTGTGGCAATCTTGGAGTCGATCATCGGCGAACATGGCGTCTCTCCTGC
AGCGAAACAGAGCCTGGCGGTGCGACTGTCGAGCATGCTGAGTGAAGTCCAAGATGTGGAGAAATCTCAGGGCGAGA
AAACTGTGACTGTAATGTGTGCATGATATGGAGAGGCAGAGAGAAAAAGAAGCAGCCTTTGTAATCCTAAGGGTTCG
GATTATTAAAATAGGGAAATAAAAAGAGTTTGTAAGCATCTTGATTTCAAATATTATATATTGATTTTGTAATTTAA
GCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
其中\ ?.电FhCHI2基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列(SEQ ID N0.4)MTMVEMEVSHLVSATTTKQEMPLVSATTKLEVEGVLFQPHLTPSGSPHNHFLAGAGVRGLEIGGKFISFTAIGIYLETEAAVEALAVKWKGKTAEELAASADFFRDIYTGPFEKFTRVTMILPLTGQQYAEKVTENCVAYWKAIGKYTDAEAAAVDKFSEVFKPEIFPPGSSILFTHSPSGSLTIAFSKDDSIPEAGTAIIDNAMLTVAILESIIGEHGVSPAAKQSLAVRLSSMLSEVQDVEKSQGEKTVTVMCA-
其中5:FhCHI5基因的cDNA全长核苷酸序列(SEQ ID N0.5)
CCCTTTCCTTATATATAGGCAAACGCAAAGTTCGACCGAGTCACTCTCTTTTTTGTTGCAACTCCCTTTCTGC
TCAAAATGGGCGAGGCATCACCTCTGGCTTCTGCAACAACCAAGCTGGAAGTGGAAGGAGTTGTCTTCCAACCTCAC
CTCACACCTCCTGGCTCTTCCAAGCCTCATTTCCTCGGCGGAGCCGGTGTGAGGGGATTGGAGATTGGTGGAAAGTT
CATAAGCTTCACAGCGATCGGCATTTACTTGGAGAGCGAGACGGCCGTTAAGGCCCTCGCTACCCAATGGAAGGGCA
AGGCTTCCGAGGAGCTGACATCCTGTGCGGACTTCTTTCGGGATATCTACACAGGACCATTTGAGAAGTTCACTAGA
GTGACAATGATCCTCCCGCTGACCGGCCAGCAGTACACCGAGAAGGTGACCGAGAACTGCGTTGCCTACTGGAAGGC
CATCGGTATCTATACCGACGCAGAAGCCGCAGCTGTAGACAAGTTCAAGGAAGTCTTCAAGTCAGAGAGCTTCGCTC
CTGGCTCCTCCATCCTCTTCAGTCACTCCCCATCTGGTTCGCTGACGATTGCATTCTCCAAGGATGAGTCCATTCCT
GAAGCCGGTACTGCAGTAATCGAGAATGCGGCACTGAGCTTGGCAATCTTGGAGTCTATTATTGGTGAGCATGGCGT
CTCTCCTATGGCGAAACAGAGCCTGGCACTGCGATTGTCGAGCATTATGCGTGAAGTTCATGATGTGGAGAAAGCCA
AGGGGGAGCAAACTGTATGTCAAGTCCAAGATGTGGAGAAAGCCGAGGGGAAGCAAACTGTGAGTGAAGTCCATGAT
GTGAAGAAAGACAAGAAAGTCGAGGGGGAGCAAACTGTGAGTACTGAAGTGCATGATGAGGAGAAATGATGCGGGGC
CACGAAGTTTGAGGG
其中&..电FhCHI5基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列(SEQ ID N0.6)MGEASPLASATTKLEVEGVVFQPHLTPPGSSKPHFLGGAGVRGLEIGGKFISFTAIGIYLESETAVKALATQffKGKASEELTSCADFFRDIYTGPFEKFTRVTMILPLTGQQYTEKVTENCVAYffKAIGIYTDAEAAAVDKFKEVFKSESFAPGSSILFSHSPSGSLTIAFSKDESIPEAGTAVIENAALSLAILESIIGEHGVSPMAKQSLALRLSSIMREVHDVEKAKGEQTVCQVQDVEKAEGKQTVSEVHDVKKDKKVEGEQTVSTEVHDEEK-
【附图说明】
[0013]图1..FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5 基因的全长 RT-PCR 结果图
图2:同源性比对分析:香雪兰FhCHIs和苜蓿MsaCHIl相比较，有很多保守的氨基酸是一致的，根据文献报道，它们都具有4个高度保守的活性位点氨基酸精氨酸(R)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)，在图中用红框圈出。
图3:拟南芥突变体表型恢复
野生型的幼苗和种皮颜色均呈现为紫色；《5突变体幼苗为绿色，种皮为黄色；而35S:: FhCHIl, 35S:: FhCHR和35S:: 转入到拟南芥《狭变体后获得的转基因植株恢复了幼苗和种皮的紫色，证明这3条基因有查尔酮异构酶的功能。
[0014]图4:转基因植株花色苷检测结果
其中A图为野生型拟南芥，有4个吸收峰图为《5突变体，没有检测到明显的吸收峰；C图、D图、E图分别为35S:..FhCHIUH: FhCHI2^\ 35S:: FhCHI5转入《狭变体获得的转基因拟南芥，也有4个相应的吸收峰，只是峰面积小于野生型。进而证明35S: