一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列的制作方法
【专利摘要】一种明日叶类黄酮合成途径限速酶—查尔酮合成酶基因的序列，该基因的序列具有SEQ ID NO.1中从第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中从第1-1194位所示的核苷酸序列，其序列编码的多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。查尔酮合成酶是植物体内类黄酮代谢途径中的第一个关键酶，本发明利用同源克隆方法结合RACE技术获得的明日叶查尔酮合成酶基因可用于调控明日叶及其他植物内黄酮类化合物的合成，具有较大的经济价值和应用前景，尤其在医疗、保健领域使得明日叶能够获得更广泛的应用。
【专利说明】-种明日叶查尔酮合成酶基因的序列
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种植物基因工程领域的基因序列，具体涉及一种明日叶类黄酮 化合物合成关键基因的查尔酮合成酶基因的DNA、cDNA开放阅读框全长序列及编码蛋白的 氨基酸序列。
【背景技术】
[0002] 明日叶，伞形科当归属草本植物，原产自日本八丈岛，因岛民多食用明日叶，均较 长寿，因此明日叶又名长寿菜。明日叶具有抗癌、防止细胞老化、提高机体免疫力、抗血栓、 降血压等保健功能，被誉为"21世纪的健康食品"。研究发现，明日叶富含一种特有成分 查尔酮，属黄酮类化合物，而此黄酮类化合物具有很高的药用价值（药食兼用植物明日叶 的研究进展及应用刘畅，王正武等，食品与药品2013, 15 (3) 205-209)(周先丽，梁成钦， 徐庆，等.明日叶的化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2012, 18 (3): 103-105)，孟扬 等在关于查尔酮抑制小鼠癌细胞的研究中证明了查尔酮的药用功能（孟扬，钟进义，孙 赫.明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响[J].癌变.畸变.突 变，2011，23(1) :50-53)。因此明日叶的药用及保健功能与其富含查尔酮有着必然联系。黄 酮类化合物是一类重要的植物次生代谢物质，指基本母核为苯基色原酮类化合物，现在则 泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物。黄酮类化合物合 成途径中，主要是由多个结构基因和调节基因来完成的，通过苯丙氨酸代谢途径，从苯丙氨 酸经过三步酶促反应生成香豆酰辅酶A，再在查尔酮合成酶的作用下，与丙二酸辅酶A缩合 生成查尔酮，然后在查尔酮异构酶（CHI)、二氢黄酮醇还原酶（DFR)和异黄酮合酶（IFS)等 催化下合成黄酮、异类黄酮、花青素类等化合物（蒋明，曹家树.查尔酮合成酶基因[J]. 细胞生物学杂志，2007, 29(4) :525-529)。因此，查尔酮合成酶（CHS)在苯丙氨酸代谢途径 中扮演着极其重要的角色，是类黄酮合成途径中的关键酶和限速酶。因此明日叶查尔酮合 成酶基因 CHS可应用于明日叶类黄酮化合物合成的调控。目前，国内外关于查尔酮合成酶 的报道较多，主要集中在十字花科的拟南芥、禾本科的稻、玉米、豆科的大豆、苜蓿、豌豆、葡 萄科的葡萄、菊科植物等，但未曾见任何公开报道伞形科当归属明日叶查尔酮合成酶基因 的克隆及DNA、cDNA开放阅读框全长序列和编码蛋白的氨基酸序列，同时对于UV-C照射处 理对明日叶CHS基因表达的影响和查尔酮含量调控研究也未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种明日叶查尔酮合成酶基因 DNA 全序列、开放阅读框ORF序列以及该基因编码的氨基酸序列，并且在获得高查尔酮含量明 日叶品种中得到应用，为调控明日叶黄酮类化合物合成及在转基因植物中的应用提供有效 的技术手段。
[0004] 本发明的技术方案是：
[0005] -种明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其具有SEQ ID NO. 1中从第1-1413位所示 的核苷酸序列以及SEQ ID NO. 2中从第1-1194位所示的核苷酸序列。
[0006] 进一步地，所述的序列编码的多肤具有SEQ ID NO. 3所不的氣基酸序列。
[0007] 本发明的另一技术方案是：
[0008] -种所述的明日叶查尔酮合成酶基因在获得高查尔酮含量明日叶品种中的应用。
[0009] 本发明所述的明日叶查尔酮合成酶基因 CHS全长的克隆，依次通过以下步骤实 现：
[0010] 1)根据菊科植物查尔酮合成酶基因保守序列设计兼并引物，以明日叶叶片CDNA 为模板，扩增明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域；
[0011] 2)基于获得的明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域设计基因特异引物，进行3'、 5' race克隆，分别得到明日叶CHS基因的3'、5'端序列，通过拼接得到明日叶CHS基因的 ORF序列，并命名为Ak-CHS ;
[0012] 3)根据明日叶CHS基因 ORF设计基因全长引物，以明日叶cDNA为模板进行PCR扩 增，验证获得的CHS基因 ORF全长序列，并以DNA为模板，以上述设计全长特异引物进行PCR 扩增获得基因 DNA全长。
[0013] 4)根据获得的ORF序列设计Ak-CHS荧光定量引物，以actin为内参基因设计其荧 光定量引物，通过UV-C照射处理明日叶叶片不同时间，以不同时间提取的明日叶叶片RNA 反转录的cDNA为模板进行q-PCR，并测定不同时间明日叶叶片查尔酮提取量。
[0014] 本发明具有如下的有益效果：
[0015] 由于查尔酮合成酶是植物体内类黄酮代谢途径中的第一个关键酶，因此本发明提 供的查尔酮合成酶基因可用于调控明日叶及其他植物内黄酮类化合物的合成，具有较大的 经济价值和应用前景，尤其使得明日叶在医疗、保健领域中获得更广泛的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为明日叶叶片RNA电泳结果图。
[0017] 图2为CHS基因3'端PCR扩增产物电泳图；
[0018] 图中，M- DL2000，1-CHS基因3'端PCR扩增产物。
[0019] 图3为CHS基因5'端PCR扩增产物电泳图；
[0020] 图中，M- DL2000, 2- CHS基因5'端PCR扩增产物。
[0021] 图4为CHS基因 ORF、DNA全长验证电泳图；
[0022] 图中，M- DL2000, 3- CHS基因 ORF全长的PCR扩增产物，4一CHS基因 DNA全长的 PCR片扩增产物。
[0023] 图5为UV-C照射处理AK-CHS基因相对表达量分析图。
[0024] 图6为UV-C照射处理查尔酮提取量变化图。
[0025] 图7为查尔酮含量测定标准曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明利用同源克隆方法结合RACE技术获得明日叶类黄酮合成途径限速酶一查 尔酮合成酶的基因全长序列，该基因 DNA全长1413bp，含两个外显子和一个内含子，开放阅 读框（ORF)全长为1194bp，编码397个氨基酸。
[0027] 下面结合具体的实施例进一步阐述本发明的【具体实施方式】。这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0028] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，详见[美]J.莎姆 布鲁克（2005)编著的《分子克隆实验指南》第三版中所述的条件，或按照试剂盒制造厂商 所建议的条件。实验所用的高保真Taq酶（Premix Taq)、pMD18 - T载体、PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒和突光定量试剂盒购自TaKaRa公司， SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒购自 Clontech 公司，RNAprep Pure 植物总 RNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司，大肠杆菌DH5ci由实验室保存。
[0029] 实施例1
[0030] 明日叶查尔酮合成酶基因的克隆，步骤如下：
[0031] 1.明日叶叶片RNA的提取
[0032] a)匀浆处理：
[0033] 称取50-100mg鲜嫩明日叶叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ I RL，涡旋 剧烈震荡混匀。
[0034] b)将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），12000rpm离心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中 的细胞碎片沉淀。
[0035] c)缓慢加入0. 5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸 附柱CR3中，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0036] d)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0037] e) DNase I工作液的配制：取10 μ I DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管 中，加入70 μ I RDD溶液，轻柔混匀。
[0038] f)向吸附柱CR3中央加入80 μ 1的DNase I工作液，室温放置15min。
[0039] g)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0040] h)向吸附柱CR3中加入500 μ 1漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0041] i)重复步骤h)。
[0042] j) 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干 吸附材料中残余的漂洗液。
[0043] k)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空 滴加 30-100 μ I RNase-Free ddH20,室温放置 2min，12000rpm 离心 2min，得到 RNA 溶液，一 70°C保存。
[0044] 1)用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，明日叶叶片总RNA电泳结果见图 1，由图1可以看到28S和18S清晰的两条带，且28S条带的亮度约为18S的2倍；说明R NA 提取完整，无降解，满足后续试验需要，分光光度计下检测RNA浓度。
[0045] 2. cDNA第一条链的合成
[0046] 根据 PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明，将一 70°C保存 的RNA反转录合成cDNA第一条链，反转录后的cDNA保存于-20°C冰箱中备用。
[0047] 3. CHS基因 cDNA开放阅读框全长克隆及DNA全长的获得
[0048] a)根据菊科植物查尔酮合成酶基因保守序列设计兼并引物CHS-F、CHS_R(见下列 表1)，以反转录的明日叶cDNA为模板，扩增明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域；PCR反应 条件为：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，32 个循环；72°C IOmin ;4°C保存。将回 收的PCR产物连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH-5a，在选择培养基上培养（氨苄青 霉素）后，挑选单克隆摇菌后进行PCR检测，检测获得的阳性结果送至上海华大基因进行测 序，测序获得长度为959bp的保守区域片段。
[0049] 表1本发明所用引物
[0050]
【权利要求】
1. 一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其特征在于，具有SEQ ID NO. 1中从第 1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO. 2中从第1-1194位所示的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其特征在于，所述的序列 编码的多肽具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
3. -种权利要求2所述的明日叶查尔酮合成酶基因在获得高查尔酮含量明日叶品种 中的应用。
【文档编号】C12N9/10GK104313040SQ201410558045
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】周麟笔, 刘峰, 曹越平 申请人:上海交通大学