郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因，所述蛋白质为由如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮异构酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ?ID?NO.3所示的核酸序列；利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，通过各种常规筛选方法，能筛选出与查尔酮异构酶TfCHI相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，为通过基因工程改变花色，创造新花色提供了一种新途径。
【专利说明】郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因，属于生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)是类黄酮合成途径中紧接查尔酮合成酶(CHS)的第二个酶，在CHI的催化作用下，一个查尔酮分子经过分子内反应将C-环关闭而转变为黄烷酮。该反应的一个重要特点是将黄色的查尔酮转变成了无色黄烷酮，这一点可作为研究CHI功能的一个重要生物标志。植物体内几乎所有的类黄酮类化合物都是从黄烷酮衍生而来。查尔酮异构酶是增加黄酮化合物的关键酶，黄酮化合物是一类结构相似的多酚化合物，大多具有颜色，对植物生长发育及防御敌害具有重要作用。对人类而言则具有清除自由基、抗氧化、抗癌等多种生物活性，对肿瘤和心血管等疾病的治疗与预防也有重要的药用价值。
[0003]应用基因工程技术将CHI基因导人到植物中，其表达产物可以促进有益于人体健康的黄酮类化合物的生物合成，改变花色、果色，改善口感等。具有开发应用的前景。如将矮牵牛CHI基因转入番茄并获得了转基因番茄，在其果皮中黄酮类含量比对照增加了 78倍、果肉中黄烷醇增加了 21倍。将水母雪莲CHI基因转入新疆雪莲，诱导出新疆雪莲发根，在转CHI基因新疆雪莲发根中芹菜素含量比对照组提高了 12倍，总黄酮量可提高4倍；通过插入转座子的方法突变康乃馨花瓣中的CHI基因，会使白色的花朵变成黄色JfCHS正义基因和CHI反义基因导人到甜橙中，转基因甜橙中苦味物质的合成量减少，水果的口味发生了改变，口感更好了。
[0004]CHI的编码基因是一个多基因家族，该基因已从多种植物中分离出来，如矮牵牛、菜豆、玉米等,但对于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana), CHI基因的克隆、表达模式及CHI蛋白序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香CHI蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供了一种郁金香CHI蛋白TfCHI序列以及编码上述蛋白质的核酸序列；本发明公开了郁金香TfCHI蛋白及其核酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式，填补郁金香CHI基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香CHI蛋白的空白。此外，利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，通过各种常规筛选方法，能筛选出与查尔酮异构酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明为今后利用本发明的TfCHI基因，通过基因工程技术改变花色、创造新花色提供了一种新的途径。
[0006]一方面，本发明提供了具有郁金香查尔酮异构酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮异构酶活性的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
[0007]优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.4所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0008]进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.4所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0009]另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0010]优选的，所述核酸序列具体为:(a)碱基序列如SEQ ID N0.3第I~693位所示；或(b)与SEQ ID N0.3第I~693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(。)能与SEQ ID N0.3第I~693位所示的核酸进行杂交的序列。
[0011]优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0.3第I~693位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。 [0012]在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0013]在本发明中，术语“郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfCHI蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示的第I~693位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.3所示的第I~693位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.3所示的第I~693位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0014]该术语还包括能编码天然郁金香TfCHI蛋白的相同功能、SEQ ID N0.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
[0015]在本发明中，术语“郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白”指具有郁金香TfCHI蛋白活性的SEQ ID N0.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfCHI蛋白相同功能的、SEQ ID N0.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfCHI蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0016]本发明的郁金香TfCHI蛋白的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfCHI相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfCHI蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0017]在本发明中，“郁金香TfCHI保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0018]表1
【权利要求】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.4所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.4所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为: Ca)喊基序列如SEQ ID N0.3第I~693位所不； 或(b)与SEQ ID N0.3第I~693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能与SEQ ID N0.3第I~693位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID N0.3第I~693位所示的核酸序列中I~ 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
【文档编号】C12N15/61GK103614358SQ201310529333
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红 申请人:上海交通大学