一种d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用的制作方法
【专利摘要】一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用，属于酶的基因工程【技术领域】。本发明公开了由来源于梭状芽孢杆菌（Clostridiumbolteae）ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（简称DPE酶）作为亲本，利用基因突变技术，将其68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分别替换为异亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，获得突变体酶Y68I/G109P，其热稳定性和催化活性均得到提高，具有重要的工业应用价值。
【专利说明】一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明公开一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用，属于酶的基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE酶)属于D-塔格糖3_差向异构酶(简称DTE)家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。DPE酶可分别催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。
[0003]随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要经济价值和实际意义的当务之急。D-阿洛酮糖是一种稀有糖，具有多种营养和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低热量的甜味剂。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品，允许用于食品和膳食补充剂中。另外D-阿洛酮糖具有保护胰腺β-胰岛细胞，减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。
[0004]虽然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但其在自然界中含量极少且极难获得。生物法制备D-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。良好的生物催化剂的开发对工业应用至关重要。耐热酶具有多种优点 ，如转化率高，反应速度快，污染少，底物粘度低等。因此，开发具有良好热稳定性的DPE酶对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。
[0005]由于来源于野生菌株未经改造的DPE酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，限制了其应用范围。本实验室开发的梭状芽孢杆菌bolteae)
酶可以有效促进D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化(Min Jia, et al.2013, AppliedMicrobiology and Biotechnology, DOI 10.1007/s00253-013-4924-8)。但为获得更适合的生物催化剂，通过定点突变的方法，对DPE酶进行分子改造，进一步提高其催化活性和热稳定性，以期得到酶学性质更适合工业应用的DPE酶。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用，对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。
[0007]本发明的技术方案:一种功能改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的突变体酶Y68I/G109P，将来源于梭状芽孢杆菌boIteaeH BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行突变所得的突变体酶；将原来DPE基因中的68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分别替换为异亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，命名为Y68I/G109P。
[0008]与野生型DPE酶相比，所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的热稳定性获得提高，以在55°C下的半衰期t5(l来表示热稳定性，DPE的突变体酶Y68I/G109P的半衰期为78.3min,是野生型DPE酶的1.8倍；所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的催化活性获得提高，与野生菌相比，其乙值-低，<at/ny到提高;__
【权利要求】
1.一种功能改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的突变体酶Y68I/G109P，其特征在于将来源于梭状芽孢杆菌bolteae) ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行突变所得的突变体酶；将原来DPE基因中的68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分别替换为异亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，命名为Y68I/G109P。
2.根据权利要求1所述的DPE的突变体酶Y68I/G109P，其特征在于与野生型DPE酶相t匕，所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的热稳定性获得提高，以在55°C下的半衰期t5(l来表示热稳定性，DPE的突变体酶Y68I/G109P的半衰期为78.3min,是野生型DPE酶的1.8倍；所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的催化活性获得提高，与野生菌相比，其值降低，<at/fm得到提闻;
3.—种重组表达质粒，其特征在于其中含有权利要求1所述DPE的突变体酶Υ68Ι/G109P基因。
4.一种表达宿主，其特征在于其被权利要求3所述的重组表达质粒转化。
5.权利要求1所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的应用，其特征在于在化学、食品和制药领域中的应用。
【文档编号】C12R1/145GK103849612SQ201410001843
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】江波, 沐万孟, 贾敏, 张涛, 黄敏, 周榴明 申请人:江南大学