猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤：生产用细胞的传代与培养，形成单层细胞；生产用种毒的繁殖，将基础种毒接种于单层细胞培养；单层细胞消化成细胞悬浮液接种于生物反应器中培养；制苗毒液的繁殖，细胞计数结果达到5×106个单位/ml～5×107个单位/ml后，将生产用种毒接种于细胞培养；病毒液的收获。本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-7天，并且相比现有转瓶培养法所生产的猪传染性胃肠炎病毒效价更高；具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定，同时易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模，并且质量易于实现均衡稳定；环境污染少且易于处理。
【专利说明】猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗的方法，可用于工业化生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗，替代传统的转瓶培养法。
【背景技术】
[0002]目前，国内猪传染性胃肠炎病毒疫苗生产都是依靠转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；细胞环境不均一，环境条件不易测量与监控，容易被环境污染；细胞不同批次间的差异大；难以扩大生产；细胞自身被细菌或其它病毒污染而致生产的疫苗或有质量隐患。另外，目前已经有利用生物反应器微载体生产狂犬病疫苗的报道，若能利用生物反应器微载体生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗可以广泛的应用于工业化生产。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体细胞培养生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗的方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案:
[0005]一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤:
[0006]步骤一:生产用细胞的传代与培养:取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层PK15或ST细胞；
[0007]步骤二:生产用种毒的繁殖:在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒接种到`步骤一的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤一中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37°c、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱中吸附lh，然后加入细胞维持液，置于37°C、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75%~80%细胞出现病变时，收获病毒置于-15°C冰箱中，反复冻融细胞三次，此病毒液作为生产用种毒；
[0008]步骤三:PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤一中已形成良好单层ΡΚ15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5X IO5个细胞/ml~5X IO6个细胞/ml的密度接种于生物反应器中进行培养；
[0009]步骤四:制苗毒液的繁殖:观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5 X IO6个细胞/ml~5 X IO7个细胞/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤二中的生产用种毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培养液洗涤生产用种毒2-4次；
[0010]步骤五:病毒液的收获:待微载体上细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置于_20°C反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。[0011]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。
[0012]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述微载体为Cytodexl、Cytodex2> Cytodex3 中的一种。
[0013]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述微载体在使用前需清洗、灭菌，步骤如下:A、用PBS浸泡微载体过夜；B、用PBS清洗微载体3遍；C、用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟，微载体经PBS清洗、高压灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，在反应器中用DMEM清洗微载体。 [0014]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述EDTA-胰酶细胞分散液为含有质量体积分数为0.25%的规格1:250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液，所述的规格1:250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
[0015]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述细胞生长液的配方为:重量分数为90%-98%DMEM液、2%-10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH为
6.8~7.6o
[0016]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述步骤四中的病毒培养液的配方为:重量分数分别是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH 为 6.8-7.6。
[0017]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。
[0018]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述步骤四中的生产用种毒接种量为0.01-0.5M0I，所述的MOI为病毒感染复数。
[0019]作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是:所述的生物反应器设定的参数为培养温度 37°C、pH6.8-7.6、溶氧 30%_60%、搅拌速度 30_60rpm。
[0020]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0021](I)本发明可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-7天，并且相比现有转瓶培养法所生产的猪传染性胃肠炎病毒效价更高，可达到转瓶法的10倍以上。。
[0022]( 2 )应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定，同时易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模，并且质量易于实现均衡稳定，解决了细胞不同批次间的差异大的问题。
[0023](3)应用本方法生产疫苗，环境污染少且易于处理，解决了现有的转瓶培养法在操作过程中容易产生污染，且处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗的方法流程图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
[0026]实施例1:[0027]猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤:
[0028]步骤1:生产用细胞的传代与培养:取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(EDTA-胰酶细胞分散液为含质量体积分数0.25%的规格1:250胰酶、0.02%EDTA的Hank’s液；其中规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶)消化传代，以含质量分数90%DMEM液、10%牛血清、青霉素钠和硫酸链霉素各200单位/ml，pH调整为7.4的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层PK15或ST细胞，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
[0029]步骤2:生产用种毒的繁殖:在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)接种到步骤I的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤I中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使猪传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37°C、体积百分含量5%的二氧化碳培养箱中吸附lh，然后加入细胞维持液(细胞维持液为含有10 μ g/ml胰酶的病毒培养液，即细胞维持液为重量分数90%DMEM液、10%牛血清，10 μ g/ml胰酶，青霉素钠和硫酸链霉素各200单位/ml, PH为7.4)，置37。。、体积百分含量5%的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75%~80%细胞出现病变时，收获病毒置于-15°C的冰箱中，反复冻融细胞三次，使病毒从细胞中充分释放出来，然后分装液体，置_70°C或液氮保存备用,此病毒液作为生产用种毒。
[0030]步骤3:PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤I中已形成良好单层ΡΚ15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5X IO5个细胞/ml~5X IO6个细胞/ml的细胞密度接种于生物反应器中，生物反应器设定培养温度37°C、PH7.4、溶氧量50%、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L ;微载体为Cytodex系列微载体，Cytodex系列微载体包括Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3。微载体在使用前,需清洗、灭菌,具体步骤为:I)称量Cytodex微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟；微载体加入反应器中，用DMEM清洗微载体。
[0031]步骤4:制苗毒液的繁殖:培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5X IO6个细胞/ml~5X IO7个细胞/ml后进行接毒操作,所接入种毒为步骤2中的生产用种毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培养液洗漆生产用种毒4次,病毒培养液配方为:重量分数为90%DMEM液、10%牛血清,青霉素钠和硫酸链霉素各200单位/ml, PH为7.4 ;接种量为0.1MOI ;生物反应器设定参数为培养温度37°C、PH7.4、溶氧50%、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况。
[0032]步骤5:病毒液的收获:待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置_20°C反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。
[0033]病毒液于-20°C冷冻保存备用。
[0034]实施例2:
[0035]猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤:
[0036]步骤1:生产用细胞的传代与培养:取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(EDTA-胰酶细胞分散液为含质量体积分数0.25%的规格1:250胰酶、0.02%EDTA的Hank’s液；其中规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶)消化传代，以含质量分数98%DMEM液、2%牛血清、青霉素钠和硫酸链霉素各200单位/ml，pH调整为7.4的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层PK15或ST细胞，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
[0037]步骤2:生产用种毒的繁殖:在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)接种到步骤I的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤I中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使猪传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37°C、体积百分含量5%的二氧化碳培养箱中吸附lh，然后加入细胞维持液(细胞维持液为含有10 μ g/ml胰酶的病毒培养液，即细胞维持液为重量分数95%DMEM液、5%牛血清，10 μ g/ml胰酶，青霉素钠和硫酸链霉素各200单位/ml，PH为7.0)，置37°C、体积百分含量5%的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75%~80%细胞出现病变时，收获病毒置于-15°C的冰箱中，反复冻融细胞三次，使病毒从细胞中充分释放出来，然后分装液体，置_70°C或液氮保存备用,此病毒液作为生产用种毒。[0038]步骤3:PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤I中已形成良好单层ΡΚ15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5X IO5个细胞/ml~5X IO6个细胞/ml的细胞密度接种于生物反应器中，生物反应器设定培养温度37°C、PH7.0、溶氧量50%、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L ;微载体为Cytodex系列微载体，Cytodex系列微载体包括Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3。微载体在使用前,需清洗、灭菌,具体步骤为:I)称量Cytodex微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟；微载体加入反应器中，用DMEM清洗微载体。
[0039]步骤4:制苗毒液的繁殖:培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5X IO6个细胞/ml~5X IO7个细胞/ml后进行接毒操作,所接入种毒为步骤2中的生产用种毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培养液洗漆生产用种毒4次,病毒培养液配方为:重量分数为95%DMEM液、5%牛血清,青霉素钠和硫酸链霉素各200单位/ml, PH为7.4 ;接种量为0.5M0I ;生物反应器设定参数为培养温度37 °C、PH7.4、溶氧50%、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况。
[0040]步骤5:病毒液的收获:待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置_20°C反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。
[0041]病毒液于_20°C冷冻保存备用。
[0042]半成品检验及制苗、成品检验:
[0043]1、病毒液毒价的测定:将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价。结果表明病毒含量≥ IO8TCID50A).lrnl。
[0044]2、灭活、半成品检验
[0045]无菌检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010版)附录42页进行，无菌生长。[0046]灭活检验:灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，接种PK15细胞或ST细胞，盲传三代，细胞仍无CPE产生。
[0047]3、油佐剂灭活疫苗的配制
[0048]油相制备:油相由下述重量份的组分组成:注射用白油《中华人民共和国兽药典》(2010版)附录51页96份、司本-804份和硬脂酸铝2份。取硬脂酸铝，用少量注射用白油混合，加热融化至半透明状，再与全量司本-80及剩余注射用白油混合均匀，经121°C灭菌15分钟，冷却至室温，备用。
[0049]水相制备:取经检验合格的猪传染性胃肠炎病毒灭活液，按病毒液的4%加入吐温-80乳化I分钟。
[0050]灭活疫苗的制备:按水相和油相为1:3 (体积比)比例进行乳化，10000r/min乳化3~5分钟。
[0051]4、成品检验
[0052]4.1 性状:
[0053]外观:白色乳状液。
[0054]剂型:呈油包水型。
[0055]稳定性:在37°C保存21日或以3000r/min离心15分钟，未破乳。
[0056]粘度:用Iml洁净吸管(上口内径2.7mm、下口内径1.2mm)，吸取25°C左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，在8秒以内。
[0057]4.2无菌检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010版)附录42页进行，无菌生长。
[0058]4.3安全检验:用猪传染性胃肠炎抗体阴性母猪产3日龄哺乳仔猪10头，于后海穴注射疫苗，其中2头，各注射2头份；其余8头，各注射I头份，观察14日，均应无异常临床反应。
[0059]4.4效力检验:符合下列标准之一者判为合格
[0060]( I)检验血清中和抗体用猪传染性胃肠炎抗体阴性母猪产3日龄哺乳仔猪8头，于后海穴注射疫苗I头份,于免疫后14日采血，用中和试验法检验血清中和抗体。8头仔猪应至少7头仔猪阳转，猪传染性胃肠炎中和抗体效价GMT均应≥32。
[0061](2)免疫攻毒上述8头免疫仔猪，于免疫后14日，连同条件相同的对照仔猪8头，各均分为2组，以10_4稀释的猪传染性胃肠炎强毒分别口服攻毒，观察7日。对照组全部发病，免疫组至少保护3头；或对照组3头发病，免疫组全部保护为合格。
[0062]4.5甲醛含量测定:分别按《中华人民共和国兽药典》(2010版)附录40页进行。符合规定。
[0063]尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。
【权利要求】
1.一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一:生产用细胞的传代与培养:取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层PK15或ST细胞； 步骤二:生产用种毒的繁殖:在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒接种到步骤一的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤一中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37°C、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱中吸附lh，然后加入细胞维持液，置于37°C、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75%~80%细胞出现病变时，收获病毒置于-15°C冰箱中，反复冻融细胞三次，此病毒液作为生产用种毒； 步骤三:PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤一中已形成良好单层ΡΚ15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5 X IO5个细胞/ml~5X IO6个细胞/ml的密度接种于生物反应器中进行培养； 步骤四:制苗毒液的繁殖:观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5 X IO6个细胞/ml~5X IO7个细胞/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤二中的生产用种毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培养液洗涤生产用种毒2-4次； 步骤五:病毒液的收获:待微载体上细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置于_20°C反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。
3.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述微载体为 Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3 中的一种。
4.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述微载体在使用前需清洗、灭菌，步骤如下:A、用PBS浸泡微载体过夜；B、用PBS清洗微载体3遍；C、用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟，微载体经PBS清洗、高压灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，在反应器中用DMEM清洗微载体。
5.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述EDTA-胰酶细胞分散液为含有质量体积分数为0.25%的规格1:250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液，所述的规格1:250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述细胞生长液的配方为:重量分数为90%-98%DMEM液、2%_10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8-7.6。
7.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述步骤四中的病毒培养液的配方为:重量分数分别是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，终浓度为200-1000 单位 /ml 的抗菌素，pH 为 6.8-7.6。
8.根据权利要求6或7所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。
9.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述步骤四中的生产用种毒接种量为0.01-0.5MOI。
10.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述的生物反应器设定的参数为培 养温度37°C、pH6.8-7.6、溶氧30%_60%、搅拌速度30_60rpm。
【文档编号】C12N7/00GK103550771SQ201310529342
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】徐宏军, 胡来根, 杨鹏程, 任丽, 王家福 申请人:成都天邦生物制品有限公司