专利名称：融合病毒样颗粒疫苗制备及其疫苗生产方法和使用方法
技术领域：
本发明涉及利用基因工程方法制备融合病毒样颗粒疫苗及其生产方法和激活、提高、调节机体免疫反应的使用方法，是一种新型的蛋白亚单位疫苗制作方法及使用方法。
背景技术：
有多种方法可以预防各种病原体感染，提高机体免疫力是最主要的手段，一般是以接种疫苗而达到的。接种疫苗是预防各种病原体感染的有效措施。常见的病原体有病毒、微生物、真核细胞、寄生虫和环境因子等有机体和分子。目前已有多种方法用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗，减毒活疫苗、重组疫苗，亚单位疫苗和核酸疫苗等。它们的基本作用原理是相同的，即借助与病原体结合的组织相容性蛋白激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。当个体与传染性病原体接触时，其免疫系统能够识别病原体蛋白而产生有效的保护反应抵抗传染。目前所用的许多疫苗就是由从病原体中分离出来的非传染性和低传染性的蛋白或核酸物质所组成。较为安全的疫苗有两类，重组蛋白疫苗和核酸疫苗。
重组蛋白疫苗又称重组亚单位苗，是指将保护性不致病的抗原基因在原核或真核细胞中表达，再以这种生物合成的基因产物制成的疫苗。这种亚单位疫苗只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，不含免疫所不需要的成分，因此有很多优点。首先是安全性好，疫苗中不含传染性材料，接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况，如妊娠动物。其次，这些疫苗减少或消除了常规疫苗或死疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑制原和其它有害的反应原。此外，这种疫苗产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭计划。但此类疫苗存在严重的不足之处，人们已经发现，重组蛋白疫苗难以产生完整的免疫反应，即不产生细胞免疫反应，包括毒性T-淋巴细胞。原因是多方面的。如1)基因片段体外表达不能提供与天然病毒一致的空间构像，从而激活的免疫反应效率低；2)基因重组蛋白的抗原提呈过程往往只是局限于与MHC-II型分子的结合，无法激活细胞免疫活性，从而使多数研制的基因重组疫苗达不到应有的保护水平。目前世界上成功的基因重组疫苗是八十年代初研制的人乙肝疫苗。由于其特殊的蛋白质结构形成的病毒样颗粒，使其成为唯一上市的基因重组疫苗。另外DNA疫苗的出现，给疫苗的发展提供了一个新的希望。它不仅安全，方便，更重要的是，它可以激活体液和细胞双重反应。但是几年的研究表明，DNA疫苗的免疫源性比减毒病毒疫苗低一些(Berzofsky，J.A.Nature Reviews，2001，1209)。所以探索更有效的方法成为今后方向。近年来，免疫学研究发现，空壳的病毒颗粒，即病毒样颗粒作为免疫原，可以提高免疫效率，尤其是在重组蛋白疫苗达不到的激活毒性T-淋巴细胞活性方面，病毒样颗粒可以通过交叉提呈方式激活毒性T-淋巴细胞活性，同时激活高强度的抗体水平。
病毒样颗粒作为载体的研究近年来成为关注的方向之一，如利用VSV-G抗原(Marsac，D.，et al，2002)、HBV-S抗原(Chengalvala，M.V.et al.1999.Vaccine 171035；Netter，H.，et al.2001.J.Virol，752130)、parvovirus(Sedlik，C.，et al，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.947503)、酵母转座子的Ty抗原等(Layton，G.，et al.，1993.J.of Immunol.1511097)。采用病毒样颗粒有许多优势如1)更有效的使抗原提呈；2)非复制型，安全性好；3)不需佐剂；4)可产生细胞免疫反应，尤其是可以激活MHC-1限制性CTL反应(Fehr，T.，et al，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.959477)。所以此技术将被看成有前景的技术。关于病毒样颗粒如何使得抗原激活CTL活性，仍然有许多需要探讨的问题。许多研究表明，纳米至微米的小球结构使得抗原提呈细胞提呈过程与可溶性蛋白不同，如内吞(endocytic)或吞噬(phagocytic)，从而激活不同的MHC分子途径(Lee，I.-H.et al，1996.J.Med.Virol.50145；Schirmbeck，R.1995，J.Immunology，1554676)。
虽然HBV-S抗原可以形成颗粒，并且加载在S抗原上的重组疟疾疫苗已加入临床试验(Bojang，et al.2001.Lancet 3581927)，但是S抗原颗粒所产生免疫反应要远远低于核心抗原。几乎所有HBV感染的病人都会产生针对核心抗原C表位较强的免疫反应(Salfeld，J.，et al，1989.J.Virol.63798)。所以将外源基因融合地表达在核心抗原中所形成的颗粒将有助于外源抗原的展示和免疫系统的激活(Milich，D.R.，and A.McLachlan.1986.Science 2341398)。另外的优势是，核心抗原分子小，只有22kd，有利于基因操作和表达(Koletzki，D.，et al，1997，J.Gen.Virol，782049)。
发明内容
针对上述方向，我们有针对性的分析和筛选了可用于形成病毒样颗粒蛋白的分子小的人乙肝病毒核心抗原为载体，使筛选的靶病毒保护性抗原基因片段融合于人乙肝病毒核心抗原C表位中使其与人乙肝病毒核心抗原共同形成病毒样颗粒一融合型病毒样颗粒。其靶抗原可以呈现其表面而提高免疫的提成，这样不仅可以产生较强的B细胞活性，更重要的是激活T细胞和毒性T细胞活性，使其产生保护性免疫能力。
本发明的技术方案是通过以下措施来达到的融合型病毒样颗粒是通过分子克隆的方法连接入所需抗原基因序列，而得到融合产物。此融合产物经亚克隆到大肠杆菌、酵母菌或CHO细胞系统表达载体后，表达纯化而得到此病毒样颗粒疫苗。经有效配伍佐剂或无佐剂后，免疫动物和人。本发明提供了该疫苗的生产方法和使用方法。
上述融合病毒样颗粒疫苗是利用其中将含有抗原表位的所需抗原的基因序列连接到可形成病毒样颗粒的基因序列中，在此融合处加入连接序列使其连接后而不影响其空间结构和抗原表位的展示。
为了使抗原基因能在人乙肝病毒核心抗原中进行有效地表达并且能够展示在核心抗原之外，经分析人乙肝病毒核心抗原结构、序列和文献得知，在氨基酸78和80位点暴露于颗粒的表面为主要抗原表位。所以将外来抗原克隆与此，将有利于抗原的展示和提呈。本构建的关键在于利用引物设计将使读框与多表位抗原一致，使基因在人乙肝病毒核心抗原中融合表达并展示在表面。
上述融合病毒样颗粒疫苗利用基因工程的方法克隆已知的抗原基因，再与人乙肝病毒核心抗原进行融合并亚克隆于T载体中后测序，序列正确后再亚克隆于表达载体中，并在适当的表达系统中表达。
上述融合病毒样颗粒疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的脱氧核糖核酸(DNA)。
上述人工合成为聚合酶链式反应(PCR)方法上述生物体为大肠杆菌或酵母菌或真核细胞。
上述融合病毒样颗粒疫苗通过以下方法得到克隆于pichia p.酵母表达载体后，通过序列分析和酵母细胞中表达及抗原蛋白测定，将高表达水平的酵母克隆作为疫苗生产母种，经适当的培养液和条件下，培养扩增表达。表达产物经分离和纯化后，以10至2000微克/毫升ml溶于生理盐水中或者纯化后以10至2000微克/毫升ml溶于适当佐剂溶液中，而得到所需要的疫苗免疫的组合物。
其生产方法，按以下步骤进行通过序列分析和真核细胞中表达抗原及蛋白测定，将高表达水平的克隆作为疫苗生产母种，经适当的培养液和条件下，培养扩增表达。表达产物经分离和纯化后，以10至2000微克/毫升ml溶于生理盐水中或者纯化后以10至2000微克/毫升ml溶于适当佐剂溶液中，而得到所需要的疫苗免疫的组合物。
其生产方法，按以下步骤进行通过序列分析和原核细胞中表达抗原及蛋白测定，将高表达水平的克隆作为疫苗生产母种，经适当的培养液和条件下，培养扩增表达。表达产物经分离和纯化后，以10至2000微克/毫升ml溶于生理盐水中或者纯化后以10至2000微克/毫升ml溶于适当佐剂溶液中，而得到所需要的疫苗免疫的组合物。
在上述生产方法中，上述生物体为大肠杆菌或或酵母菌或真核细胞。
上述人工合成为聚合酶链式反应(PCR)方法。
一种上述的融合型病毒样颗粒免疫组合物的使用方法，该使用方法是通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述疫苗免疫的组合物进入机体。
一种上述的融合型病毒样颗粒疫苗免疫的组合物的使用方法，该使用方法是上述疫苗免疫的组合物是被其它物质包裹或混合后进入机体的。
本发明是利用融合型病毒样颗粒接种激活机体完全免疫反应，达到防治病原体感染、抗肿瘤、治疗自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒症状等。按照本发明的融合型病毒样颗粒可与佐剂或不与佐剂混合组成组合物进入细胞，激活细胞内一系列信号而产生完全免疫反应。
本发明的另一个重要方面是提供融合型病毒样颗粒可以通过间接提呈(crosspresentation)增强细胞免疫水平，同时可以激发高强度的抗体水平。由于在间接提呈作用下，融合型病毒样颗粒疫苗可以激活更为强烈的完全免疫反应。
本发明是通过含融合型病毒样颗粒疫苗直接导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织来激活有效的系统免疫和粘膜免疫反应抵抗外来病原体侵入。
本发明利用导入机体此融合型病毒样颗粒疫苗激活机体完全免疫反应，预防病原体传染。抗原性物质可以是病原体相关的蛋白，内源性和外源性蛋白，这里所述的发明指此组合物来达到抵御携带抗原性物质病原体的感染，而得到保护的目的。
本发明通过此融合型病毒样颗粒疫苗诱发机体的免疫发反应，识别快速增殖细胞的特异性抗原性物质，产生专一性的细胞毒性免疫反应，清除携带有抗原性物质的细胞，达到对抗细胞失调类疾病，如肿瘤、癌症的目的。
本发明通过此融合型病毒样颗粒疫苗诱发机体的免疫反应，识别参与自主免疫反应细胞上的特异性靶蛋白，产生专一性的细胞毒性免疫反应，清除携带有抗原性物质的细胞，达到治疗自主性免疫疾病的目的。
本发明通过此融合型病毒样颗粒疫苗诱发机体的免疫反应，中和具有抗原决定簇的有害蛋白，达到清除毒素作用的目的。
通过本融合型病毒样颗粒疫苗激发机体产生完全免疫反应，包括体液免疫反应和细胞免疫反应，其中细胞毒性T细胞反应起重要的作用。研究已经证实了通过此免疫方法细胞所产生的靶抗原在体内的被清除。当抗原性物质降解成小肽，被MHC-1分子结合，递呈到细胞表面，这种MHC-I抗原组合物能够有效地刺激CD8T细胞，产生细胞毒性T细胞反应(即杀伤T细胞反应)，该反应是机体抵御病原体和清除有害细胞的关键。此免疫方法比单独使用蛋白质抗原或蛋白质抗原加佐剂接种更能有效地产生特异性抗体，能有效地激发特异性细胞毒性T细胞反应。
因此，本融合型病毒样颗粒疫苗比灭活的或失活的病毒疫苗、蛋白疫苗、肽类亚单位疫苗和核酸疫苗等接种方法，更为安全有效的保护机体抵御病原体感染、抗肿瘤和治疗自主免疫疾病。
本融合型病毒样颗粒疫苗能够有效的激发完全免疫反应，又避免使用感染性的制剂，载体和不安全的遗传物质。其它常规免疫接种技术(除了核酸疫苗以外)，如果不使用感染性制剂就不会激活细胞毒性T细胞反应，因此灭活或失活疫苗，亚单位疫苗接种均不产生完全的免疫反应。本融合型病毒样颗粒疫苗能有效地克服常规免疫接种技术的这些不足。
本发明针对性的致病病原体有病毒、原核细胞、真核细胞。真核细胞病原体包括单细胞致病病原体和多细胞寄生虫类。
本发明为保护机体抵抗病毒性病原体感染提供了一种有效的方法。病毒性病原体包括呼吸道病毒(冠状病毒、流感和轮状病毒)、疮疹病毒(德国麻疹、水痘、牛痘、天花、带状疮疹等)、中枢神经系统病毒(沅病毒)、免疫系统病毒(艾滋病毒)、生殖系统病毒(尖锐湿疣)、畜牧病毒(口蹄疫病毒、猪瘟)、和一切可能的致病性病毒。
本发明的技术效果利用本发明提供的融合型病毒样颗粒疫苗及生产和使用方法不仅使其疫苗能够有效的提高激发完全免疫反应能力保护机体抵抗病原体侵染，而且制备简单无需复杂设备和操作简单，并且易于实施，其免疫效果超过未使用本发明的疫苗。
图1，融合型病毒样颗粒克隆方案。A，图中代表了人乙肝病毒核心抗原经连接序列与口蹄疫VP1抗原融合示意图。其中人乙肝病毒核心抗原氨基酸1-78为a片段，VP1为b片段，人乙肝病毒核心抗原氨基酸80-144为c片段；B，是3段PCR反应引物的位置示意图。其中引物2、3、4和5含有连接序列序列。引物1和6含有用于克隆到载体的内切酶位点。
图2融合型病毒样颗粒PCR扩增。使用图1中提到的引物对a、b和c片段分别在高温聚合酶作用下在人乙肝病毒核心抗原和口蹄疫VP1基因为模板进行PCR扩增。扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳后进行观察拍照从图中可看出a＝250bp、b＝600bp和c＝250bp大小三条条带。将三条带从凝胶中取出后混合一起，再利用引物1和6进行PCR扩增。扩增后的产物在琼脂糖凝胶电泳后进行观察有1100bp和500bp的两条带。其中1100bp＝abc产物，500bp＝ac产物。
图3融合型病毒样颗粒PCR产物的克隆构建。将上述PCR abc和ac产物分别构建的于pMD18-T质粒中，经限制性内切酶EcoR I和XbaI双酶切后，得到约为2.4kb和1100bp的两条条带(1)，或2.4kb和500bp的两条条带(2)。分别代表是pMD18-T和abc产物及pMD18-T和ac产物。说明重组质粒为已连接有融合型病毒样颗粒。
图4酵母表达质粒构建。为使鉴定正确的abc和ac产物可以在酵母中表达，将abc和ac产物使用限制性内切酶EcoR I和XbaI双酶切出所需片段，再分别构建于酵母表达质粒superY中的EcoR I和XbaI位点上。重组质粒再经EcoR I和XbaI双酶切，得到约为7.5kb和1100bp的两条条带(1)或7.5kb和500bp的两条条带(3)。说明重组质粒为已连接有abc和ac产物的酵母表达质粒。
图5产物鉴定。收集经酵母发酵后的上清液，在10％SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳后，经考马氏亮蓝染色后进行观察，abc产物有56kd(3，4)和ac产物有42kd大小的条带(5，6)。而对照中无任何条带(1和2)。说明融合型病毒样颗粒abc和病毒样颗粒ac在酵母中表达。
图6Western blot对产物鉴定。利用抗口蹄疫VP1的抗体或抗人乙肝病毒核心抗原抗体分别于转移后的硝酸纤维素膜上反应，在有HRP标记的第二抗体下，使其显色。在与抗口蹄疫VP1的抗体反应后，56kd的abc产物呈现阳性而42kd的ac为阴性(A)；在与抗人乙肝病毒核心抗原的抗体反应后，abc和ac产物都显阳性(B)。从而证明酵母表达abc和ac产物都正确。
图7电镜对产物鉴定。图A显示，酵母表达ac为病毒样颗粒，其大小为30-40nm；图B显示，酵母表达abc为融合型病毒样颗粒，其大小为50-60nm，其中带有外圈小泡结构，而在ac中没有。从而证明酵母表达abc为融合型病毒样颗粒。
具体实施例方式
借助以下实施实例对本发明作进一步描述下面这些实施实例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述本发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方式。实施列1.引物的设计与合成根据人乙肝病毒核心抗原和口蹄疫VP1的序列，利用DNAMAN软件设计出扩增融合型病毒样颗粒序列的6个引物。所设计的引物为引物P1序列为aagaattc ggc atg gac att gac ccg tat aaa引物P2序列为ACC TCC ACC TCC GGA ACC gtc ttc caa att act tcc c引物P3序列为GGT TCC GGA GGT GGA GGT acc acc tct gcg ggt gag引物P4序列为ACC TCC ACC TCC GGA ACC cag aag ctg ttt tgc ggg引物P5序列为GGT TCC GGA GGT GGA GGT tcc agg gaa tta gta gtc ag引物P6序列为ttgaattc tta aac aac agt agt ttc cgg aag以上引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。实施列2.融合型病毒样颗粒序列PCR扩增依照TaKaRa exTaq Kit操作指南进行，PCR反应用引物P1和P2，P5和P6对人乙肝病毒核心抗原基因扩增，而P3和P4对口蹄疫VP1的基因扩增。扩增参数为94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃7分钟。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图2A)。将三条带从凝胶中取出后混合一起，再利用引物P1和P6进行PCR扩增。扩增参数为94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒，35个循环；72℃7分钟。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图2B)实施列3.融合型病毒样颗粒PCR产物的克隆构建将回收的abc和ac片段与pMD18T载体经EcoRI和XbaI酶切后，在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜。连接产物转化感受态细胞。挑取转化菌落，进行增菌培养，小提质粒后用EcoRI、XbaI酶切鉴定为构建正确的pMD18T-abc和pMD18T-ac(图3)。实施列4.序列测定及序列分析将鉴定正确的pMD18T-abc和pMD18T-ac重组质粒精制提纯，在377全自动测序仪上用BcaBEST primer RV-M和BcaBEST primer M13-47对abc和ac产物进行双向DNA序列测定。用PE公司SeqEdv1.0.3软件对序列进行分析。实施列5.酵母表达载体的构建将粒精制提纯的质粒用限制性内切酶EcoRI和XbaI切出，在琼脂糖凝胶电泳中分离后并用试剂盒回收的含有abc和ac基因片段，将其克隆于酵母表达质粒superY中同样的EcoRI和NotI位点上，并用T4 DNA连接酶连接得到superY-abc和superY-ac。实施列6.酵母SMD1168菌转化根据以公知的锂盐法(LiCl)，制备酵母感受态细胞。取50μl的Pichia pastorisSMD1168菌，接种于50ml YPD中，30℃振荡培养过夜，至OD600≈0.8-1.0(大约108细胞/ml)；收获细胞，取1.5ml过夜培养物，4000xg离心5分钟，1ml灭菌水洗，于室温，1500xg离心10分钟，弃上清；用1ml 100mM LiCl重悬，5000xg离心5分钟，沉淀细胞，弃上清；用400μl 100mM LiCl重悬细胞。将LiCl-细胞溶液，5000xg离心5分钟，弃上清。对于每一次转化样品，依次加入以下试剂240μl 50％ PEG、36μl 1M LiCl、25μl 2mg/ml单链DNA、10μg连接DNA用AvrII切线性化后，溶于50μl无菌水，振荡，使沉淀完全混匀；于30℃，无摇振，孵育30分钟，在42℃水浴休克20-25分钟，6000-8000rpm离心1分钟，弃上清；用1mlYPD重悬沉淀，30℃振荡(约200rpm)培养3小时后，取25-100μl培养物涂布在YPD平板上，30℃孵育2-3天。实施列7.重组克隆的筛选质粒线性化转化SMD1168菌后，经平板筛选得到相应的重组克隆pMD18T-abc或pMD18T-ac(图5)。实施列7.重组克隆的表达将筛选出来的重组克隆接种到10ml YPD，30℃振荡培养过夜；取0.1ml的过夜培养液接种到含有50ml YPD的250ml的锥型瓶中，30℃振荡培养；第三天，取1ml表达培养液到1.5ml EP管中，室温，12000rpm离心3分钟。转移上清到离心管，保存上清于-80℃。实施列7.SDS-PAGE检测abc和ac产物在上述表达发酵后，取20μl上清在样品变性液中100℃处理后，置于10％SDS-PAGE胶电泳，电泳后用考马斯亮蓝R-250染色，并用凝胶成像系统照相(图6)。实施列8.Western Blot法检测abc和ac产物的正确性为进一步鉴定上述电泳中的条带是否是abc和ac产物，利用抗口蹄疫VP1的抗体或抗人乙肝病毒核心抗原的抗体与其作用将可以知道。将上述10％SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳转分别移到两张硝酸纤维素膜上后，利用抗口蹄疫VP1的抗体或抗人乙肝病毒核心抗原抗体分别于转移后的硝酸纤维素膜上反应，在有HRP标记的第二抗体下，使其显色。图中可以看到在与抗口蹄疫VP1的抗体反应后，56kd的abc产物呈现阳性而42kd的ac为阴性(A)；在与抗人乙肝病毒核心抗原的抗体反应后，abc和ac产物都显阳性(B)。从而证明酵母表达abc和ac产物都正确。实施列9.电镜对产物鉴定。
为进一步鉴定上述酵母表达abc和ac产物是病毒样颗粒，利用电镜对其产物进行观察是最为直接的手段。图A显示，酵母表达ac为病毒样颗粒，其大小为30-40nm；图B显示，酵母表达abc为融合型病毒样颗粒，其大小为50-60nm，其中带有外圈小泡结构，而在ac中没有。从而证明酵母表达abc为融合型病毒样颗粒。
权利要求
1.一种利用基因工程方法制备融合病毒样颗粒疫苗及其生产方法和激活、提高、调节机体免疫反应的使用方法，是一种新型的蛋白亚单位疫苗制作方法及使用方法。
2.如权利要求1所述的融合病毒样颗粒疫苗，其特征在于上述疫苗是人工合成融合基因再通过生物体生产而成的具有三维构像的蛋白质。
3.如权利要求2所述的融合病毒样颗粒疫苗，其特征在于上述人工合成为聚合酶链式反应方法。
4.如权利要求2所述的融合病毒样颗粒疫苗，其特征在于上述生物体为大肠杆菌或酵母菌或真核细胞。
5.如权利要求2所述的融合病毒样颗粒疫苗，其特征在于上述三维构像的蛋白质是类似于病毒颗粒为主要特征的。
6.如权利要求1或2或3或4或5所述的融合病毒样颗粒疫苗，其特征在于该疫苗通过以下方法得到通过人工合成融合基因、分子克隆、序列分析，经大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞培养、扩增和表达后，对表达融合融合病毒样颗粒蛋白测定，将高表达水平的细胞株放大培养，分离纯化表达产物。
7.一种融合病毒样颗粒疫苗的生产方法，其特征在于该生产方法是通过人工合成融合基因、分子克隆、序列分析，经大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞培养、扩增和表达后，对表达融合融合病毒样颗粒蛋白测定，将高表达水平的细胞株放大培养，分离纯化表达产物。制备疫苗方法为将20至2000微克/毫升ml溶于佐剂中混合，或溶于生理盐水中，得到所需要的疫苗。
8.如权利要求6所述的融合病毒样颗粒疫苗的生产方法，其特征在于上述疫苗是人工合成的或者体外克隆的再通过生物体生产而成的脱氧核糖核酸重组子，再克隆于表达载体上。
9.如权利要求7所述的融合病毒样颗粒疫苗的生产方法，其特征在于上述表达载体具有在大肠杆菌或酵母菌或真核细胞在进行蛋白质表达特征。
10.一种如权利要求1或2或4或5或6所述的融合病毒样颗粒疫苗的使用方法，其特征在于该使用方法是通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述融合病毒样颗粒疫苗进入机体；或者是上述融合病毒样颗粒疫苗是被其它物质包裹或混合后进入机体的。
全文摘要
一种利用基因工程方法制备融合型病毒样颗粒和利用其制备疫苗的生产方法及其激活和提高机体免疫反应的使用方法。其融合型病毒样颗粒含有可形成病毒样颗粒的蛋白作为载体与靶病毒保护性抗原融合而成。具体为利用形成病毒样颗粒的人乙肝病毒核心抗原为载体，使靶病毒保护性抗原基因片段融合其中使其与人乙肝病毒核心抗原共同形成融合型病毒样颗粒，通过与佐剂和无佐剂混合后成为疫苗。其靶抗原可以呈现其表面而提高免疫的提成，这样不仅可以产生较强的B细胞活性，也可激活T细胞，使其产生保护性免疫力。其使用方法是注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理及化学介导的方法使上述疫苗进入机体。
文档编号C12N15/33GK1481898SQ0313725
公开日2004年3月17日 申请日期2003年9月9日 优先权日2003年9月9日
发明者王宾, 俞庆龄, 王 宾 申请人:中国农业大学