用于登革病毒疫苗的方法与组合物的制作方法
【专利说明】
[00011优先权声明
[0002] 本申请依35 U.S.C.§119(e)要求2013年6月26日提交的美国临时申请系列号61/ 839，687的权益，其全部内容经此引用并入本文。
[0003] 政府支持声明
[0004] 以由国家健康研究所（National Institutes of Health)授予的Grant No.U54 AI057157下的政府支持作出本发明。美国政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
[0005] 本发明涉及由单一来源诱导针对超过一种登革病毒血清型的中和抗体的登革病 毒疫苗。
[0006] 发明背景
[0007] 登革是一种蚊媒黄病毒，正在以史无前例的速度传播并已经在超过50个国家发展 成为主要的健康与经济负担。针对所有四种DENV血清型进行防护的现有DENV疫苗必须以四 种病毒或四种重组蛋白的"四价"制剂形式递送(各自旨在提供针对该血清型的防护）。还不 知道在四价鸡尾酒中血清型的正确组合以实现平衡的抗体应答，近来在泰国进行的大型2B 期试验中最先进的四价减毒活嵌合病毒未能提供临床上有意义的防护也凸显了这一点 (Sabchareon A等人，2012)。病毒干扰被认为促进了失败，因为一种或更多种病毒血清型胜 过其它病毒血清型。该DENV-1/3和DENV 3/1嵌合病毒是呈现由来自DENV-I与DENV-3免疫个 体的中和抗体识别的表位的单一病毒。这表明，单一病毒应当能够立刻引发针对两种血清 型的中和抗体，用一种病毒(DENV-I/3或DENV-3/1)代替两种病毒(DENV-I和3)。
[0008] 附图概述
[0009] 图1A-B.对于DENV-1/3突变体，将来自DENV3的EDI-II铰链移植到DENV-I背景 (WestPac'74)中，产生DENV-3/l铰链突变体。使用DENV3特异性人mAb5J7定义该EDI-II铰 链。A)针对单克隆抗体5J7测试所得病毒rDENV-1/3。该图显示了 DENV-I并未被5J7中和，而 DENV-3被5 J7中和。仅含有该DENV-3EDI/II铰链的rDENV-1/3在等效于DENV-3中和浓度的浓 度下被5J7中和。这表明该5J7表位成功移植到DENV-I中。B)该图块(panel)显示DENV-3并未 被mAb 1F4中和，DENV-I被1F4中和，并且rDENV-1/3也被中和，表明1F4仍可以结合到该嵌合 病毒上并中和该嵌合病毒。
[0010] 图2A-B.该图显示了针对DENV-l、DENV-3和铰链嵌合病毒WestPac-3001铰链 (rDENV-1/3)测试的初次DENV-I和DENV-3人免疫血清。该Y轴显示了中和组织培养中50 %的 输入病毒所需的免疫血清的稀释倍数。更高的值表示更有效的血清。A)DENV-1初次免疫血 清有效地中和DENV-I，但是不能中和DENV-3。rDENV-1 /3在类似于DENV-I的浓度下对被 DENV-I免疫血清中和敏感，表明与亲代DENV-3病毒不同，该嵌合病毒显示被DENV-I免疫血 清识别的表位。B)DENV-3初次免疫血清不中和DENV-I，但是中和DENV-3 ^DENV-1/3在类似 于DENV-3的浓度下被DENV-3初次免疫血清中和，表明该嵌合病毒rDENV-1/3保存了 DENV-3 人免疫血清中的DENV-3抗体所靶向（targeted)的关键DENV-3表位。*表明未被中和。
[0011] 图3.该图显示了168七?&(：'74 3001-铰链在恒河猴中感染后第28、60、90、120和180 天引发广泛交叉-中和抗体。Y轴显示如上的中和抗体效价。X轴显示各种病毒血清型。各绘 制点是针对给定血清型对单一恒河猴的中和效价。贯穿点的各个群簇的中心线是针对各种 血清型对各组猕猴的几何平均中和效价。须状线显示了平均值的标准误差。各个时间点 (28、30、60、90、120、180天)显示了针对所有四种血清型的广泛交叉-中和抗体应答。
[0012] 图4A-B.对于DENV-3/1突变体，将通过来自DENVl (WestPac ' 74)的单克隆抗体1F4 足迹所限定的EDI-II铰链移植到DENV-3背景（3001)中，产生DENV-1/3铰链突变体。对三种 不同的病毒（1F4S、1F4R和1F4E)进行该移植，各个变体代表更大的表位区。将来自rDENV-3 的EDI-II铰链置入重组体rDENV-1病毒。该图显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)数据，按光 密度(OD)计的抗体的相对结合在Y轴上，提高的抗体浓度在X轴上。A)mAb 1F4结合到3001-1?43、1^阳。针对该嵌合病毒的上升曲线显示该抗体的结合，这与不结合11^13]^4的亲代 3001相反。B)mAb 5J7结合到亲代3001、3001-1?43、1^阳。在这些病毒中保存了517结合，而 表位供体icWestPac' 74不结合5J7。
[0013] 图5A-B.该图显示了针对DENV-I、DENV-3和铰链嵌合病毒30(U-1F4E测试的初次 DENV-I和DENV-3人免疫血清。Y轴显示了中和组织培养中50%的输入病毒所需的免疫血清 的稀释倍数。更高的值表示更有效的血清。A)DENV-1初次免疫血清有效地中和DENV-I，但是 不能中和DENVU001 1F4E在类似于DENV-I的浓度下对被DENV-I免疫血清中和敏感，表明 与亲代DENV-3病毒不同，该嵌合病毒显示被DENV-I免疫血清识别的表位。B)DENV-3初次免 疫血清不中和DENV-I，但是中和DENV-3。3001 1F4E在类似于DENV-3的浓度下被DENV-3初次 免疫血清中和，表明该嵌合病毒3001 1F4E保护了DENV-3人免疫血清中的DENV-3抗体所靶 向（targeted)的关键DENV-3表位。
[0014] 图6.3001-1F4E在恒河猴中的免疫原性。仅提供了一个时间点，显示广泛交叉-中 和抗体，与对WestPac-3001铰链所发现的一致。
【发明内容】
[0015] 本发明提供一种包含登革病毒E糖蛋白骨架的嵌合登革病毒E糖蛋白，所述登革病 毒E糖蛋白骨架包含引入被可与不同于该登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革 病毒血清型反应的抗体识别的表位的氨基酸置换。在一个实施方案中，该登革病毒E糖蛋白 骨架来自登革病毒血清型1，并且在一个实施方案中，该登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病 毒血清型3。在一些实施方案中，该抗体可与登革病毒血清型3反应(例如单克隆抗体5J7)， 并且在其它实施方案中，该抗体可与登革病毒血清型1反应(例如单克隆抗体1F4)。
[0016] 本发明进一步提供了一种嵌合登革病毒E糖蛋白，包含以下氨基酸序列：
[0017] MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLCIEAKISNTTTDSRCPTQ GEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFKCVTKIEGKWQYENLKYSVIVTVHTCDQHQVGNE TTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGALTLDCSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFLDLPLPffTSGASTSQETff NRQDLLVTFKTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYVMCTGSFKL EKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTDKEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEK ALKLSffFKKG
[0018] 本文中还提供的是一种嵌合登革病毒E糖蛋白，包含以下氨基酸序列：
[0019] MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELFKTEVTNPAVLRKLCIEGKITNITTDSRCPTQ GEAVLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQCLEPIEGKVVQYENLKYSVIVTVHTCDQHQVGNE TTEHGTIATITPQAPT SEIQLTDYGALGLECSPRTGLDFNEMILLTMKNKAffMVHRQffFFDLPLPffT SGATTETPTff NRKELLVTFKNAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYAMCTNTFVL KKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDN ALKINWYKKG
[0020] 在本文中附加提供的是包含本发明的E糖蛋白的黄病毒颗粒或病毒样颗粒(VLP)。
[0021] 在本文中还提供了编码本发明的E糖蛋白的分离核酸分子，以及编码本发明的黄 病毒颗粒或VLP的分尚核酸分子。
[0022] 本发明还提供了在可用于制药的载体中包含本发明的E糖蛋白的组合物，并提供 了在可用于制药的载体中包含本发明的核酸分子的组合物。
[0023] 此外，本发明提供了在受试者(例如需要其的受试者）中产生对登革病毒的免疫应 答的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明 的核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
[0024] 本发明还提供了在需要其的受试者中治疗登革病毒感染的方法，该方法包括向该 受试者施用有效量的本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、任意本发明的核酸分子和/ 或本发明的组合物及其任意组合。
[0025] 本文中附加提供的是在受试者(例如需要其的受试者）中预防登革病毒感染的方 法，包括向该受试者施用有效量的本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、任意本发明的 核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
[0026] 本文中还提供了保护受试者(例如需要其的受试者)免受登革病毒感染的影响的 方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、任意本发明 的核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
[0027] 本发明进一步提供了本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的核酸分子 和/或本发明的组合物，用于制造在受试者中产生对登革病毒的免疫应答的药物，用于在需 要其的受试者中治疗登革病毒感染、用于在受试者中预防登革病毒感染和/或用于防止受 试者免受登革病毒感染的影响。
[0028] 本文中还提供的是本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的核酸分子 和/或本发明的组合物用于在受试者中产生对登革病毒的免疫应答，用于在需要其的受试 者中治疗登革病毒感染、用于在受试者中预防登革病毒感染和/或用于防止受试者免受登 革病毒感染的影响的用途。
[0029] 发明详述
[0030] 本发明基于以下预料不到的发现:限定DENV血清型的表位区可以转移到不同DENV 血清型的蛋白骨架中以产生含有两种血清型的抗体靶标的嵌合分子，由此充当可以由单一 来源诱导针对两种不同DENV血清型的中和抗体的二价疫苗。由此，在一个实施方案中，本发 明提供了构建包含引入被可与不同于该登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病 毒血清型反应的抗体识别的表位的氨基酸置换的嵌合登革病毒E糖蛋白骨架的平台。
[0031] 在一些实施方案中，该登革病毒E糖蛋白骨架来自于登革病毒血清型1。在一些实 施方案中，该登革病毒E糖蛋白骨架可以来自于登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革 病毒血清型4。
[0032] 在一些实施方案中，可与不同于该登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登 革病毒血清型反应的抗体是可与登革病毒血清型3反应的抗体。此类抗体的非限制性实例 是单克隆抗体5J7。
[0033] 在其它实施方案中，可与不同于该登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登 革病毒血清型反应的抗体是可与登革病毒血清型1、登革病毒血清型2或登革病毒血清型4 反应的抗体。
[0034] 要理解的是，可以使用用于该登革病毒E糖蛋白骨架的第一登革病毒血清型和作 为识别引入到该E糖蛋白骨架中的表位的抗体的靶标的第二登革病毒血清型的任意组合， 只要该第一登革病毒血清型与该第二登革病毒血清型不同（即并非相同的血清型）。
[0035] 在一些实施方案中，本发明的嵌合登革病毒E糖蛋白可以包含以下氨基酸序列、基 本由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
[0036] We s tPac74_3001 铰链（rDENV-1 /3)
[0037] MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEATQLATLRKLCIEAKISNTTTDSRCPTQ GEATLVEEQDTNFVCRRTFVDRGWGN