专利名称：猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联 疫苗。具体地说，是通过细胞培养，经甲醛灭活制备的三联灭活疫苗。属 于生物工程领域。
背景技术：
猪"(专染十生胃肠炎病毒(porcine transmissible gastro'enteritis virus, TGEV) 为冠状病毒科、冠状病毒属的成员。TGEV病毒可感染所有年龄的猪，尤其 是引起两周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(通常100%)，是目前在 世界范围内广泛存在的一种猪高度接触性烈性肠道传染病，常常在猪场反 复发生和流行，给养猪业带来极大危害(Pensaert M B.Disease of Swine.Seventh edition.Iowa State University Press.USA.1992 ， 305-338)。 目前对该病的防治尚无特别有效的手段。可行的治疗方法仅是对症治疗， 减少饥饿、脱水和酸中毒。关于TGEV的免疫预防报道较多，既有使用TGEV 强毒或弱毒的主动免疫，也有词喂含TGEV抗体乳汁的被动免疫(Porter P.， Allen W.D.Classes of immunoglobulins related to immunity in the pig: A review丄AM.Vet.Med,Assoc.1972， 160: 511-518)，还有新型亚单位疫苗、 重组活载体疫苗等。鉴于TGEV在肠道内吸附和增殖，猪传染性胃肠炎发 生与否与肠道局部免疫水平的高低密切相关，因而肠道的局部免疫对防治 TGEV尤为重要，分泌型IgA水平的高低往往反映免疫的效果，目前使用的 TGEV疫苗免疫猪体后血清抗体水平可能很高，而肠道局部免疫水平较差， 不能达到阻止TGEV感染的目的。而乳汁免疫虽能保护初生仔猪抵抗TGEV
3的感染，但断乳后即失去保护力。
猪流行性腹泻(porcine Epidemic Diarrhea, PED)是一种急性、高度接触 性的传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率为特征。该 病70年代初首先发现于英国和比利时。1976年，爆发了类似TGE的急性 腹泻，已排除了 TGEV作为病原的可能，也不是其它已知肠治病性病原， Wood把这次爆发的腹泻称为腹泻II型，以便与70年代初发生的腹泻(I 型)区别。1978年Pensaert等发现一种类冠状病毒的病原与n型腹泻爆发 有关。实验表明I型和II型腹泻的发生是由相同的冠状病毒引起的，即 (porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)，故把这种腹泻称为猪流行性腹泻。
TGE和PED在病毒抗原、临床症状、流行病学极其相似，唯免疫学和 血清学相互没有交叉反应。PED是独立的猪急性肠道传染病。PED流行主 要发生在冬季，-病毒存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，PEDV随粪便排出 后，经口途径自然感染。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%， 尤其是哺乳仔猪受害最为严重，母猪发病率为15-90%。PED单一发生或PED 和TGE混合感染发病。
猪轮状病毒(Porcine Rota virus)是由呼肠孤病毒科(Reoviridae)的轮状 病毒属(Rotavirus)，可引起幼龄猪的急性消化道传染病。幼猪的主要症状为 厌食、不安，偶尔会出现呕吐。重症猪在发病1 4小时后出现大容量腹泻， 排水样粪便，颜色为黄色到白色，含有絮状物。腹泻可持续3 5天，在腹 泻期间，仔猪出现脱水和死亡，死亡率可达50% 100%。流行病学调查显 示，猪群中轮状病毒的带毒率非常高，中猪和大猪多为亚临床感染和隐性 感染，即只携带病毒但不发病，发病的只是仔猪。因此说轮状病毒感染只 是影响仔猪成活率的一种传染病。
目前，猪传染性胃肠炎(TGE)、猪流行性腹泻(PED)和轮状病毒(RV) 腹泻是危害养猪生产的3个主要病毒性腹泻病1。PED和TGE是由病毒引
4起的导致仔猪高死亡率、所有猪水样腹泻的严重传染病，用任何抗生素和 中西药药物治疗均无效2。轮状病毒是一个人兽共患病，在猪群中感染率
很高。目前临床上很难区分这3种病，而且有时呈混合性感染31。由于临 床上主要采取抗生素类药物治疗该病，其治疗效果不是很理想，且这三种 疾病发病急速，出现腹泻后，仔猪大多由于腹泻而脱水，很快就会由于衰 竭而死亡。因此在生产中急需一种能够预防三种病并发的特效疫苗，而猪 传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联疫苗就是具有上述优'点的 特效三联苗。
发明内容
本发明第一目的提供一种制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮 状病毒三联疫苗的方法，用以预防临床上3种病并发感染，解决当前无有 效药物治疗的困惑。
本发明所述的制备方法，包括以下步骤
1) 将已长成90%单层的宿主细胞系分别接种猪传染性胃肠炎病毒、猪
流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，并加入细胞维持液，在37"C下培养；
2) 当细胞病变(CPE)达到75n/。以上后，收集病毒。可保存于-2(TC，备用；
3) 将各病毒按1(T"的TCID5o以1:1:1混合，同时加入弗氏完全佐剂和 免疫加强剂，37'C甲醛灭活24h;
4) 加入油佐剂配制成水一油一水剂型的疫苗。
在一个具体实施方案中，用于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)接种培养的宿 主细胞系是猪睾丸细胞(ST)细胞系、用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)接种培 养的宿主细胞系是Vero细胞系、用于轮状病毒(RV)接种培养的宿主细胞系 是Mac-145细胞系。由于ST细胞对TGEV较敏感，与PK-15细胞系相比， 其滴度高于PK-15细胞系，因此用ST细胞培养TGEV,这将是提高TGEV 滴度的一个很好的细胞培养方法。其中，所述的猪睾丸细胞ST细胞可购自
5中国兽医监察所，经检验过无支原体和外原病毒污染。在一个优选实施方
案中，ST细胞也可选自本申请人自行保藏的ST细胞(Genbank accession NO. CRL1756)。该细胞系与常规的ST细胞相比，具有更高的效果。Vero细胞 系和Mac-145细胞系本公司保藏。
在一个具体实施方案中，传代细胞培养中使用的血清是南京苏邦血清。 由于在传代细胞培养中，细胞提前脱落，生长缓慢，状态不f!::，多数由血 清引起，这与血清品种和维持营养液中血清的浓度有关。因此，在一个优 选方案中，选用南京苏邦血清，并经过56t:灭活(以及无l萄过滤等处理)， 效果更好。在另一个具体实施方案中，所述的细胞维持液为MEM培养基(购 自GIBCO)，用来培养TGEV。因此，在一个优选实施方案中，在使用MEM 培养基前，将每代9.4克MEM粉剂、2.2克NaHC03溶于1L水中，调解 PH值至7.2备用。再往每升所配制好的MEM培养基中加入20ml南京苏邦 血清(经检测BVDV为阴性)，就变为细胞维持液。其中，对细胞维持液 中MEM培养基进行无齒过滤处理，避免了细菌污染，不破坏MEM培养基 中的营养成分；使用EDTA-胰蛋白酶消化单层细胞，有利于细胞分散。
技术效果
本发明具有以下优点和积极效果
1. 猪睾丸细胞(ST)购自中国兽医监察所，经检验过无支原体和外原病毒 污染。
2. Vero细胞系和Mac-145细胞系本公司保藏。
3. 在培养传代细胞中，对细胞维持液中MEM培养基进行无I省过滤处理， 避免了细菌污染，不破坏MEM培养基中的营养成分；
4. 使用EDTA-胰蛋白酶消化单层细胞，有利于细胞分散；
5. 在传代细胞培养中，选用优质的南京苏邦血清，有利于形成致密，折光
6性强的单层细胞。
6. 通过该方法所制备的灭活疫苗，性状稳定，安全性良好，在免疫期内攻毒保护率高，具有安全可靠的特点。
7. 三种病毒混合感染猪时，无抗原交叉反应，无抗体抑制现象产生。
8. 预期临床应用效果，无论是肉猪和妊娠母猪免疫后应15 d达到较高的免疫水平,免疫有效期超过6个月。妊娠母猪所产仔猪可获得高水平的被动免疫保护。
9. 不会产生药物残留，由于三联疫苗的半衰期短，代谢较快，在体内没有蓄积作用，没有药物残留。可以生产出高质量、绿色的猪肉产品。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例l:接种病毒的细胞系的培养
将己长成90%单层的ST细胞接种TGEV , 37'C吸附lh，加入维持液。37°C培养48-72h， CPE达75X以上时收获。-20°。保存。
将已长成90%单层的Vero细胞接种PEDV ， 37。C吸附l h,加入维持液。37°C培养48-72h， CPE达75X以上时收获。-20°。保存。
将已长成90%单层的Macl45细胞接种猪轮状病毒，37。C吸附l h，加入维持液。37°C培养48-72h， CPE达75X以上时收获。-20。C保存。
实施例2:病毒的接种和培养
将各病毒按10—65的TCID5o等量混合，37"C甲醛灭活24 h。加入油佐剂E制成水一油一水剂型的疫苗。整个过程控制及成品检验均严格按照《规程》标准进行。
7实施例3:三联疫苗的疗效
将疫苗按不同剂量免疫50日龄肉猪10头/组，2 mL/头份，3 mL/头份。ELISA测定免疫抗体水平变化情况。
4 mL /头份剂量免疫产前30 d的母猪5头。ELISA测定母猪主动免疫及所产仔猪被动免疫抗体水平变化情况4。
在实验室试验结束后，进行田间试验，调査疫苗应用的保护率及发病率。
参考文献钱永清，闻人楚，许大新，等.猪流行性腹湾病毒的分离培养与鉴定[J].上
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病毒三联苗免疫试验[J].江西农业大学学报.2005， 27: 107 109 。
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权利要求
1.一种制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒三联疫苗的方法，包括1)将已长成90％单层的宿主细胞系分别接种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，并加入细胞维持液，在37℃下培养；2)当细胞病变(CPE)达到75％以上后，收集病毒。可保存于-20℃，备用；3)将各病毒按10-6.5的TCID50以1∶1∶1混合，同时加入弗氏完全佐剂和免疫加强剂，37℃甲醛灭活24h；4)加入油佐剂配制成水一油一水剂型的疫苗。
2. 权利要求1的方法，用于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)接种培养的宿主细 胞系是猪睾丸细胞(ST)细胞系、用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)接种培养的 宿主细胞系是Vero细胞系、用于轮状病毒(RV)接种培养的宿主细胞系是 Mac-145细胞系，其中所述的ST细胞系购自中国兽医监察所，经检验过无 支原体和外原病毒污染；Vero细胞系和Mac-145细胞系本公司保藏。
3. 权利要求1或2的方法，其中步骤l)中使用EDTA-胰蛋白酶消化单层细 胞，有利于细胞分散。
4. 权利要求1或2的方法，其中步骤l)中传代细胞培养中所用的细胞维持 液为MEM培养基，在使用MEM培养基前，将每代9.4克MEM粉剂、2.2 克NaHC03溶于1L水中，调解PH值至7.2备用，再往每升所配制好的MEM 培养基中加入20ml经检测BVDV为阴性的南京苏邦血清，就变为细胞维持 液。
5. 权利要求4的方法，其中对细胞维持液中MEM培养基进行无齒过滤处 理，避免细菌污染，不破坏MEM培养基中的营养成分。
全文摘要
本发明提供一种制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒三联疫苗的方法，包括将已长成90％单层的宿主细胞系分别接种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，并加入细胞维持液，在37℃下培养；当细胞病变(CPE)达到75％以上后，收集病毒，可保存于-20℃，备用；将各病毒按10<sup>-6.5</sup>的TCID<sub>50</sub>以1∶1∶1混合，同时加入弗氏完全佐剂和免疫加强剂，37℃甲醛灭活24h；加入油佐剂配制成水一油一水剂型的疫苗。本发明的方法可用于制备预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病三联疫苗，解决当前无有效药物治疗的困惑。
文档编号A61K39/295GK101491673SQ200810154578
公开日2009年7月29日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者张桂红, 杨保收 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司