一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪瘟病毒检测技术领域，具体说是一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株 疫苗株病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002] 猪痕（Classical swine fever，CSF)是由猪痕病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了 很大的变化，在临床表现上趋于非典型化，主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养 猪业发展的一大隐患。猪痕兔化弱毒株（Hog cholera lap inized virus，HCLV)是由中国 兽医药品监察所周泰冲等从1954年开始相继用4株CSFV诱使家兔发病，在兔体上连续传 几百代后培育成功的1株能够适应家兔的CSFV，称为"C株"，C株被公认为安全有效的活疫 苗，具备免疫原性强、遗传性稳定、无残余毒力、对怀孕猪和乳猪安全等特点，为成功控制我 国猪瘟大规模流行以及为世界许多国家和地区猪瘟的根除做出了巨大贡献。但是猪瘟弱毒 疫苗在中国的大规模应用使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难。疫苗效价的高 低是疫苗质量合格与否的关键指标，如何快速、准确测定疫苗病毒效价是猪瘟疫苗生产中 亟待解决的主要难题之一。因此，急需建立一种可以准确诊断猪瘟野毒感染与疫苗接种的 敏感、特异、重复性好的检测方法。由于C株基因组长度为12310nt，与石门株相比，在其基 因组12133nt处有12个碱基（CTTTTTTCTTTT)的插入。本发明根据这一基因特点设计了特 异性针对C株的引物及探针，旨在建立一种可以快速、灵敏、准确地检测我国C株的荧光定 量RT-PCR方法，优化并组装成试剂盒。该方法的建立对临床诊断CSFV C株和流行病学调 查具有重要意义。
[0003] 目前，用于检测猪瘟病毒的方法有多种，如病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶单层 试验（IPM)、间接免疫荧光试验（IFA)、酶联免疫吸附试验（ELISA)和血清中和试验（SN)、 免疫胶体金技术、反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR)、实时荧光定量PCR和基因探针等。荧 光定量PCR方法是近年来迅速发展起来的一种分子生物学方法，具有快速、敏感、准确、定 量检测微生物核酸拷贝数等优点。但是上述方法都是通用型的，只能检测是否CSFV感染， 无法区分检测到的毒株是疫苗株，还是田间野毒感染引起，导致接种疫苗存在盲目性，进而 加大了预防和监测CSFV的难度。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于准确鉴别诊断猪瘟野毒 感染与疫苗接种猪瘟病毒疫苗毒C株的特异性检测的技术手段的难题，提供一种能够快 速、敏感、准确以及低成本地检测猪瘟病毒疫苗毒C株疫苗株的Taqman Real-time RT-PCR 试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法，本试剂盒及其使用方法还适用于检测低微含 量的猪痕病毒疫苗毒C株疫苗株病毒。
[0005] 为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
[0006] -种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，所述试 剂盒包含One St印RT-PCR buffer、酶混合物、阳性对照、无 RNA酶水、序列SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2的引物及SEQ ID N0:3的探针引物的混合物。
[0007] 所述序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:2的引物混合物包括：
[0008] SEQ ID N0:1 :上游引物 GGACCCTATTGTAGATAACACTACTTTT
[0009] SEQ ID N0:2 :下游引物 GGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTC
[0010] 探针引物序列为：
[0011] SEQ ID N0:3 ：TTTTTTCTTTTTTATTTATTTAGATATTATTATTTATTTATTTATT
[0012] 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告荧光基团、3'端标记物为TAMRA淬灭荧光 基团。
[0013] SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:2的由5'端向3'端延长的序列：
[0014] SEQ ID N0:4(206bp)：
[0015] ggaccctattgtagataacactacttttcttttttcttttttatttatttagatattattatttattta tttatttatttattgaatgagtaagaactggtataaactacctcaagttaccacactacactcatttttaacagcac tttagctggaaggaaaattcctgacgtccacagttggactaaggtaatttctaacggccc〇
[0016] 所述阴性对照为无 RNA酶水。
[0017] 所述阳性对照为含有猪瘟病毒疫苗毒C株基因序列的阳性质粒pGM-206,其构建 方式如下：
[0018] a.猪瘟病毒疫苗毒C株基因组RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit说明书进行 操作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA。以SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2作 为引物扩增，反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性50s，51. 5°C退火40s，72°C延伸50s， 共30个循环；72°C再延伸8min，4°C 5min。PCR产物于lOg/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴 定。
[0019] b. PCR产物的克隆及序列分析
[0020] PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-T Easy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列 测定正确的质粒命名pGM-206,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为 162ng/ul，计算出其拷贝数为5. lexlO^copies/ul，拷贝数/微升），本发明的试剂盒利用 5. 16xl07(C〇pies/ul)浓度的质粒作为阳性对照以及利用其倍比稀释后制作为标准曲线。
[0021] 本发明还提供了所述试剂盒用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的使用方法，包括以 下步骤：
[0022] 实时荧光定量RT-PCR，反应体系如下：
[0023] a. One Step RT-PCR buffer : 12. 5 份；
[0024] b.弓丨物浓度均为IOpmol/ μ 1的三条引物混合液3份，其中206bp上游引物1份， 206bp下游引物1份，探针引物1份；
[0025] c.酶混合物1份；
[0026] d.无 RNA/DNA 酶水 5. 5 份；
[0027] e.提取样品的RNA模板3份；
[0028] f.阳性对照pGM-206阳性质粒3份；
[0029] g.阴性对照无 DNA酶水3份。
[0030] 实时荧光定量RT-PCR，扩增条件如下：
[0031] 42°C反转录 5min ;94°C预变性 2min ;94°C 20s，退火温度 51. 5°C 30s，72°C 20s，40 个循环。
[0032] 根据扩增结果，判定标准为：
[0033] 在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复 检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可以依扩增得到的Ct值 根据标准曲线对样品进行准确定量。
[0034] 本发明弥补了 CSFV鉴别诊断上的薄弱环节，建立并组装了特异性检测猪瘟C株疫 苗株的实时定量RT-PCR试剂盒。与普通RT-PCR方法相比，本发明省时、省力，成本较低，在 检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，时间由原来的4-5小时缩短到1-2 小时，从而有利于快速检测。本发明灵敏度高，对模板浓度要求较低可，用于检测低微含量 的猪瘟病毒；无需电泳就可直观的反应检测结果，避免了溴化乙锭对人体健康的危害。本 发明使用了探针法，只有探针引物特异的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果， 使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于猪瘟病毒疫苗毒与流行毒的防控 和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。荧光定量可以看到整个扩增过程、扩增 效率、溶解温度，利用已知起始拷贝数的标准品直接得到标准曲线，只要获得未知样品的CT 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，进行精确定量，因此具有高度特异、敏 感、简单、准确等特点。本发明试剂盒及其使用方法适用于任何实验室和基层各级防控单 位、兽医站及大中小型养殖场等，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0035] 图1.为本发明制作标准曲线。
[0036] 图2.为本发明样本检测图。
[0037] 图1中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述
[0039] 实施例1
[0040] 1、引物的设计和制备
[0041] 参照GenBank(基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区