1、阳性对照pGM-206阳性质粒3 μ 1、阴性对照无 DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0105] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μ 1、从C株疫苗毒免疫猪全血中提取的 RNA模板3 μ 1、阴性对照3 μ I、12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定 程序下扩增：42°C反转录5min ;94°C预变性2min ;94°C 20s，退火温度51. 5°C 30s，72°C 20s， 40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
[0106] 5、结果分析
[0107] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。
[0108] 序列表 Organization Applicant Street:兰州市城关区盐场堡徐家坪I号 City:兰州 State ::甘肃 Gountry:中国 PoslaiCodc : 730046 PhoncNuiribcr: 0931-8343385 FaxNumbor: 0931 -8340977 EmailAddrcss : jingningcaixiong(i/; 163.com < 110> Organizati onN ame :中国农业科学院兰州兽医研究所 Application Project <120> TiUc : 一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的Taqmam Rgal-time RT-PCR试 剂盒 <!30> AppFiicRcicrcncc : Dcicction of porcine parvOvirus using a laqman~ba>cd real-limc per with primers and probe designed for ihc NSl gene <140> CaiTCMlAppNumbcr : <141> CurrcnlFiiingDalc :_---- Sequence
[0109] <213> OrganismNamc : Sus scroia <400- PreSequcnccSiring ; ggaccclatl gtagaiaaca ciaclUt 28 <212> Type: DNA <211> Length : 28 ScqucncoNamc : SEQ ID N1Orl ScqucnccDcscription : Sequence <213> (JrganisrnNamc : Sus scrofe <400> PreSequcnccSiring : gggccgt.lag aaaiiaccil aglc 24 <212> Type : DNA <211> Length : 24 ScqucnccNamc : SEQ !D NO:2 ScqucnccDcscriplion : Sequence <213> OrganisrnNamc : Sus scroia <400> PreSequcnccSiring : UllUcUl UlaIUali tagalallai. LalUiUtla iUaii 46 <212〉Type: DNA <21 !> Length ; 46 SequcnccNamc : SE〇 IDM0:3 SequcnccDcscription : S哪雜ce <213> OrganisinNarnc : Sus scroia <4()()> FM-eScqucnccSiring : ggaccclatl glagataaca claclUlcl UUtcllU UatUalU agaMtatt 册 aliiatUal UaUlaUl allgaalgag laagaactgg Iaiaaaclac cteaagttae 1:20 cacaclacac IcaUlUaa cagcacUla gclggaagga aaaUcclga cglccacagt 180 IggacUiagg iaalitaaa cggccc 206 <212>Typc:DNA
[0110] <211^ Length : 206 ScqucnccNamc : SEQ IDMO?4 SeciucnccDcscriplion :
【主权项】
1. 一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，所述试 剂盒包含OneSt印RT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDN0:1 至SEQIDNO: 2的引物及SEQIDNO: 3的探针引物的混合物，其特征在于所述序列SEQID N0:1至SEQIDN0:2的引物序列为： SEQIDN0:1 :上游引物GGACCCTATTGTAGATAACACTACT TTT SEQIDN0:2:下游引物GGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTC。2. 根据权利要求1所述的一种用于检测猪痕病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物序列为： SEQIDN0:3：TTTTTTCTTTTTTATTTATTTAGATATTATTAT TTATTTATTTATT。3. 根据权利要求2所述的猪瘟病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒， 其特征在于所述引物混合物扩增出的条带序列为： SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延长的序列： SEQIDNO:4 ： ggaccctattgtagataacactacttttcttttttcttttttatttatttagatattattatttatttatt tatttatttattgaatgagtaagaactggtataaactacctcaagttaccacactacactcatttttaacagcact ttagctggaaggaaaattcctgacgtccacagttggactaaggtaatttctaacggccc〇4. 根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的Taqman Real-timeRT-PCR试剂盒，其特征在于所述引物浓度均为lOpmol/μL，扩增引物及探针引 物体积配比为1:1:1。5. 根据权利要求1所述的一种用于检测猪痕病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pGM-206阳性质粒以及利用其倍比稀释 后制作为标准曲线。6. -种如权利要求1所述检测猪瘟病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂 盒的使用方法，其特征在于采用实时荧光定量RT-PCR，包括以下步骤： a. 使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下：42°C反转录5min; 94°C预变性 2min; 94°C20s，退火温度 51.5°C30s，72°C20s，40 个循环； b. 结果分析 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40 为可疑，需重复检测，再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性；也可以依扩 增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。7. -种如权利要求6所述检测猪瘟病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂 盒的使用方法，其特征在于所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系为： a. OneStepRT-PCRbuffer:12· 5 份； b. 引物混合液3份 c. 酶混合物1份； d. 无RNA/DNA酶水 5. 5 份； e. 提取样品的RNA模板3份； f. 阳性对照pGM-273阳性质粒3份； g. 阴性对照无RNA/DNA酶水3份。8.根据权利要求7所述检测猪瘟病毒疫苗毒C株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒 的使用方法，其特征在于所述反应体系中的引物混合液3份为引物浓度为lOpmol/μ1的三 条引物混合液，其中206bp上游引物1份，206bp下游引物1份，探针引物1份。
【专利摘要】一种用于检测猪瘟病毒疫苗毒C株的Taqman？Real-time？RT-PCR试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包含One？Step？RT-PCR？buffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2的引物及SEQ？ID？NO:3的探针引物的混合物，所述使用方法包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤及评定标准。本发明弥补了CSFV鉴别诊断上的薄弱环节，建立并组装了特异性检测猪瘟C株疫苗株的实时定量RT-PCR试剂盒。与普通RT-PCR方法相比，本发明省时、省力，成本较低。本发明能够用于快速、敏感、准确以及低成本地对猪瘟病毒疫苗毒C株进行检测及定量分析。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公开号】CN105385785
【申请号】CN201510719724
【发明人】吴锦艳, 田宏, 尚佑军, 陈妍, 王光祥, 刘湘涛, 张志东, 栾志舫, 臧金凤, 王耀杰
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月30日