±或，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
[0042] 扩增引物序列为：
[0043] SEQ ID N0:1 :上游引物 GGACCCTATTGTAGATAACACTACTTTT
[0044] SEQ ID NO: 2 :下游引物 GGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTC
[0045] 探针引物序列为：
[0046] SEQ ID NO:3 ：TTTTTTCTTTTTTATTTATTTAGATATTATTATTTATTTATTTATT
[0047] 上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
[0048] 阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并 保存。
[0049] 2、制作阳性对照及其对应标准曲线
[0050] 阳性对照为含有猪瘟病毒疫苗毒C株基因序列的阳性质粒pGM-206,其构建方式 如下：
[0051] a.猪瘟病毒疫苗毒C株基因组RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit说明书进行 操作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA。以SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2作 为引物扩增，反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性50s，51. 5°C退火40s，72°C延伸50s， 共30个循环；72°C再延伸8min，4°C 5min。PCR产物于lOg/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴 定。
[0052] b. PCR产物的克隆及序列分析
[0053] PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-T Easy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定 正确的质粒命名PGM-206,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为162ng/ ul，并计算出拷贝数为5. IexlOw (copies/ul，拷贝数/微升），将其10倍倍比稀释后按照 标准曲线制作程序制作标准曲线，依标准曲线将5. 16xl07(copies/ul)浓度的质粒作为阳 性对照。
[0054] 3、制备用于检测10头份的试剂盒
[0055] 本试剂盒由以下组分组成：
[0056] a. One Step RT-PCR buffer ：125 μ I ；
[0057] b.引物浓度均为IOpmol/ μ I的三条引物混合液30 μ 1，其中206bp上游引物 10yl，206bp下游引物10μ1，探针引物10μ1 ;
[0058] c.酶混合物 10 μ 1 ;
[0059] d.无 RNA/DNA 酶水 100 μ 1 ;
[0060] e.阳性对照pGM-206阳性质粒30 μ 1。
[0061] 4、本发明试剂盒用于检测猪瘟C株病毒的使用方法
[0062] (I) PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1、三条引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、无 RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取样品的RNA模板 3 μ 1、阳性对照pGM-206阳性质粒3 μ 1、阴性对照无 DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0063] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μ 1、从C株疫苗毒免疫猪扁桃体组织中 提取RNA模板3 μ 1、阴性对照3 μ 1，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以 下设定程序下扩增：42°C反转录5min ;94°C预变性2min ;94°C 20s，退火温度51. 5°C 30s， 72°C 20s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
[0064] 5、结果分析
[0065] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。
[0066] 实施例2
[0067] 步骤1、2同实施例1。
[0068] 3、制备用于检测20头份的试剂盒
[0069] 本试剂盒由以下组分组成：
[0070] a. One Step RT-PCR buffer ：250 μ I ；
[0071] b.引物浓度均为lOpmol/μΙ的三条引物混合液60μ1，其中206bp上游引物 20 μ l，206bp下游引物20 μ 1，探针引物20 μ 1 ;
[0072] c.酶混合物 20 μ 1 ;
[0073] d.无 RNA/DNA 酶水 2〇0 μ 1 ;
[0074] e.阳性对照pGM-206阳性质粒60 μ 1。
[0075] 4、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒疫苗毒C株
[0076] (I) PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1三条引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、无 RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取样品的RNA模板 3 μ 1、阳性对照pGM-206阳性质粒3 μ 1、阴性对照无 DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管 中。
[0077] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μ 1、从C株疫苗毒免疫猪脾脏中提取的 RNA模板3 μ 1、阴性对照3 μ I、12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定 程序下扩增：42°C反转录5min ;94°C预变性2min ;94°C 20s，退火温度51. 5°C 30s，72°C 20s， 40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
[0078] 5、结果分析
[0079] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品进行准确定量。
[0080] 实施例3
[0081] 步骤1、2同实施例1。
[0082] 3、制备用于检测50头份的试剂盒
[0083] 本试剂盒由以下组分组成：
[0084] a. One Step RT-PCR buffer ：625 μ I ；
[0085] b.引物浓度均为lOpmol/μΙ的三条引物混合液150μ1，其中206bp上游引物 50 μ l，206bp下游引物50 μ 1，探针引物50 μ 1 ;
[0086] c.酶混合物 50 μ 1 ;
[0087] d.无 RNA/DNA 酶水 500 μ 1 ;
[0088] e.阳性对照pGM-206阳性质粒150 μ 1〇
[0089] 4、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒疫苗毒C株
[0090] (I) PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1、三条引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、无 RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取样品的RNA模板 3 μ 1、阳性对照pGM-206阳性质粒3 μ 1、阴性对照无 DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0091] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μ 1、从C株疫苗毒免疫猪淋巴结中提 取的RNA模板3 μ 1、阴性对照3 μ 1、12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以 下设定程序下扩增：42°C反转录5min ;94°C预变性2min ;94°C 20s，退火温度51. 5°C 30s， 72°C 20s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
[0092] 5、结果分析
[0093] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。
[0094] 实施例4
[0095] 步骤1、2同实施例1。
[0096] 3、制备用于检测100头份的试剂盒
[0097] 本试剂盒由以下组分组成：
[0098] a. One Step RT-PCR buffer :1250 μ I ；
[0099] b.引物浓度均为lOpmol/μΙ的三条引物混合液300 μ1，其中206bp上游引物 100yl，206bp下游引物100μΙ，探针引物100μΙ ;
[0100] c.酶混合物 100μ1;
[0101] d.无 RNA/DNA 酶水 Iml ;
[0102] e.阳性对照pGM-206阳性质粒300 μ 1。
[0103] 4、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒疫苗毒C株
[0104] (I) PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1、三条引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、无 RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取样品的RNA模板 3 μ