轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗，具体说，是涉及轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗疫苗及其制 备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 一、微生物对人体的危害及应对措施
[0003] 微生物通常是指那些个体体积直径一般小于Imm的生物群体，它们结构简单，大 多是单细胞，还有些甚至连细胞结构也没有，我们身边无时无刻不存在着微生物，通常会借 助显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构；其中，致病微生物是指能够引起人 类、动物和植物的病害，具有致病性的微生物。一种病原体的致病性有赖于它的侵袭宿主并 在体内繁殖和抵御宿主抵抗力而不被其消灭的能力。微生物致病性有种属特征，致病能力 强弱的程度称为毒力。感染性疾病的成立并非由微生物的毒力单方面决定，还要视宿主的 健康情况与免疫功能状态。一般而言，毒力强的微生物感染未曾免疫过的机体，能引起病理 损害出现显性感染等，而正常机体却能抵抗许多低毒微生物（如条件致病菌）的损害，但当 宿主抵抗力降低时则可对这些微生物易感而致病。病原体的毒力与宿主抵抗力两者之间的 较量，引出感染性疾病的发生、发展、转归和预后，由于病原体和宿主之间适应程度不同，双 方抗衡的结局各异，产生各种不同的感染谱，即感染过程的不同表现。致病性是对特定宿主 而言，有的只对人类有致病性，有的只对某些动物，而有的则属人畜共患性微生物。而此时 宿主通常只能通过自身的免疫系统来对抗微生物的感染，死亡率非常高，致使各研宄学者 研宄出了疫苗来对抗致病性微生物对人体的侵害。
[0004] 而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫 苗保护人体不受致病性微生物的侵害。通过接种预防性疫苗来预防疾病是人类在一个多世 纪的临床实践中，证明是行之有效的手段。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的 疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康 水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。今天，用以预防病毒导致的传染病 有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒 技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻瘆病毒疫苗、 腮腺炎病毒疫苗、风瘆病毒疫苗和水痘疫苗等。预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生 物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及 其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。用基因重组蛋白技术开 发出来的疫苗，如乙肝表面抗原（预防乙型肝炎）、人类乳头状类病毒颗粒病毒（预防子宫 颈癌）等。用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆 菌b型多糖-蛋白结合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球 菌多糖-蛋白结合疫苗。由此可见，医学生物技术的发展，是疫苗产品不断发展的原动力， 通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类 健康的挑战。
[0005] 二、结合疫苗概述
[0006] 多糖是病原菌中的一种重要免疫有效成分，有菌体多糖（OPS)和荚膜多糖（CPS) 之分。当病原体侵入机体后，它们作为免疫原，能刺激机体产生保护性免疫应答。但是，多 糖分子属于T细胞不依赖性抗原（Ti-Ag)，免疫原性较弱，接种婴幼儿后免疫效果尤其不 理想，而目前许多危害严重的疾病如流感嗜血杆菌（Hib)引起的脑膜炎、E. Coli 0 157:H7 引起的小儿出血性腹泻脱水等在婴幼儿中高发且临床无有效的治疗办法，病死率高（王燕 等，结合疫苗概述[J]，微生物学免疫学进展，2000,28(1):60-63)。为了提高多糖疫苗的 免疫原性，国外于本世纪20年代初兴起了多糖和蛋白的化学结合疫苗，即缀合疫苗，结合 (以蛋白为载体的细菌多糖类）疫苗采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上制备成多 糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血杆菌结合疫 苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等，短短几十年其发展相当迅速，已取得显著 成果。
[0007] 三、肺炎球菌的危害及其流行病学研宄
[0008] 由肺炎球菌（肺链）所引起的感染是全世界发病率和死亡率的主要起因。肺炎、 发热性菌血症和脑膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常见表现形式，而呼吸道内的细菌扩 散可导致中耳感染、窦炎或复发性支气管炎。与侵入性疾病相比，非侵入性的表现形式通常 不那么严重，但更多见。由于抗生素耐药性传染病的扩散，以及肺炎球菌肺炎经常在流感感 染之后出现，肺炎球菌疾病在流感期间发作的可能性进一步增加。
[0009] 由肺炎链球菌引发的疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎球菌已成为 全球儿童的头号杀手。我国肺炎的病死率为16. 4%，其中50岁以上中老年人及1岁以下 婴幼儿分别高达28. 6%和22. 0%。我国肺炎球菌在健康儿童中的携带率较高，资料统计显 示，在北方地区健康儿童中的携带率为24. 2 %，南方地区为31. 3 %。而所述病是导致5岁以 下儿童死亡的重要原因。主要原因在于婴幼儿免疫系统的发育尚不完善，免疫力较弱。并 且年龄越小的婴儿，免疫力越弱。肺炎球菌大约有90种血清型（菌株），我国的统计资料 显示肺炎球菌感染菌株前几个血清型依次为：5、6、19、23、14、2、4型。据一项收集了 860株 肺炎球菌分离株的研宄显示，有109株（12. 7% )表现为血清群6,在中国肺炎球菌血清型 6的红霉素耐药性达100%，其中的6A、6B和6C型分别为62株（56. 9% )、38株（34. 9% ) 和 9 株（8. 2% )。
[0010] 从化学结构上来看，以上病原体拥有一个细胞表面荚膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS)或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)壳，或者两者兼有，其功能是 帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识 另IJ，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够防 止细菌被杀灭。大多数病原菌中，不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多种 不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一部 分菌株感染所导致的。
[0011] 由此可见，大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖以提高致病 菌株覆盖率，优化和选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病 学问题。一旦明确何种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗。 [0012] 中国生物技术集团成都生物制品研宄所生产的23价肺炎球菌疫苗是选取了 23种 最常见的致病菌（1，2,3,4,5,6B，7F，8,9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20， 22F，23F，33F)，分别发酵培养并分离提纯肺炎球菌荚膜上的各型多糖，按等比例混合制成 疫苗。细菌的多糖是一种胸腺非依赖性抗原，这种抗原与胸腺依赖性抗原的主要区别在于 前者不需要T淋巴细胞的辅助来产生抗体。临床使用证明，荚膜多糖制作的疫苗明确有效， 并在多个国家广泛使用。但是这类多糖疫苗存在以下问题：（1)在幼小动物或婴幼儿体内 只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强；（2)产生 低亲和力的抗体；（3)只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强 效应；(4)容易产生免疫耐受；（5)普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用，23价 多糖疫苗对于侵入型肺链感染的保护率为50-70%，而且只能用于2岁以上的人群接种，而 肺炎的高峰发病年龄为6-12月龄；(6)具有重复结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫 原，没有T细胞的参与，它们是无法诱导免疫记忆效应，刺激机体产生的抗体主要是IgM和 IgG2,不能够有效地激活补体系统。
[0013] 半化学结合技术（也称结合技术）开发疫苗的方法是从20世纪80年 代出现的开发细菌疫苗的技术。John Robbins通过将流行性嗜血杆菌b型 (Haemophilusinfluenzaetype b，Hib)荚膜多糖（Polyribosylribitolphosphate，PRP)， 用共价键的形式连接到蛋白载体（破伤风类毒素）合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖 PRP-破伤风类毒素结合疫苗（PRP-TT)，在免疫动物后，能够产生杀菌的保护性抗体，从而 开创了新一代细菌疫苗开发技术。特别有意义的是，对于年龄小于2岁的婴幼儿来说，由 于免疫系统发育不完善，多糖对于婴幼儿是属于一种非T细胞依赖性抗原，不能够刺激机 体如成人一样产生长效的针对于所述多糖来源的细菌特异性保护IgG抗体。因此，多糖对 于小于2岁的婴幼儿是一种半抗原，不能够作为疫苗来接种小于2岁的儿童。当将细菌多 糖以共价键的形式连接到蛋白载体，如破伤风类毒素 （Tetanus Toxoid，TT)，由于蛋白质是 一种T细胞依赖性抗原，能够将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机 体产生针对于所述多糖的特异性IgG抗体，保护机体不受细菌的感染。流行性嗜血杆菌b 型多糖-破伤风类毒素（PRP-TT)结合疫苗开发的成功，开创了一个开发细菌疫苗的技术 平台，即将细菌多糖，如荚膜多糖、0-特异性多糖（O-specificpolysaccharide)、或寡聚糖 (Oligosaccharide)，以共价键连接到蛋白载体上而制成的结合疫苗。基于这一概念的成 功，医学生物研宄界通过采用同一种化学合成方法开发出了不同细菌的结合疫苗；同样也 用不同的合成技术开发出同一种细菌的结合疫苗。
[0014] 荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系统识别，防止 补体系统被细菌表面的蛋白激活和免疫细胞吞噬。如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也 能够避免细菌被杀灭。荚膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作为疫苗对较大的 儿童有一定的保护力。然而，荚膜多糖对2岁以下婴幼儿、老年人以及B细胞免疫缺陷的人 群免疫效果差，接种剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。所述多糖疫苗与其它多糖 疫苗一样，属T细胞非依赖性抗原，具有年龄相关的免疫原性，且不诱生T细胞依赖性的加 强应答。通过将多糖与某种蛋白质共价结合，可使多糖转化成T细胞依赖性抗原，从而刺激 婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白（IgG)的 抗体比例。这种多糖结合疫苗不仅能够保护婴幼儿（2岁以下儿童），还能够大大地增强抵 抗力差的病人对细菌感染的抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景。1980年，JohnRobbins 用溴化氰来随机活化Hib荚膜多糖，然后，将己二酰二肼（Adipic Dihydrazide，ADH)作 为连接物（linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法将衍化后的多糖共价键地连接到 载体蛋白破伤风类毒素上，合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素结合疫苗 (PRP-TT)。由于在每个多糖链上有多个活化点，蛋白载体上同样的有多个连接点，形成的 结合物是一种多糖和蛋白交叉连接的大分子，平均分子量约为5X 106Da。1980年，Harold Jennings在美国专利4356170里，陈述了用牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA)为 载体，将脑膜炎球菌的A，C群多糖通过还原胺法共价键地连接到BSA上，合成出了流行性脑 膜炎多糖-BAS结合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分别在美国专利4673574 和4902506里，描述了用变异无毒株白喉毒素197 (Cross reaction material subl97， CRM197)作为载体蛋白，以还原胺法合成了流行性嗜血杆菌b型寡聚糖-变异无毒株白喉毒 素197 (HbOC-CRM197)结合疫苗。具体的方法是用高碘酸钠氧化Hib荚膜多糖，产生在两末 端为醛基的寡聚糖，通过还原剂氰基硼氢化钠（sodiumcyanoborohydride)，将寡聚糖共价 键连接到蛋白载体上。形成分子量约为90kDa的脂多糖结合物，制成了含有30%的多糖和 每一个蛋白上带有6个糖分子的结合疫苗。随后，美国默克（Merck，Sh