口服六价重配轮状病毒活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗制剂领域，具体而言，涉及一种口服六价重配轮状病毒活疫苗。
【背景技术】
[0002] 人轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，为无包膜RNA病毒，颗粒直径约75nm， 由三层二十面体蛋白衣壳组成。其基因组为包含11个节段的双链RNA，编码6个结构蛋白 (VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白（呢？1、呢？2、呢？3、呢？4、呢卩5)，外层蛋白 为VP4和VP7,内壳蛋白为VP6,核蛋白为VP1、VP2和VP3。同一个组的病毒之间能够发生基 因重配。根据病毒内壳蛋白VP6抗原性不同，HRV可分为7组（A?G)，导致人类腹泻的仅有 A、B、C三组。A组即婴幼儿腹泻的最主要原因，本项目的轮状病毒疫苗也是根据A组设计； B组即成人腹泻轮状病毒，曾在我国爆发流行；C组感染遍布全世界，多为散发。HRV外壳 蛋白VP7(糖蛋白或G蛋白）决定G血清型，外壳蛋白VP4(蛋白酶敏感蛋白或P蛋白）决 定P血清型，常见的人A组轮状病毒G血清型为G1、G2、G3、G4、G8、G9,P血清型为P4、P8。 不同地区流行株不同，欧洲的流行病监测表明：毒株血清型分别为G1 (63% )、G2(8% )、 63(5%)、64(15%)和未分型（8%)，印度流行株为69，巴西为65，近年来68逐渐成为非 洲优势流行株。我国2008年在全国11个地区的HRV流行病学监测数据表明，其毒株血清 型依次为Gl(32.4% )、G2(10% )、G3(44.8% )、G4(0.5% )、G5(0.4% )和G9(11.9% )，优 势流行株由1999年的G1血清型逐渐转变为2007年的G3血清型，2013年以G9也成为优势 流行株。
[0003] 轮状病毒感染是波及全球的一种常见疾病，常发生于6-24月龄婴幼儿，也可感染 成人，主要引起轮状病毒肠炎（RotavirusEnteritis)，导致脱水性腹泻。因发病高峰在秋 季，故又名"秋季腹泻"。轮状病毒主要通过粪口途径密切接触感染，潜伏期2-4天后出现水 样腹泻和呕吐，继而导致脱水症状，并伴有发热和腹痛，发病后3-9天粪便中有病毒排出， 第3天病毒排出达到高峰。
[0004] 几乎所有儿童在出生后3?5年都感染过轮状病毒。全球轮状病毒每年导致5岁 以下儿童大约1. 1亿人次胃肠炎疾病需要进行家庭护理，2. 5亿人次门诊治疗，2百万人次 住院治疗，60万人死亡。如今发达国家虽然腹泻发病常见，但病死率很低，超过85%的死亡 发生在低收入的亚、非国家。我国94. 5%的2岁以内婴幼儿感染过轮状病毒，0-5月龄婴儿 粪便中轮状病毒检出率为34%，6-11月龄婴儿检出率为53 %，12-23月龄为57. 7 %，24-35 月龄为39%，36-59月龄为15%。轮状病毒腹泻患儿中男女性别比为1.77:1。轮状病毒以 其广泛、频繁、能导致重症腹泻而位居世界范围内致2岁以下婴幼儿严重腹泻之病原排行 榜首位。我国每年10月份到次年1月份为发病高峰期，呈现季节性分布特点。近年研宄发 现轮状病毒还可引起肠道外其他系统感染。
[0005] 公共卫生条件的改善并不能减少轮状病毒腹泻的发病率。轮状病毒的感染目前尚 无特效防治办法，主要是控制传染源，切断传播途径，严密消毒可能污染的物品。临床治疗 方面，主要是及时输液，纠酸及纠正水电解质平衡等支持疗法，以减少婴儿的死亡率。在世 界范围内，通过对轮状病毒研宄的日趋深入，普遍认为研制轮状病毒疫苗是人类预防轮状 病毒严重感染的最有效途径。
[0006] 目前国内外上市的轮状病毒疫苗主要包括兰州生物制品有限责任公司的单价羊 株减毒活疫苗罗特威、Merck公司五价人-牛重配减毒活疫苗Rotateq以及GSK公司单价 人株减毒活疫苗Rotarix。
[0007] 轮状病毒流行株多样性的特点，决定了多价疫苗才是最有效预防轮状病毒腹泻的 方法，然而目前市场上的主要轮状病毒疫苗，兰州生物制品研宄所的罗特威以及GSK公司 的Rotarix均为单价血清型轮状病毒疫苗，血清型涵盖范围小，Merck公司的Rotateq虽然 为五价轮状病毒疫苗，但血清型中不含有G8、G9血清型，对主要血清型流行株囊括范围小， 其在非洲马拉维（G8血清型为优势流行株）的临床试验结果显示，对重症轮状病毒腹泻的 保护率仅为40%。
[0008] 因此，需要一个更为全面的多价轮状疫苗。
【发明内容】
[0009] 本发明为口服六价重配轮状病毒活疫苗，含有六种主要流行株血清型Gl、G2、G3、 G4、G8及G9,涵盖了A群轮状病毒99. 6%的G血清型病毒，预计对轮状病毒腹泻有很好的 预防保护效果。
[0010] 本发明的目的旨在提供一种口服接种的、由六价轮状病毒血清型组成的活疫苗， 用以预防因轮状病毒导致的婴幼儿腹泻，属于疫苗生产制备领域范畴。本发明提供各血清 型原液的制备方法，口服轮状病毒保护剂的研发以及轮状病毒疫苗的配制方法。
[0011] 根据轮状病毒的感染及免疫学机制，本发明所述的轮状病毒疫苗免疫采用口服给 药途径，与病毒感染途径一致，相较于注射给药，口服给药疫苗更加快捷方便，利于操作。
[0012] 本发明所述的六价重配口服轮状病毒疫苗成分为，
[0013] (1)G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗，各血清型原液滴度为1?5X106FFU/ ml；
[0014] (2)保护剂：枸橼酸0? 5?2g/L、枸橼酸钠50?150g/L、蔗糖250?450g/L、氯化 锌5?10mM、氯化钙10?20mM;
[0015] 所述的G1血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-1 ;
[0016] 所述的G2血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-2 ;
[0017] 所述的G3血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-3 ;
[0018] 所述的G4血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-4 ;
[0019] 所述的G8血清型活病毒NIH编号为：1290XUK;
[0020] 所述的G9血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-10。
[0021] 本发明还涉及所述的六价重配口服轮状病毒疫苗的制备方法，所述方法包括如下 步骤：
[0022] (1)制备各血清型单价病毒原液，并按照目标滴度配置各个血清型病毒原液，并将 各原液依次加入同一提前灭菌的容器中，充分混合并除菌，即得六价混合液；
[0023] (2)配制保护剂母液并除菌；
[0024] (3)将保护剂母液及步骤（1)配制的六价混合液混合，并将其按照2ml/瓶规格进 行分装，即得到成品。
[0025] 所述的除菌为0. 2ym除菌过滤器过滤除菌。
[0026] 所述的制备各血清型单价病毒原液的步骤为：
[0027] (1)细胞传代：各血清型病毒的培养基质为Vero细胞，首先复苏Vero细胞工作种 子，37°C条件下培养3-5天后，按照一定比例进行传代扩增培养，培养容器依次分别为T25、 I75、T175细胞培养瓶、10层细胞工厂、40层细胞工厂，在40层细胞工厂中培养3-5代后即 可分别接种Gl、G2、G3、G4、G8、G9血清型轮状病毒；
[0028] (2)病毒培养：细胞工厂内细胞汇合度达到90%以上后，进行病毒接种操作。病 毒接种前，选择一个细胞工厂进行细胞计数，根据计数结果，按照病毒感染复数〇. 005? 0.2进行计算，得出需要的病毒量；用胰蛋白酶对病毒激活，激活条件为37°C、胰蛋白酶浓 度10?20yg/ml，激活15?60min;将激活的病毒接种于细胞工厂内，接种后的各血清型 病毒培养于35?37°C条件下2?5天；
[0029] (3)病毒收获：待细胞病变完全（细胞脱落达到75 %以上）将各细胞工厂内的液 体收集于一容器内，进行下游处理；
[0030] (4)下游操作：首先进行细胞破碎处理，采用冻融或高压均质方式破碎细胞，冻融 温度为_30°C?37°C，高压均质压力范围为100?lOOObar，高压均质处理完后，进行细胞碎 片澄清过滤操作，采用两级过滤，第一级为1. 0ym?0. 5ym深层过滤器，第二级为0. 2ym 除菌过滤器，澄清过滤完成后，对病毒液进行超滤浓缩，采用300K孔径超滤膜，对处理后的 病毒收获液进行10倍浓缩，即得到单价血清型疫苗原液。
[0031] 本发明还涉及所述六价重配口服轮状病毒疫苗在制备口服轮状病毒疫苗中的应 用。
【具体实施方式】
[0032] 材料与方法
[0033] 1 ?主要材料：
[0034] 1.IVero细胞细胞来源于ATCC(Americantypeculturecollection美国标准菌 种保藏中心），123代，ATCC编号：TL-CCL-81. 4 ;
[0