超过90%的是Gl，G2, G3, G4， 和G9株，共有10个血清型从人体上分离出来（见表1)。VP4是一种能够被胰蛋白酶切断 成两个不同的病毒蛋白，即VP8和VP5病毒蛋白，由其的抗原性的不同而决定的血清型为P 血清型，有些P血清型可进一步分为2个亚血清型。由于缺乏区别不同VP4血清型分型的 血清或单克隆抗体，阻碍了 VP4的血清型分型。RT-PCR的应用才使得VP4的基因型分型成 为可能，并运用于样品的流行病学调查。因此，VP4基本上是根据基因序列来进行分类，目前 共发现14个P血清型和至少26个P基因型（标于括号中）。P血清型和P基因型可能不 对应，需要同时标出，例如，轮状病毒Wa毒株被标不为PlA [8] Gl病毒。人类致病的毒株中， G1，G3，G4和G9的P和G血清型组合通常是P1A[8]，而G2通常是P1B[4]。由此可见，在世 界范围内流行的轮状病毒享有相同的交叉中和的抗原簇（印itopes)Pl血清型，至少有7个 VP4血清型在人类轮状病毒中被发现。在流行病学上有意义的人类毒株的G血清型1，3,和 4是属于P血清型的IA亚血清型，和G血清型2是P血清型的IB亚血清型。
[0026] 由于自然轮状病毒感染能够很好地诱导免疫保护，至少对严重轮状病毒的感染， 因此，大多数开发疫苗的努力放在减毒活疫苗上。最初的研宄集中于使用动物轮状病毒株， 通过称之为Jennerian法来进行，原因是自然减毒的动物毒株在人体是安全的，而且主要 产生的是混合型免疫保护。
[0027] 在发现轮状病毒是导致儿童严重性腹泻的病原体10年后，于1983年，开始 了用猪轮状病毒株RIT4237(G6P[1]型），制成的第一个轮状病毒减毒活疫苗进行了临 床试验，在芬兰试验的结果显示，所述疫苗是安全和有效的，通过混合型人类轮状病毒 (heterotypichuman rotaviruses)的作用，预防严重轮状病毒腹泻的保护率达80%。但 是，在随后的其他国家进行的临床试验效果令人失望，显示低或者没有保护作用，所述试验 以失败告终。在1987年，猴轮状病毒RRV毒株被用以开发减活疫苗，是第一批开发的轮状 病毒疫苗中的另一个。临床试验表明，尽管所述疫苗能够诱导机体产生保护性抗体，但结 果不稳定，宄其原因在于，RRV毒株的G血清型是G3P[3]，当人体感染的轮状病毒是同型的 G血清型时，即G3,疫苗的效果显著；如果是不同型的G血清型感染时，则效果不佳。随后， RRV株通过基因重配的方法将人类毒株中的VP7基因引入到所述毒株中，使得人类轮状病 毒中常见的其他三种G血清型Gl，G2和G4也能够在RRV重配毒株上表达，这导致了 4价 Rotashield疫苗的开发成功。所述疫苗于1998年获得FDA批准上市销售，但是由于大规模 接种后发现了少数，但是数量明显升高的肠套叠副作用病例的发生，在1999年而被生产公 司下市。在1988年，开始用另一个轮状病毒毒株，S卩WC3猪毒株（G6P [5]型），进行临床试验 时，开始结果证明有效，但是在随后的试验中显示没有显著的保护性，所述疫苗也停止了继 续试验。到1990年，为了使得WC3毒株的抗原结构更接近于人类轮状病毒，通过基因重配 (gene reassortment)的方法，将为VP4和VP7蛋白编码的基因从人类轮状病毒引入到WC3 重配毒株上，这种方法称之为改进的Jennerian法。所述毒株和方法就是被Merck用以开 发RotaTeq的5价（pentavalent)疫苗的开发方法。2006年，由Merck生产5价的WC3-基 因重配疫苗RotaTeq也被批准上市，所述疫苗含有VP7和VP4这两个人类轮状病毒蛋白取 代基因，即G1，G2，G3，G4中的相应的VP7蛋白基因，和P[8]的相应的VP4。临床试验表明， 所述疫苗没有肠套叠副作用，对由于G1-G4轮状病毒所致的胃肠炎的保护率为74%，对严 重胃肠炎的保护率达98%，对住院和急症访问的保护率为94.5%。同年，GSK生产的人类 轮状病毒减毒活疫苗Rotarix也获得上市批准，这个疫苗是基于减毒的人类毒株89-12,血 清型为G1P[8]株，是世界范围内最常见血清型。所述病毒是从一个患轮状病毒胃肠炎的患 者临床样品中分离出来，并在组织细胞多次传代变异减毒后获得。临床试验表明，在注射两 个剂量后，对所有轮状病毒感染的保护率达87 %以上，对严重的胃肠炎的保护率达96 %， 对需要住院胃肠炎病例的保护率达100%。进一步试验表明，所述疫苗的范围保护不仅仅包 括由G1P[8]株导致的胃肠炎，而且包括了与VP4有关的G3P[8]，G4[8]和G9P[8]株导致的 胃肠炎。对G3，G4和G9轮状病毒感染保护的有效性与Gl的相同，超过了 95 %，而对G2株 的有效性是75%，对所有轮状病毒致胃肠炎住院的保护率为75%。
[0028] 统计数据表明，Gl株在世界范围内是最常检测到的毒株，在亚洲、北美和欧洲， G1-G4株占总感染轮状病毒的97. 5%。在南美洲、非洲、澳大利亚占83. 5% -90. 4%，同时， 在这些地区G5、G8和G9毒株开始变得重要起来。从P血清型来看，PlA[8]株最常见，接下 来的是PlB [4]株。这一结果是可以预见的，因为VP7血清型Gl是P1A[8]，为最常检测到的 VP7血清型；其他两个流行病学重要的VP7血清型，G3和G4,也具有相同的VP4血清型。另 一个主要血清型G2的VP4有P1B[4]的特征。尽管G和P血清型或基因型可有多种不同的 组合，但是，4种P-G的组合，即P [8]Gl，P [4]G2，P [8]G3，和P [8]G4组成了 88. 5%的常见的 致病性毒株。
[0029] 由此可见，如果以G血清型的VP7蛋白来配置疫苗，需要包含多种不同的G血清型 毒株来提高疫苗的覆盖率，即Gl、G2、G3、G4、G9、G8和G5, 7价的轮状病毒减毒活疫苗也是 目前开发新一代疫苗的努力方向。如果从另一个策略来开发轮状病毒疫苗，以P血清型决 定蛋白VP4的不同来配制新一代的疫苗，则可大大减少疫苗中包含的毒株品种来达到相同 发覆盖率。从以上的分析可见，如果以P [8]和P [4]两个P血清型毒株来配制疫苗，免疫的 效果将和7价的G血清型相当。从临床上使用的Rotarix和Rotateq效果来看，几乎没有区 另Ij，而且，现有的统计数据上看，Rotarix似乎比Rotateq更有效。从分析这两个疫苗所包含 的毒株血清型决定蛋白的组成来看，Rotarix仅含有Gl这一种VP7病毒蛋白；尽管Rotateq 含有Gl、G2、G3、和G4的四种VP7病毒蛋白，免疫效果并没有增强；而从两者含有的P血清 型决定蛋白VP4的数量来看，Rotarix含有P[8] -种，而Rotateq含有P[8](其中一个毒 株）和P [5] (WC-3原始毒株为G6P [5])两种；但是Rotarix中的重要抗原成分P [8]的含量 将高于Rotateq中的含量。由此可见，从P血清型的角度来评估，含P [8]的VP4毒株轮状 病毒疫苗有着重大的意义。如果新一代疫苗中包含有P血清型的P[8]、P[4]和P[6]三种 VP4抗原成分，即可涵盖全球大部分地区的流行毒株。
[0030] 五、纳米微球在生物技术中的应用及前景
[0031] 纳米材料是指晶粒尺寸小于100纳米的单晶体或多晶体，独特的小尺寸效应和表 面或界面等效应，使其具备了许多优异的或全新的性能，它正日益受到人们的重视。例如纳 米材料对药物研宄领域的不断渗透和影响，已经引发了药物领域一场深远的革命。药物是 人类用于抵御和预防疾病的重要物质，长期以来，药物的研宄开发已经为临床提供了许多 的治疗手段，为患者带来了许多益处。但是，现有药物仍存在着许多问题，如药物无法在循 环系统内滞留并达到有效浓度、无法到达特定的治疗目标、无法通过血脑屏障、无法在某个 局部形成较高浓度而同时又不产生毒副作用等（吴新荣.载药纳米微粒的应用及研宄进展
[J].中国医院药物学杂志，2001，21 (3): 171-173.)。磁性纳米微球药物载体是纳米技术与 现代医药学结合的产物，由于它具有小尺寸效应、良好的靶向性、生物相容性、生物降解性 和功能基团等优点，因此有望克服传统药物所带来的这些缺陷。磁性纳米微粒也可用于蛋 白质和酶的纯化、回收以及酶的固定化，操作简单，且提高酶的稳定性。利用磁性纳米微粒 进行免疫分析，具有特异性好、分离快、重现性好的特点。使用磁性微球载体进行介入治疗， 在磁控血管内进行栓塞，则具有磁控导向、靶位栓塞等优点。
[0032] 磁性纳米微球在生物医学中的应用随研宄的深入日渐广泛，具体有：
[0033] 1、固定化酶
[0034] 生物高分子例如酶分子等都具有很多官能团，可以通过物理吸附、交联、共价偶 合等方式将他们固定在磁性微粒的表面。用磁性纳米微球固定化酶的优点是：易于将酶 与底物和产物分离；提高酶的生物相容性和免疫活性；提高酶的稳定性，且操作简单可降 低成本。Bendkiene等制备了壳聚糖磁性微球，用作固定化载体。酶被固定在这种载体上 之后，可以很容易地用磁性装置从反应的混合液中分离回收。国内的研宄者对这方面也 作了探索，丁小斌等采用分散聚合法，合成出Fe30V(St-MPE0) (St-苯乙烯，MPEO-聚环氧 乙烷大单体）微球，所述微球具有两亲结构，在大多数极性、非极性介质中都具有良好的 溶胀性能，使得微球固载的化合物在多种介质中都具有较高的活性（Ding XB，Wei L，Zhao HZ.Synthesis and characterization of aliphatic polycarbonatediols[J]. Applied Polymer Science，2001，79 (3) :1847-1851)。所述磁性纳米微球载体可望用于蛋白质和酶 的纯化、回收以及酶的固定化、细胞分离等领域。
[0035] 2、靶向药物
[0036] 具有靶向性的药物载体微球是指载药微球能高选择地分布于作用对象，从而增强 疗效、减少副作用。最初的靶向药物载体微球是根据临床需要，通过选用对机体各种组织 或病变部位亲和力不同的载体制作载药微球，或将单克隆抗体与载体结合，以使药物能够 输送到治疗期望达到的特定部位。随着人们对治疗的要求越来越高，靶向定位也因受基质 的限制而不能完全令人满意，因此就出现了磁性纳米微球载药系统。这种系统在外加磁场 的作用下，通过动（静）脉注人到病变组织，把载体定向到病变部位（靶位），使所含药物 得到定位释放，集中到病变部位发生作用（A Paul，Alivisatos. Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay [J] · Science，2001，12 (5) : 53-60) 〇 德国的 Lubbe等完成了世界上第一例应用磁性药物靶向治疗的临床实验。在对14个晚期实体瘤患 者的磁靶向治疗中，发现患者对磁性靶向药物的耐受性很好。Lexion等也应用磁性微球作 为药物载体治疗兔子的鱗癌（Lexion C，Arnold W, Klein RJ, et al. Locotegional cancer treatment with magnetic drug targeting[J]. Cancer Res,2000, 60(23):6641-6648), 国内的陶凯雄等用阿霉素磁性蛋白微球治疗鼠种植性胃肿瘤（陶凯雄，孙宏武，陈 道达，等.阿霉素磁性蛋白微球靶向治疗鼠种植性胃肿瘤[J].中华实验外科杂志， 2000, 17(1) :63-64))，郭军等用平阳霉素磁性微球治疗口腔领面部海绵状血管瘤25例。此 夕卜，强磁场也具有抑癌作用（郭军，李澄，吴汉江.平阳霉素磁性微球靶向治疗口腔颁面部 海绵状血管瘤25例临床报告[J].南京铁道医学院学报，2000，19(2):112-114))。徐慧显 等用葡萄糖磁性微球固定化L-天冬酞胺酶来治疗急性淋巴白血病，也取得了良好的治疗 效果。这些结果都表明，随磁场强度的提高磁性药物在肿瘤部位的聚集增多，利用外加磁 场的磁导向作用，使药物定点于革G部位，发挥集中、高效的抗肿瘤作用。正是由于磁性纳米 微球的靶向性和表面结合的特异性载体，使人们有望利用它来追踪和消灭正在转移的癌细 胞，从而成为人体内消灭癌细胞的"生物导弹"。但是，目前应用