Lce3e在诊治口腔癌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及LCE3E在诊治口腔癌中的应用，更具 体的涉及LCE3E在诊断和治疗口腔鳞状细胞癌诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 当今社会，癌症是威肋、人类健康及生命的重要致死因素之一。据最新的《世界癌 症报告》统计，2014年全球新增癌症病例1400万，其中中国有307万，占21. 8%，癌症死亡 人数全球约820万，其中中国有220万，占26. 9 %，而统计的中国患癌症占全球比例时，食 道癌的新增病例与死亡人数均占到全球50%，是危害我国人群身体健康的头号杀手，在食 管癌中口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，0SCC)是最为常见的类型，预后 较差。尤其是晚期口腔鳞状细胞癌患者，因其晚期阶段易淋巴转移及远处转移，且原发灶局 部涉及多个重要器官，使肿瘤扩大切除的安全缘受限，即便通过手术、放疗、化疗及生物治 疗的综合序列治疗，其5年生存率仍然很低。肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多步 骤的过程，口腔鳞状细胞癌亦如此，环境对机体的作用及机体自身的变化导致了口腔黏膜 从正常口腔鳞状上皮细胞到过角化、不同程度的异常增生，再到原位癌、侵袭性癌的演变过 程。口腔鳞状细胞癌发生发展过程中涉及多种不同基因的改变，然而其确切的发生发展机 制还不明确，通过分析筛选出的生物分子标记物的表达与肿瘤的相关性，分析其作为诊断 或预后预测标记物的可行性，有望更早的发现肿瘤或指导制定针对患者个体的个性化治疗 方案。
[0003] 发明人通过高通量测序平台选取2例口腔鳞状细胞癌癌组织及3例健康的正常组 织的转录组深度测序分析，初步筛选出在口腔鳞状细胞癌组织和正常组织中差异表达明显 的基因 LCE3E，进一步RT-PCR实验证实了 LCE3E基因在口腔鳞状细胞癌组织高表达，干扰 LCE3E基因的表达能抑制口腔癌细胞的增殖，本发明的分子标志物具有重要的临床实际应 用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种口腔癌诊断制剂，所述口腔癌诊断制剂检测LCE3E基 因和/或LCE3E基因的表达产物。
[0005] 进一步，口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
[0006] 进一步，口腔癌诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测口腔 癌组织中LCE3E基因的表达，优选的，荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增LCE3E 基因的引物；基因芯片中包括与LCE3E基因的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量 PCR试剂盒内含有特异性检测LCE3E基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9,下游引物序列为SEQ ID NO. 10。
[0007] 进一步，直接检测组织中LCE3E基因和/或基因的表达产物。
[0008] 进一步，口腔癌的诊断制剂采用免疫方法检测口腔癌组织中LCE3E基因的表达产 物，优选的，免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
[0009] 进一步，检测LCE3E表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的 抗体可采用市售的LCE3E单克隆抗体。进一步，试剂盒包括：包被LCE3E单克隆抗体的固相 载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
[0010] 进一步，检测LCE3E蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的LCE3E 单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一 步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗LCE3E单克隆抗体、质控区 (C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0011] 本发明的目的在于提供上述口腔癌诊断制剂在制备口腔癌诊断工具中的应用。
[0012] 本发明的目的在于提供一种治疗口腔癌的制剂，制剂中含有抑制LCE3E基因的转 录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。
[0013] 进一步，治疗口腔癌的制剂中含有激活LCE3E的抑制基因、激活抑制LCE3E表达的 蛋白、导入抑制LCE3E转录或表达的siRNA、激活促进LCE3E mRNA降解的microRNA、导入促 进LCE3E蛋白降解的分子、抑制促进LCE3E表达的因子及蛋白的表达。
[0014] 优选的，治疗口腔癌的制剂含有下列中的一组或几组siRNA :SEQ ID NO. 1和SEQ ID Na 2、SEQ ID Na 3 和 SEQ ID Na 4、SEQ ID Na 5 和 SEQ ID Na 6。更优选的，治疗口腔 癌的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。
[0015] 本发明的目的在于提供上述治疗口腔癌的制剂在制备口腔癌治疗药物或试剂中 的应用。
[0016] 本发明的目的在于提供上述治疗口腔癌的制剂在制备抑制口腔癌细胞增殖制剂 中的应用。
[0017] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 LCE3E基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了 LCE3E基因与口腔癌的关系：LCE3E基 因在癌组织中高表达，与口腔癌具有很好的相关性，抑制CE3E基因的表达能够抑制癌细胞 增殖。
[0018] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用 RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因 mRNA降解的microRNA、导入促进目的 基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
[0019] RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸 钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0020] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0021] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；二是可同时检测多种疾病。
[0022] 本发明的目的在于提供一种检测口腔癌的基因检测试剂盒，试剂盒检测基因 LCE3E的表达，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9，下游引物序 列为 SEQ ID NO. 10。
[0023] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0024] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。所述内参为ACTIN。
[0025] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0026] 本发明目的是提供了一种口腔癌蛋白检测试剂盒，检测试剂盒检测LCE3E蛋白情 况。进一步的，试剂盒还包括检测所需的其他检测试剂。
[0027] 本发明目的是提供了一种检测口腔癌的基因芯片，基因芯片包括与LCE3E基因的 核酸序列杂交的探针。
[0028] 本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖 (lactose)、右旋糖（dextrose)、鹿糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇（mannitol)、 淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐（alginate)、凝胶（gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙 稀P比略烧酮（polyvinylpyrrolidone)、纤维素（cellulose)、水、糖衆、甲基纤维素 （methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯（methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearic acid magnesium)及矿