具有突变的支架的结合多肽的制作方法
【专利说明】具有突变的支架的结合多肽 发明领域
[0001] 本发明涉及新的多肽、其产生方法以及基于共同支架的新的多肽变体的群体。例 如，群体可被用来提供新的结合蛋白和多肽。
[0002] 背景
[0003]用于构建新的结合蛋白的不同方法已被描述(Nygren PA和Uhl6n M(1997)Curr Opin Struct Biol 7:463-469)。一种策略是将文库产生和筛选与选择期望的特性组合。
[0004] 基于共同的、第一代支架的第一代Z变体多肽，此类分子的群体和涉及它们的方法 已在W095/19374中描述。另外，基于第二代支架的Z变体多肽，此类分子的群体以及涉及它 们的方法已在W02009/080811中描述。这两个公开内容的教导通过引用并入本文。
[0005] 对于一些应用，期望Z变体多肽或其群体具有改进的特性，诸如较高的碱稳定性、 低抗原性、结构稳定性、易于化学合成和亲水性。W02009/080811公开了具有改进的特性的 具有共同支架的Z变体，但并不是每个期望的特性都可通过如其中描述的Z变体多肽来获 得。
[0006] 多肽药物成功的一个关键因素是其稳定性。显示高结构稳定性的多肽将最有可能 在生产期间以及在人体内在功能上经受化学修饰、物理条件和蛋白水解中的变化。此外，稳 定性将影响多肽药物的活性保质期，以及多肽药物在人体内的有效寿命。
[0007] 因此，对改进Z变体多肽的稳定性存在持续需求。
[0008] 发明描述
[0009] 本发明的一个目的是提供具有新的支架的多肽，所述多肽减轻了当前可得的Z变 体多肽的以上提到的缺点和其他缺点。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种用于基于新的支架产生多肽的方法。
[0011] 本发明的又一个目的是提供此类改进的多肽变体的群体，所述变体的全部都基于 新的支架。
[0012] 本发明的另一个目的是提供多核苷酸的群体。
[0013] 本发明的又另一个目的是提供多肽的群体和多核苷酸的群体的组合。
[0014] 本发明的另外的目的是提供一种用于从多肽的群体选择具有对预定靶的亲和力 的期望的多肽的方法。
[0015] 另一个目的是提供一种用于分离多核苷酸的方法，所述多核苷酸编码具有对预定 靶的亲和力的期望的多肽。
[0016] 另一个目的是提供一种用于鉴定具有对预定靶的亲和力的期望的多肽的方法。
[0017] 另外的目的是提供一种用于选择和鉴定具有对预定靶的亲和力的期望的多肽的 方法。
[0018] 相关的目的是提供一种用于产生具有对预定靶的亲和力的期望的多肽的方法。
[0019] 这些和其他目的可通过在本申请中公开的不同方面来实现。
[0020] 在本公开内容的第一方面，提供了多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列： [0021 ] i)EX2X3X4AX6X7EIXl〇XllLPNLXl6Xl7Xl8QX2〇X2lAFIX25X26LX28X29X3〇PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q,
[0022] 其中，父2、父3、父4、父6、父7、父10、父11、父17、父18、父2()、父21、父25和父28的每个独立地对应于任何氨 基酸残基;且
[0023] 其中，彼此独立地，
[0024] X16 选自 N和 T;
[0025] X26选自 I^PS;
[0026] X29X30PX32 选自 DDPS 和 RQPE;
[0027] X35 选自 A和 S;
[0028] X36选自 E 和N;
[0029] X39选自 A、C^PS;
[0030] X45选自 E、N和 S;
[0031 ] X46选自D、E和S，条件是当X45是N时X46不是D;
[0032] X47选自A和S;以及
[0033] ii)与i)中定义的序列具有至少91 %同一性的氨基酸序列，条件是当X45为N时X46 不是D。
[0034] 在以上多肽序列i)内，定义为"独立地对应于任何氨基酸"的每个氨基酸X单独地 对应于选自所有可能的氨基酸的氨基酸残基。为了清楚起见，这适用于对应于以上序列i) 中的位置乂2、乂3、乂4、如、乂7、乂10、乂11、乂17、乂18、乂2()、乂21、乂25和乂28的氨基酸位置。这意味着，每个此 类X可独立于该序列中指示的任何其他残基X的身份为任何氨基酸残基。在氨基酸序列中， 这些氨基酸X可以以这样的方式选自所有20种天然存在的氨基酸残基，所述方式为这20种 天然存在的氨基酸残基的任一种可存在于任何给定的变体中相应的X位置。在每个位置中 的氨基酸残基的选择可以是或多或少随机化的。还可能的是，限制不同变化的氨基酸残基 从其选择的组为20种天然存在的氨基酸残基的19种、18种、17种、16种或更少。在不同的位 置中的变化性可在一种(意味着不随机化)直至所有20种氨基酸之间被单独调整。氨基酸的 较小子集的随机引入可通过引入的脱氧核糖核苷酸碱基的仔细选择来获得，例如密码子T (A/C)C可被引入以获得在多肽链中给定的位置处的丝氨酸或酪氨酸的随机引入。同样地， 密码子(T/C/A/G)CC可被引入以获得在多肽链中给定的位置处的苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸 和缬氨酸的随机引入。技术人员知道脱氧核糖核苷酸碱基组合的许多替代性选择，其可被 用来获得在多肽链中给定的位置处的氨基酸的不同组合。可出现在多肽链中给定的位置处 的氨基酸的集合还可通过在寡核苷酸合成期间引入三核苷酸而不是一次一个脱氧核糖核 苷酸碱基来确定。氨基酸的定义的集合还可使用裂池合成法(split-pool synthesis)使定 义的密码子在合成中掺入期望的位置来获得。获得随机化双链接头的又另一个替代性选择 是通过使用连接和随后建立的双链DNA的限制性酶切掺入三核苷酸构造块的随机化集合。 [0035]在本公开内容的一个实施方案中，提供了具有对预定靶的亲和力的多肽。在一个 此类实施方案中，提供靶结合特异性的氨基酸残基是在对应于以上序列i)中位置2、3、4、6、 7、10、11、17、18、20、21、25和28的位置中的氨基酸残基。同样地，在此类多肽中，未提供靶结 合特异性的氨基酸残基被称为"支架氨基酸"或简称为"支架"。因此，在一个实施方案中，如 本文定义的支架氨基酸残基是在对应于以上序列i)中位置1、5、8、9、12-15、19、22-24、27、 31、33-34、37-38、40-44和48的位置中的氨基酸残基。技术人员将理解，由如本文定义的多 肽的支架氨基酸提供的有利特性独立于所述多肽的靶结合特异性。
[0036] 如技术人员将认识到的，任何多肽诸如本公开内容的多肽的功能，取决于多肽的 三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列作出微小改变而不影响其功能是可能的。因此，本 公开内容包括所述多肽的修饰的变体，所述变体不改变多肽的功能特性，诸如其改进的稳 定性和/或其对预定靶的结合亲和力。
[0037] 以这种方式，本公开内容还包括多肽，所述多肽包含与i)中定义的序列具有91 % 或更大的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可包含与i)中定义的序列为至少 93%，诸如至少95%，诸如至少97%相同的序列。
[0038] 在一些实施方案中，序列定义i)和ii)之间的此类差异可见于如本文公开的多肽 的序列的任何位置中。在其他实施方案中，此类变化可仅见于支架氨基酸残基中。在其他实 施方案中，所述变化可仅见于提供靶结合特异性的氨基酸残基中。例如，可能的是，属于氨 基酸残基的特定功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等等）的氨基酸残基可被交换为来自 相同功能组的另一个氨基酸残基。
[0039]例如，如在整个说明书中使用的术语"％同一性"可如下计算。使用CLUSTAL W算法 (Thompson等，Nucleic Acids Research，22:4673-4680( 1994))比对查询序列与革El序列。比 较在对应于一个比对的序列(例如最短的）的窗口上作出。窗口可在某些情况下通过靶序列 来定义。在其他情况下，窗口可通过查询序列来定义。将在每个位置处的氨基酸残基进行比 较，并且在靶序列中具有相同的对应物的查询序列中的位置的百分比被报告为％同一性。
[0040] 当作为结合多肽的支架使用时，本文公开的序列与已知的、类似的支架相比提供 了优势，并已被工程化为显示高结构稳定性并因此改进的存储保质期。这些优势还适用于 本公开内容的第三方面(进一步参见下文），其涉及该第一方面的多肽变体的群体。
[0041] 在本公开内容的一个实施方案中，
[0042]在一个实施方案中，X26是K。
[0043] 在一个实施方案中，X29X3QPX32是DDPS。
[0044] 在一个实施方案中，X29X3QPX32是RQPE。
[0045] 在一个实施方案中，X35是S。
[0046]在一个实施方案中，X36是E。
[0047]在一个实施方案中，X39是S。
[0048] 在一个实施方案中，X45选自E和S。
[0049] 在一个实施方案中，X45是E。
[0050] 在一个实施方案中，X45是S。
[0051 ] 在一个实施方案中，X46选自E和S。
[0052] 在一个实施方案中，X46是E。
[0053] 在一个实施方案中，X46是S。
[0054] 在一个实施方案中，X46是D。
[0055] 在一个实施方案中，当X45是N时，X46不是D或E。
[0056] 在一个实施方案中，X45X46选自EE、ES、SE和SS，诸如选自ES和SE。
[0057] 在一个实施方案中，X45X46是ES。
[0058] 在一个实施方案中，X45X46是SE。
[0059] 在一个实施方案中 ?X45X46^SD〇
[0060] 在一个实施方案中，X47是s。
[0061] 如在本说明书中使用的术语"对预定靶的结合亲和力"指多肽的特性，其可例如通 过使用表面等离子体共振(SPR)技术来测试。例如，所述结合亲和力可在实验中测试，其中 预定靶或其片段被固定在仪器的传感器芯片上，且包含待测试的多肽的样品在芯片上通 过。可选地，将待测试的多肽固定在仪器的传感器芯片上，且包含预定靶或其片段的样品在 芯片上通过。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以建立多肽对预定靶的结合 亲和力的至少定性的测量。如果定量测量是期望的，例如以确定相互作用的Kd值，表面等离 子体共振方法也可被使用。例如，结合值可以在Biacore(GE Healthcare)或ProteOn XPR 36 (Bio-Rad)仪器中来定义。将预定革El适当地固定在仪器的传感器芯片上，且其亲和力待被 确定的多肽的样品通过连续稀释来制备并以随机顺序注入。然后，Kd值可使用例如 BIAevaluation 4.1软件的I: ILangmui结合模型，或由仪器制造商提供的其他适当的软件 从结果计算。
[0062] 如在本文中使用的术语"对预定靶的结合亲和力"可还指可通过例如ELISA测试的 多肽的特性。例如，结合亲和力可在实验中被测试，其中多肽的样品被捕获在抗体包被的 ELISA板上，并且添加生物素化的预定靶、或其片段，随后是链霉亲和素缀合的HRP。添加 TMB 底物，并且使用多孔板阅读器诸如Victor3(Perkin Elmer)测量在450nm处的吸光度。然后， 技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以建立复合物对预定靶的结合亲和力的至少定 性的测量。如果定量测量是期望的，例如，以确定相互作用的EC50值(半数最大有效浓度）， 还可使用ELISA。如以上描述的使用ELISA来测量多肽对预定靶或其片段的系列稀释液的响 应。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，且EC50值可使用例如GraphPad Prism 5和非线性回归从结果计算。
[0063]如先前所描述的，Z变体多肽被认为构成三螺旋束蛋白结构域，或形成三螺旋束蛋 白结构域的一部分，在所述三螺旋束蛋白结构域中，具有对预定靶的亲和力的基序基本上 形成具有连接环（interconnecting loop)的两个α螺旋的部分。
[0064] 可进行对如以上定义的多肽的不同修饰和/或添加以便定制多肽以适应预期的特 定用途，而不偏离本发明的范围。
[0065] 此类修饰和添加在下面更详细地描述，并可包括包含在相同多肽链中的另外的氨 基酸、或与多肽化学缀合或以其他方式结合的标记物和/或治疗剂。
[0066] 因此，在一个实施方案中，提供了如以上描述的多肽，所述多肽包含另外的氨基酸 残基。在一些实施方案中，另外的氨基酸残基可位于多肽的C-末端。在一些实施方案中，另 外的氨基酸残基可位于多肽的N-末端。
[0067] 在一个实施方案中，在C-末端的所述另外的氨基酸残基包括ΑΡ。
[0068] 在一个实施方案中，在N-末端的所述另外的氨基酸残基包括ΑΕΑΚΥΑΚ。
[0069] 在又另一个实施方案中，提供了如以上描述的多肽，所述多肽由具有在N-末端的 从0至7个另外的氨基酸残基和在C-末端的从0至3个另外的氨基酸残基的序列i)或ii)组 成。
[0070] 另外的氨基酸残基可在多肽的结合中起作用，但同样可良好地用于其他目的，例 如，涉及多肽的产生、纯化、稳定化、偶联或检测的一个或更多个目的。在一些实施方案中， 所述另外的氨基酸残基构成一个或更多个多肽结构域。
[0071] 此类另外的氨基酸残基可包括添加的用于化学偶联目的一个或更多个氨基酸残 基。这一情况的实例是在多肽链中第一个或最后一个位置，即在N-末端或C-末端添加半胱 氨酸残基。用于化学偶联的半胱氨酸残基还可通过替换在蛋白结构域的表面上，优选地在 不涉及靶结合的表面的部分上的另一个氨基酸来引入。此类另外的氨基酸残基还可包括用 于纯化或检测多肽的"标签"，诸如用于与标签特异性抗体相互作用的六组氨酸(His 6)标 签、或"my c"标签或"FLAG"标签。技术人员知道其他替代性选择。
[0072] 以上讨论的"另外的氨基酸残基"还可构成具有任何期望的功能的一个或更多个 多肽结构域，所述功能诸如另一种结合功能、或延长半衰期的功能、或酶促功能、或螯合金 属离子的功能、或荧光功能、或其任何组合。
[0073] 在一个示例性实施方案中，提供了具有对预定靶的亲和力的化合物，所述化合物 包含：
[0074] A.如以上定义的至少一种多肽；
[0075] B.链球菌(streptococcal)蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域或其衍生物；以及
[0076] C.任选地，至少一个连接部分，所述连接部分用于将所述至少一个白蛋白结合结 构域或其衍生物连接至所述至少一种多肽的C-末端或N-末端。
[0077] 链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域的衍生物的非限制性实例在W02009/016043和 W02012/004384 中被公开。
[0078] 另外，在另外的实施方案中，提供了如以上定义的多肽，所述多肽包含选自以下的 氨基酸序列：
[0079] YAK EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29X30PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP;和
[0080] FNK EX2X3X4AX6X7EIX10X1