病毒样颗粒的纯化的制作方法
【专利说明】病毒样颗粒的纯化
[0001] 相关专利申请相互参考
[0002] 本申请要求获得美国临时专利申请No. 61/663, 218和美国临时专利申请 No. 61/794, 086 的优先权，No. 61/663, 218 于 2012 年 6 月 22 日提出申请，No. 61/794, 086 于2013年3月15日提出申请，本文引用其每一个的全部内容作为参考。 发明领域
[0003] 本发明属于疫苗领域，包括诺如病毒疫苗。本发明的各方面涉及制备和纯化疫苗 组合物的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 病毒样颗粒（VLP)的生产一般涉及VLP在宿主细胞表达系统内的表达和组装。为 了从最终的生产培养物中除去传染剂（infectious agent),普遍使用病毒过滤，虽然也可 以使用其他方法，例如UV失活或化学失活（单独使用或者与基于过滤的方法联合使用）。 然而，对于更大的生物组分如VLP，病毒过滤无效，因为VLP的大小经常与传染剂（例如，病 毒）太接近，以致不能够仅通过过滤将之与这些传染剂分离。
[0006] 在具体的实施例中，在Sf9昆虫细胞中进行VLP的杆状病毒表达之后，所得的大 量生产培养物含有高水平的处理污染物，包括宿主细胞蛋白、核酸和活的传染剂，包括杆状 病毒。尽管通过低速离心和过滤收获VLP生产培养物可以产生澄清的适合于下游纯化的 样品，但是这些方法不适合除去宿主细胞蛋白和活病毒，包括杆状病毒。因此，在制备VLP 时，在收获期间需要使用其它的方法使传染剂失活和/或清除处理污染物，以方便下游的 处理。 发明概要
[0007] 本文提供了可用于从VLP细胞裂解物和生产培养物中清除处理污染物的方法，以 及由此生产的VLP组合物。在一个实施方案中，本发明的方法包括产生或获得含有所述VLP 的细胞裂解物、培养物上清液或滤出液，和将裂解物、上清液或滤出液的pH调节到小于大 约5的pH值，从而产生pH被调节的溶液。该方法进一步包括从pH被调节的溶液中除去非 VLP微粒/聚集物，从而产生包含VLP的纯化溶液。
[0008] 在一些实施方案中，本发明的pH处理方法可用于分离结构上多样的（diverse) VLP群体，其中VLP至少包括VLP的第一亚群和第二亚群。分离非VLP微粒/聚集物可以包 括将VLP第二亚群与pH被调节的溶液分离，从而产生纯化溶液，其中纯化溶液基本上保留 VLP的第一亚群。该方法可以进一步包括，在将VLP第二亚群与纯化溶液分离之后，将VLP 第一亚群与纯化溶液分离。在一些实施方案中，VLP是诺如病毒VLP，其中第一亚群包括具 有全长VPl亚单位的诺如病毒VLP，并且其中第二亚群包括具有截短的VPl亚单位的诺如病 毒VLP。在这种处理之后，VLP第一亚群与残余污染蛋白之间的比值被增加至少大约50%。 在一些实施方案中，在这种处理之后，VLP第一亚群与残余污染蛋白之间的比值被增加至少 大约80%。
[0009] 在一些实施方案中，分离包括一种或多种如下的处理：离心、沉淀、絮凝、沉降和过 滤。在一些实施方案中，除去VLP包括使用一种或多种色谱处理将VLP第一亚群与纯化溶 液分离。
[0010] 在本发明的一些方面中，用于纯化VLP的方法包括产生或获得含有VLP的细胞裂 解物、培养物上清液或滤出液；和使用多步色谱处理纯化VLP，从而产生纯化溶液。多步色 谱处理的至少一个色谱处理包括使裂解物、上清液或滤出液与色谱材料接触，其中VLP与 所述色谱材料结合；用溶剂和/或去污剂处理色谱材料；和在所述处理后，将VLP从色谱材 料洗脱。每一个色谱处理均独立地从下组中选出：羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、尺 寸排阻色谱、离子交换色谱、混合模式色谱、基于膜的色谱和亲和色谱。在一些实施方案中， 多步色谱处理的第一色谱处理是离子交换色谱，其中离子交换色谱从阴离子交换色谱和阳 离子交换色谱中选出。
[0011] 在一些实施方案中，多步色谱处理的第一色谱处理是阳离子交换色谱，并且所述 处理步骤在阳离子交换色谱处理的阳离子交换柱上执行。在一些实施方案中，多步色谱处 理的第一色谱处理是羟基磷灰石色谱，并且所述处理步骤在羟基磷灰石色谱处理的羟基磷 灰石柱上执行。在一些实施方案中，多步色谱处理的第一色谱处理是亲和色谱，并且所述处 理步骤在亲和色谱处理的亲和柱上执行。在一些实施方案中，多步色谱处理的第一色谱处 理是混合模式色谱，并且所述处理步骤在混合模式色谱处理的混合模式柱上执行。在一些 实施方案中，多步色谱处理的第一色谱处理是疏水相互作用色谱，并且所述处理步骤在疏 水相互作用色谱处理的疏水相互作用柱上执行。在一些实施方案中，该方法进一步包括一 种或多种额外的色谱处理。
[0012] 溶剂和/或去污剂包括如下的一种或多种：磷酸三丁酯（TnBP)，非离子去污 剂（包括Triton X-100和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（polyoxyethylene sorbitan monooleate))，两性离子去污剂（包括CHAPS和Zwittergent 3-12))和离子去污剂（包括 胆酸钠和二甲基二（十八烧基）溴化铵（Dimethyldioctadecylammonium bromide))。
[0013] 在一些实施方案中，VLP是如下的一种或多种：诺如病毒基因群I VLP、诺如病毒 基因群II VLP、诺如病毒基因群IV VLP、嵌合诺如病毒VLP，工程化的诺如病毒VLP变体、和 沙波病毒（sap〇Virus)VLP。在一些实施方案中，VLP是一种或多种沙波病毒VLP。在一些 实施方案中，VLP与残余污染蛋白的比值被增加至少2倍。
[0014] 在一些实施方案中，与裂解物、上清液或滤出液相比，VLP与残余污染蛋白的比值 被增加至少10倍。在一些实施方案中，至少大约50 %的残余污染蛋白被从裂解物、上清液 或滤出液中除去。在一些实施方案中，在所述纯化期间，不超过大约50%的VLP被损失。
[0015] 在一些实施方案中，裂解物、上清液或滤出液使用重组方法产生，并且VLP在细菌 细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中产生。VLP还可以在植物细胞中产生。
[0016] 在本发明的一些方面中，纯化VLP的方法包括产生或获得含有VLP的细胞裂解物 或培养物上清液/滤出液，所述VLP至少包含VLP的第一亚群和第二亚群。该方法进一步 包括将裂解物、上清液或滤出液的PH调节到低于大约5的pH，并使用过滤处理从pH被调节 的溶液中除去VLP的第二亚群，从而产生过滤溶液。过滤溶液基本上保留VLP的第一亚群。 该方法额外包括使用多步色谱处理将VLP的第一亚群与过滤溶液分离，其并入至少一个柱 上溶剂和/或去污剂处理步骤。在一些实施方案中，VLP第一群与残余污染蛋白的比值被 增加至少大约2倍。在一些实施方案中，过滤处理包括深层过滤处理。
[0017] 在一些实施方案中,VLP是如下的一种或多种：诺如病毒基因群I VLP和诺如病毒 基因群II VLP。在其他实施方案中，VLP是如下的一种或多种：诺如病毒基因群IV VLP和 其他可在将来被确定感染人类的诺如病毒基因群。
[0018] 在一些实施方案中，纯化VLP的方法包括产生或获得含有VLP的细胞裂解物、培 养物上清液或滤出液。该方法进一步包括将裂解物、上清液或滤出液的PH调节到小于大 约5的pH，产生pH被调节的溶液。该方法额外包括从pH被调节的溶液中除去非VLP微粒 /聚集物，从而产生纯化溶液，所述除去包括通过深层过滤处理使PH被调节的溶液澄清，从 而产生纯化的深层过滤溶液。在一些实施方案中，所述深层过滤处理包括使pH被调节的 溶液与一种或多种深层过滤器（depth filter)接触，从而产生纯化溶液。在一些实施方案 中，至少一个深层过滤器是硅藻土深层过滤器。在一些实施方案中，一个或多个深层过滤器 是多个硅藻土深层过滤器，其每一个具有从下述范围中独立选出的过滤容量：大约50升/ m2-大约1000升/m2。在一些实施方案中，一个或多个深层过滤器是单深层过滤器（single depth filter)，其每一个具有从下述范围中选出的过滤容量：大约150升/m2-大约400升 /m 2。在一些实施方案中，与裂解物、上清液或滤出液相比，至少大约95 %的残余污染核酸被 从pH被调节的溶液中除去。在一些实施方案中，与裂解物、上清液或滤出液相比，至少大约 75%的VLP被从pH被调节的溶液中回收。
[0019] 在本发明的一些方面中，本发明的溶液包括诺如病毒VLP的纯化群，其中通过尺 寸排阻色谱和ELISA测量，所述溶液含有不超过10 %的残余污染蛋白。在一些实施方案中， 溶液从含有诺如病毒VLP的细胞裂解物、培养物上清液或滤出液中纯化。在一些实施方案 中，与裂解物、上清液或滤出液相比，溶液含有不超过35 %残余污染核酸。在一些实施方案 中，裂解物、上清液或滤出液中至少大约50%的诺如病毒VLP被回收。在一些实施方案中， 与裂解物、上清液或滤出液相比，诺如病毒VLP与残余污染蛋白的比值被增加至少大约10 倍。
[0020] 在本发明的一些方面中，本发明的溶液包括VLP的纯化群体，其中所述溶液含有 至少大约50%的具有全长VPl亚单位的VLP。在一些实施方案中，溶液含有高达大约100% 的具有全长VPl亚单位的VLP。在一些实施方案中，溶液基本上没有具有截短的VPl亚单位 的VLP。在一些实施方案中，溶液从含有至少大约10%具有截短的VPl亚单位的VLP的起 始材料中产生。在一些实施方案中，起始材料是含有VLP的细胞裂解物、培养物上清液或滤 出液。
[0021] 在本发明的一些方面中，使含有活病毒和进一步含有由活宿主细胞病毒产生的 VLP的溶液中的活病毒清除和/或失活的方法，包括将溶液的pH调节到小于大约5的pH 值，从而产生pH被调节的溶液。在一些实施方案中，pH被调节的溶液中活病毒的水平被减 少至少大约IO4倍。在一些实施方案中，pH被调节的溶液中活病毒的水平被减少至少大约 IO5倍。活病毒能够包括，但不仅限于，宿主细胞病毒、生产病毒（例如杆状病毒）、和其他 污染病毒，例如由于人为处理产生的。
[0022] 在一些实施方案中，方法进一步包括从pH被调节的溶液中除去非VLP微粒/聚集 物，从而产生纯化溶液，并且使用至少一种色谱处理对纯化溶液进行纯化。该至少一种色谱 处理包括使纯化溶液与色谱材料接触，其中VLP与所述色谱材料结合，和用溶剂和/或去污 剂处理色谱材料。该至少一个色谱处理进一步包括在所述处理之后将VLP从色谱材料洗 脱，从而产生洗脱液。在一些实施方案中，与含有活病毒的溶液相比，洗脱液中活病毒的水 平被减少至少大约IO2倍。
[0023] 在本发明的一些方面中，使含有活病毒和进一步含有由活病毒产生的VLP的溶液 中的活病毒清除和/或失活的方法，包括使用至少一种色谱处理对含有活病毒的溶液进行 纯化。该至少一种色谱处理包括使含有活病毒的溶液与色谱材料接触，其中VLP与所述色 谱材料结合，和用溶剂和/或去污剂处理色谱材料。该至少一种色谱处理进一步包括在所 述处理之后将VLP从色谱材料洗脱，从而产生洗脱液。在一些实施方案中，与含有活病毒的 溶液相比，洗脱液中活残余污染病毒的水平被减少至少大约IO 5倍。在一些实施方案中，与 含有活病毒的溶液相比，洗脱液中活病毒的水平被减少至少大约IO7倍。
[0024] 本发明还包括通过本文公开的方法产生的VLP组合物，和包含VLP以及一种或多 种佐剂和/或赋形剂的疫苗组合物。本文产生的VLP组合物的优点在于，它们具有更少的 处理污染物，并且在生产期间基本上没有形成异常的VLP结构。
[0025] 附图简述
[0026] 图IA图解了低pH处理，是经过染色的、以Norwalk VPl亚单位为主要条带的 SDS-PAGE凝胶，其中泳道1是批量（bulk) Norwalk VLP生产培养物（总）；泳道2是VLP生 产培养物-微量离心上清液/滤出液；泳道3是VLP生产培养物-微量离心沉淀（pellet); 泳道4是经过低pH处理之后的批量（bulk) VLP生产培养物（总）；和泳道5是经过低pH处 理、低速离心和0. 2 μ m过滤之后的VLP生产培养物（最终收获材料）；
[0027] 图IB图解了低pH处理，是经过染色的、以Consensus VPl亚单位为主要条带的 SDS-PAGE凝胶，其中泳道1是批量Consensus VLP生产培养物（总）；和泳道2是经过低pH 处理、低速离心和0. 2 μ m过滤之后的VLP生产培养物（最终收获材料）；
[0028] 图2A图解了溶剂/去污剂处理，是在阳离子交换捕获色谱期间结合和洗脱单元操 作的代表性色谱图，其中Norwalk VLP条件培养基以lOOmL/min加载于180mL柱床体积的 Sartobind S囊室（capsule)上。色谱图显示：1)条件培养基加载；2)溶剂/去污剂清洗； 和 3) Norwalk VLP 洗脱；
[0029] 图2B图解了溶剂/去污剂处理，是在羟基磷灰石捕获色谱期间结合和洗脱单元操 作的代表性色谱图，其中Norwalk VLP条件培养基以80mL/min加载于250mL柱床体积的羟 基磷灰石柱上。色谱图显示：1)条件培养基加载；2)溶剂/去污剂清洗；和3) IOOmM磷酸 盐清洗；和4) Norwalk VLP洗脱；
[0030] 图3A图解了 VLP完整性分析，是分析型尺寸排阻色谱图，其中色谱图证明7. 4分 钟的峰与组装的颗粒一致；
[0031] 图3B图解了 VLP完整性分析，是透射电子显微镜图，其证明有T3二十面体 (icosohedral)VLP 的预期?30_40nm 颗粒；
[0032] 图4A图解了 VLP生产和通过离心收获的流程图；和
[0033] 图4B图解了 VLP生产和通过深层过滤收获的流程图。
[0034] 发明详细说明书
[0035] 本发明涉及溶液和/或疫苗组合物的制备，特别地涉及纯化VLP的方法。特别地， 本发明人发现，VLP生产培养物的低pH处理步骤有利于处理污染物，例如活宿主细胞病毒 和残余污染蛋白、以及VLP群体的一些变体的清除，同时保持免疫原性和VLP结构的完整 性。例如，为了纯化诺如病毒VLP，本发明人发现，低pH处理步骤导致使活病毒和具有截短 VPl亚单位的诺如病毒VLP基本上被除去和/或失活。
[0036] 可以理解，本发明的方