步骤，随后进 行多步色谱处理，如前所述。
[0085] 在一些实施方案中，诺如病毒VLP纯化群体的溶液与细胞裂解物或培养物上清 液/滤出液相比不含残余污染核酸。在一些实施方案中，诺如病毒VLP纯化群体的溶液与 细胞裂解物或培养物上清液/滤出液相比含有不超过大约1 %，不超过大约2 %，不超过大 约3 %，不超过大约4 %，不超过大约5 %，不超过大约10 %，不超过大约15 %，不超过大约 20 %，不超过大约25 %，不超过大约30 %，不超过大约35 %，不超过大约40 %，不超过大约 45 %，不超过大约50 %，不超过大约55 %，不超过大约60 %，不超过大约65 %，不超过大约 70%，不超过大约75%，不超过大约80%，和其间所有数值的残余污染核酸。
[0086] 在一些实施方案中，溶液含有大约100%的来自原始裂解物、上清液或滤出液的诺 如病毒VLP。在一些实施方案中，溶液含有大约95 %，大约90 %，大约85 %，大约80 %，大约 75%，大约70%，大约65%，大约60%，大约55%，大约50%，大约45%，大约40%，和其间 所有数值的来自原始裂解物、上清液或滤出液的诺如病毒VLP。
[0087] 在一些实施方案中，诺如病毒VLP与残余污染蛋白的比值与原始裂解物、上清液 或滤出液相比被增加至少大约50倍。在一些实施方案中，诺如病毒VLP与残余污染蛋白的 比值与原始裂解物、上清液或滤出液相比被增加至少大约45倍，至少大约40倍，至少大约 35倍，至少大约30倍，至少大约25倍，至少大约15倍，至少大约10倍，至少大约5倍，至少 大约4倍，至少大约3倍，至少大约2倍，和其间所有数值。
[0088] 在一些实施方案中，诺如病毒VLP纯化群体的溶液可用于商业方法，例如用于疫 苗的临床和大规模制造。在一些实施方案中，与临床和大规模制造过程相关的加工体积可 以低至20升。例如，在一些实施方案中，疫苗能够从包含诺如病毒VLP的溶液中制备。
[0089] 在一些实施方案中，本发明的方面进一步可操作用于提供具有VLP纯化群体的溶 液，其中所述溶液含有至少大约50%具有全长VPl亚单位的VLP。在一些实施方案中，具 有VLP纯化群体的溶液含有至少大约55 %，至少大约60 %，至少大约65 %，至少大约70 %， 至少大约75 %，至少大约80 %，至少大约85 %，至少大约90 %，至少大约95 %，至少大约 100%，和其间所有数值的具有全长VPl亚单位的VLP。换言之，具有VLP纯化群体的溶液可 以基本上没有具有截短的VPl亚单位的VLP。在一些实施方案中，具有VLP纯化群体的溶液 含有至多大约5%，至多大约10%，至多大约15%，至多大约20%，至多大约25%，至多大约 30%，至多大约35%，至多大约40%，至多大约45%，至多大约50%，和其间所有数值的具 有截短的VPl亚单位的VLP。
[0090] 在一些实施方案中，具有VLP纯化群体的溶液可以从含有至少大约5%具有截短 的VPl亚单位的VLP的未纯化溶液中产生。在一些实施方案中，未纯化的溶液可以含有至少 大约6%，至少大约7%，至少大约8%，至少大约9%，至少大约10%，至少大约15%，至少 大约20%，至少大约25%，至少大约30%，至少大约35%，至少大约40%，至少大约45%， 至少大约50%，和其间所有数值的具有截短的VPl亚单位的VLP。
[0091] 未纯化的溶液可以是任何经过处理的/未经处理的溶液，包括细胞裂解物溶液、 培养物上清液、滤出液、pH被调节的溶液，和/或类似物。在一些实施方案中，具有VLP纯 化群体的溶液通过pH处理步骤和从pH处理除去被截短的VPl亚单位，从未经纯化的溶液 中产生，如前所述。除去通过如下的一种或多种执行：离心、沉淀、絮凝、沉降、过滤、和/或 类似方法。在一些实施方案中，具有全长VPl亚单位的VLP的纯化群体可以通过向具有VLP 纯化群体的溶液应用一种或多种色谱处理而产生。
[0092] 有利地，通过这些实施方案的任一个产生的纯化VLP基本上没有活病毒传染剂。 没有传染剂可以指不存在能够传染的活性剂，例如活的宿主细胞病毒自身。换言之，纯化的 VLP可以含有失活的并且不能传染的试剂。作为举例，含有已经被处理从而杆状病毒不再 能够传染的杆状病毒的样品，虽然该样品仍然含有失活的杆状病毒，但是没有了传染剂。而 且，样品不需要绝对没有能够传染的试剂，相反，样品仅需要充分地没有活性剂从而使样品 可以用于其意图的目的，如人或动物疫苗即可（即，它满足任何美国联邦法规关于人或动 物疫苗内传染剂的可接受水平即可）。
[0093] 本发明的方法特别可用作规模放大VLP生产用于临床和商业制造的方法。并入了 低pH处理和/或柱上溶剂和/或去污剂处理步骤的纯化方法可产生至少大约50-250mg纯 化VLP/L起始培养物，至少大约200-400mg纯化VLP/L起始培养物，至少大约350-500mg纯 化VLP/L起始培养物，至少大约400-750mg纯化VLP/L起始培养物，至少大约700-850mg纯 化VLP/L起始培养物，至少大约800-1000mg纯化VLP/L起始培养物，和其间所有数值。所 产生的VLP基本上没有处理污染物和异常VLP结构。在这种情况下，基本上没有意味着，正 如本领域技术人员会意识到的，尽管可以意图除去所有的处理污染物和异常VLP结构，但 是与本文所述程序相关的实际方面可能不会导致从最终组合物中完全清除掉污染物和异 常VLP，但仍可用于其意图的目的。
[0094] 本发明的实施方案进一步可操作以包含疫苗，其包括通过上述方法纯化的VLP的 第一亚群。典型地，这些疫苗可以制备成注射剂，作为液体溶液或混悬液；也可以制备成适 合于在注射前溶解或混悬在液体中的固体形式。这些制备物还可以被乳化或者生产成干 粉。活性免疫原性成分经常与药物可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋 形剂包括，例如，水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物，及其组合。
[0095] 此外，如果期望，疫苗可以含有辅助物质（auxiliary substance)，例如润湿 剂或乳化剂、pH缓冲剂、或可提高疫苗效力的佐剂。在一些实施方案中，疫苗组合物 包括一种或多种与纯化VLP联合的佐剂。大多数佐剂含有被设计成保护抗原免于快 速分解代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答的刺激剂，例如百日咳博德特 氏菌（Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)来 源的蛋白质。合适的佐剂是商业可获得的，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂（Pifco Laboratories, Detroit, Mich. ) ;Merck 佐剂 65 (Merck and Company, Inc. , Rahway, N. J.)； 铝盐例如氢氧化铝凝胶（明矾）或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸、酰化糖的不溶混悬 液；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球；和Quil A。
[0096] 合适的佐剂还包括，但不仅限于，toll样受体（TLR)激动剂，特别是toll样受体4 型（TLR-4)激动剂（例如单磷酰脂质A (MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物），铝盐， 细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽（MDP)衍生物，CpG寡聚体，革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS)，聚 磷腈，乳剂，病毒颗粒（virosome) ,cochleate，聚（乙交酯/丙交酯）（PLG)微球，泊洛沙姆 (poloxamer)颗粒，微粒，脂质体，水包油乳剂，MF59,和角S烯。在一些实施方案中，佐剂不 是细菌来源的外毒素。优选的佐剂包括刺激Thl型响应的佐剂，例如3DMPL或QS21。
[0097] 单磷酰脂质A(MPL)，一种来自沙门氏菌（Salmonella)脂质A的无毒衍生物，是 强TLR-4激动剂，已经被开发作为疫苗佐剂（Evans et al. 2003)。在临床前鼠科动物研究 中，鼻内施加 MPL显示可增强分泌性以及系统性体液响应（Baldridge et al. 2000 ;Yang et al. 2002)。还已经在超过120, 000名患者的临床研究中证明了其作为疫苗佐剂的安全 性和有效性（Baldrick et al.，2002 ;Baldridge et al. 2004)。MPL 刺激通过 TLR-4 受体 诱发先天免疫，因此能够引发针对广泛传感病原体的非特异性免疫应答，所述传染病原体 包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、病毒和寄生虫（Baldridge et al. 2004 ;Persing et al. 2002)。在疫苗制剂中包含MPL应当可实现快速诱发先天响应，由病毒刺激（challenge) 引起非特异性免疫应答，同时增强由疫苗的抗原组分产生的特异性响应。
[0098] 在一些实施方案中，本发明提供了疫苗，其包括单磷酰脂质A (MPL)或3De-0_酰化 单磷酰脂质A(3D-MPL)作为获得性和先天性免疫的增强剂。在化学上，3D-MPL是具有4、5 或6个酰化链的3De-0-酰化单磷酰脂质A的混合物。3De-0-酰化单磷酰脂质A的优选形 式在欧洲专利0689454B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA)中被公开，本文引用其内 容作为参考。在另一个实施方案中，本发明提供了疫苗组合物，其包括合成脂质A、脂质A模 拟物或类似物，例如BioMira' s PET脂质A，或被设计成发挥类似TLR-4激动剂功能的合成 衍生物。
[0099] 在某些实施方案中，疫苗组合物包含两种佐剂。佐剂的组合可以从上面所述的那 些中选出。在一个特殊的实施方案中，两种佐剂是MPL和氢氧化铝（例如明矾）。在另一个 特殊实施方案中，两种佐剂是MPL和油。
[0100] 术语"有效佐剂量"或"有效量佐剂"是本领域技术人员充分理解的，包括能够刺激 针对所施加抗原的免疫应答的一种或多种佐剂的量，即在根据鼻洗液（nasal washing)的 IgA水平、血清IgG或IgM水平、或B和T细胞增殖进行测量时，可增加所施加抗原组合物的 免疫应答的量。免疫球蛋白水平的适当有效增加包括与没有任何佐剂的相同抗原组合物相 t匕，超过5 %，优选地超过25 %，特别地超过50 %。
[0101] 在一个实施方案中，本发明提供了被制备成用于肠胃外给药的疫苗组合物，其中 该组合物包括纯化的VLP联合氢氧化铝和缓冲液。缓冲液可以选自下组：L-组氨酸、咪唑、 琥拍酸、tris、朽1 檬酸、1^8-1：1^8、。1。68、11168、116。68、甘氨酰胺、和1：1'；[0；[116。在一个实施方 案中，缓冲液是L-组氨酸或咪唑。优选地，缓冲液的存在浓度为大约15mM-大约50mM，更优 选地大约18mM-大约40mM，或者最优选地大约20mM-大约25mM。在一些实施方案中，抗原 或疫苗组合物的pH为大约6. 0-大约7. 0,或者大约6. 2-大约6. 8,或大约6. 5。疫苗组合 物可以是水成制剂。
[0102] 在一些实施方案中，除了 VLP、氢氧化铝和缓冲液之外，疫苗组合物进一步包括至 少一种佐剂。例如，佐剂可是toll样受体激动剂，例如MPL、鞭毛蛋白、CpG寡聚体、合成脂 质A或脂质A模拟物或类似物。在一些实施方案中，佐剂是MPL。
[0103] 在一个实施方案中，本发明的疫苗可以被制备成干粉，其含有一种或多种纯化 VLP抗原作为免疫原，佐剂如MPL，生物聚合物如壳聚糖以促进附着于粘膜表面，和膨胀剂 (bulking agent)如甘露醇和鹿糖。使用诺如病毒作为无包膜病毒的非限制性实例，诺如 病毒疫苗可以被制备成IOmg干粉，含有一种或多种诺如病毒基因群抗原（例如Norwalk病 毒、Houston病毒、雪山病毒（Snow Mountain virus))、MPL佐剂、壳聚糖粘膜粘着剂、和甘 露醇和蔗糖（或其他糖，如葡萄糖、乳糖、海藻糖和甘油）作为膨胀剂并提供合适的流动特 性。制剂可以包含大约7.011^(25-90% w/w范围）壳聚糖，大约1.5mg甘露醇（0-50% w/w 范围），大约1.5mg蔗糖（0-50% w/w范围），大约25yg MPL(0. 1-5% w/w范围），和大约 100 μ g诺如病毒抗原（0. 05-5% w/w范围）。
[0104] 继续使用上述的诺如病毒疫苗制剂，诺如病毒抗原在疫苗中的存在浓度可为大约 0. 01% (w/w)_大约80% (w/w)。在一些实施方案中，诺如病毒抗原可以被制备成每IOmg 干粉制剂含大约5 μ g，大约15 μ g，和大约50 μ g的剂量（0. 025, 0. 075和0. 25 % w/w)，用 于施加到两个鼻孔中，或者大约10 μ g，大约30 μ g，和大约100 μ g (0. 1，0. 3和1. 0 % w/w)， 用于施加到一个鼻孔中。制剂可以在每次给药期间施加到一个或两个鼻孔中。在第一次 给药后，可以有一个1-12周的加强给药（booster administration),以提高免疫应答。免 疫和抗原制剂中诺如病毒抗原含量的范围可以是1μ g-l〇〇mg，优选地1-500μ g，更优选地 5-200 μ g，最典型地10-100 μ g。每个剂量施加的总诺如病毒抗原可以是大约10 μ g，大约 30 μ g，或大约100 μ g，在施加给两个鼻孔时，总共含于20mg干粉中，或者在施加给一个鼻 孔时，总共含于IOmg干粉中。干粉特征是使少于10%的颗粒的直径小于10 μ m。平均颗粒 尺寸范围是直径为10-500 μ m。
[0105] 在一些实施方案中，疫苗组合物是冻干粉并被重建成水成制剂。因此，本发明包括 制造纯化诺如病毒组合物的方法，包括（a)制备包含诺如病毒抗原、蔗糖和壳聚糖的冻干 前溶液，其中蔗糖与壳聚糖的比值为大约0:1-大约10:1 ;(b)冷冻溶液；和（c)将冷冻溶 液冻干30-72小时，其中最终的冻干产物含有一定百分比的呈聚集形式的所述诺如病毒抗 原。冻干可以在环境温度、低温下发生，或者在各种温度的循环中进行。仅出于例证的目 的，冻干可以通过一系列步骤发生，例如通过如下的周期：开始于-69°C，在3小时内逐渐调 节到-24°C，然后保持该温度18小时，然后在1小时内逐渐调节到-16°C，然后保持该温度 6小时，然后在3小时内逐渐调节到+34°C，最后保持该温度9小时。在一个实施方案中，冻 干前溶液进一步包括膨胀剂。在另一个实施方案中，所述膨胀剂是甘露醇。
[01