用于生产b型流感嗜血杆菌抗原的方法
【专利说明】用于生产b型流感嗜血杆菌抗原的方法
[0001] 本发明涉及用于在工业规模上生产b型流感嗜血杆菌（Hib)的荚膜多糖的方法， 根据所述方法，将Hib的菌株在特定培养基中培养，所述培养基的组成是在化学上进行定 义的，且因此不包含任何复杂的氮源或碳源。
[0002] 现有技术，具体而言申请W2009007641，描述了用于b型流感嗜血杆菌的改进培养 基，其不包含任何来自动物源的要素，如当培养b型流感嗜血杆菌的目的在于产生将随后 作为抗原引入疫苗组合物的荚膜多糖时所推荐。在该现有技术中描述的培养基中，用植物 蛋白胨代替通常由动物蛋白胨组成的氮源。
[0003] 此类培养基在药物产品的安全性方面而言代表了很大进展，特别是关于消除了疾 病诸如牛海绵状脑炎传播的风险；因此，它们允许符合卫生监督机构的推荐。
[0004] 然而，蛋白胨的组成可以根据所提供的批次而变化，这可以导致产生的细菌量和 还有有用抗原的产量的变化，这是疫苗生产者试图通过改变在方法的实施过程中的某些参 数来限制或校正的。然而，在药物产品的工业生产的背景下，期望能够具有可用的稳健方 法，其需要在每次实施时尽可能少的改变，并且其在每个步骤的结果在批次间是可再现的。
[0005] 此类方法还必须允许产率与工业盈利相容，在从细菌产生抗原的情况下，标准不 仅仅是仅获得最大可能量的细菌，而且获得抗原滴度和产生的细菌量之间的最佳比率；其 因此对于在向着产生荚膜多糖引导细菌的代谢的条件下培养的细菌是期望的。
[0006] 为此，本发明的主题是用于在工业规模上生产意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血 杆菌type b)的荚膜多糖（PRP)的方法，根据所述方法，将b型 流感嗜血杆菌（Hib)的菌株在培养基中培养，收获该培养上清液，处理该培养上清液以便 从其提取荚膜多糖，所述培养基包含至少： -一种碳源， -原卟啉， -盐， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -维生素， -PH调节手段， 其特征在于所述培养基是在化学上确定的。
[0007] 凭借本发明，通过能够具有稳健的工业方法，提高荚膜多糖的产率，而不必相应地 增加生物量，由此使得可能相对于所生产的PRP量降低产生的脂多糖（LPS)的量。
[0008] 此外，培养基组成中不存在蛋白降低了所需的消泡剂产品方面的需求，且简化了 纯化步骤，这使得可能从培养上清液获得由荚膜多糖组成的抗原。
[0009] 根据本发明，所述培养基包含pH调节手段。这些pH调节手段可以由缓冲盐和/ 或与用于将酸或碱添加至培养基的装置组合的PH测量装置组成。借助于pH的调节，产率 可以进行优化。
[0010] 根据一个实施方案，根据本发明的方法还在于将产生的PRP缀合至载体蛋白，诸 如破伤风蛋白。
[0011] 本发明的一个主题还是用于制备疫苗组合物的方法，根据所述方法： -通过于在化学上确定的培养基中培养Hib的菌株在工业规模上制备由荚膜多糖 (PRP)组成的针对b型流感嗜血杆菌（Hib)的抗原，所述培养基的每种成分的性质和量是完 全确定的，且包含至少： -一种碳源， -原卟啉， -盐， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -维生素， -以及PH调节手段， -收获培养上清液，和处理该培养上清液以便由其提取纯化的荚膜多糖， -将荚膜多糖缀合至载体蛋白。
[0012] 根据一个实施方案，还将获得的缀合物与意欲用于针对以下感染中的一种或多 种的接种的至少一种或多种抗原组合：白喉、破伤风、脊髓灰质炎、乙型肝炎、水痘、腮腺 炎、风疫、由脑膜炎奈瑟氏菌（Afci1S1Seria iit/is)或肺炎链球菌（Sire/?iOcoccw1S 引起的感染、由轮状病毒引起的感染，以便获得允许针对数种疾病同时免疫的 疫苗组合。
[0013] 根据本发明，培养基是在化学上确定的，即每种成分的化学结构和还有量是已知 的。此类培养基不含复杂的氮源或碳源，诸如蛋白胨、酪蛋白、血清等，并且可以因此，如果 需要，保证不含任何直接源自动物的要素。
[0014] 本发明涉及用于在工业规模上生产b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖的方法。此类方 法使得可能获得与工业约束相容的生物量和荚膜多糖或PRP的产率。此类方法使得特别 可能从在其遗传密码中具有至少2个拷贝的基因座（编码实现荚膜合成的功能）的b 型流感嗜血杆菌的菌株，在培养12小时后获得对应于至少2. 4的694 nm的D. 0.的生物 量和至少240 mg/升培养基的PRP的相关量的PRP，而不用特定调节培养基（诸如pH或 P〇2)。产生的PRP的量的确定通过高效阴离子交换色谱法与脉冲安培检测器（HPAEC-PAD) (Dionex)联用的技术，或给出等同结果的方法来测量。有利地，根据本发明的方法使得获得 至少270 mg/升培养基的PRP的量，甚至更有利地至少300 mg/升的量。
[0015] 在可能的碳源中，可以提到所有可以由b型流感嗜血杆菌的菌株代谢的碳源，特 别是：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、岩藻糖、唾液酸和乳酸。还可以使用2种或更 多种不同的源，特别是乳酸和葡萄糖。
[0016] 根据本发明，在起始培养基中存在的葡萄糖的量为5和25 g/Ι之间，更特别是10 至20 g/Ι，且更特别是12至16 g/1。
[0017] 起始培养基中存在的乳酸的量可以是0和15 g/1之间，更特别是0. 5至10 g/1。
[0018] 根据本发明的一个实施方案，培养基的原Π 卜啉是合成的原Π 卜啉，例如由 Sigma-Aldrich公司以编号258385 (原卟啉二钠盐）提供的原卟啉。因此，可以使用可保证 是完全不含动物来源的物质的培养基。或者，使用合成的原卟啉IX，其式如下：
【主权项】
1. 用于在工业规模上生产意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血杆菌（ 的荚膜多糖（PRP)的方法，根据所述方法，将b型流感嗜血杆菌（Hib)的菌株 在培养基中培养，收获培养上清液，处理该培养上清液以便从其提取荚膜多糖，所述培养基 包含至少： -一种碳源， -原卟啉， _盐， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -维生素， _ pH调节手段， 其特征在于所述培养基是在化学上确定的。
2. 根据前一权利要求的方法，其特征在于所述培养基至少包含锌。
3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述pH调节手段由缓冲盐组成。
4. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碳源可以是多重的且选自：葡 萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、岩藻糖、唾液酸和乳酸。
5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述原卟啉是合成的原卟啉IX。
6. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述盐选自钾盐、镁盐、钠盐、钙盐、 铁盐、锌盐、钴盐和锰盐。
7. 根据前一权利要求的方法，其特征在于所述盐选自：K 2HP04;KH 2P04;MgS0 4. 7 H20 ; Na2HP04. 12H20 ；NaH2P04. 2H20 ；CaCl2. 2H20 ；FeS04. 7H20 ；ZnS04. 7H20 ；CoCl2. 6 H20 ；MnS04. H20〇
8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸选自： 籲精氨酸， 籲丙氨酸， ?以下中的至少一种：天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸， 籲赖氨酸， ?组氨酸， ?色氨酸， 籲缬氨酸， 籲异亮氨酸， 籲亮氨酸， ?酪氨酸， 籲苯丙氨酸， ?胱氨酸或等效物。
9. 根据前一权利要求的方法，其特征在于所述培养基至少包含精氨酸、丙氨酸、组氨 酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
10. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于用谷胱甘肽或半胱氨酸替代胱氨 酸。
11. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述维生素选自：硫胺素、泛酸 盐、尿嘧啶、次黄嘌呤、生物素、核黄素和吡哆醇。
12. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于用瓜氨酸替代精氨酸和尿嘧啶。
13. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于其还包括将获得的荚膜多糖缀合 至载体蛋白的步骤。
14. 根据前一权利要求的方法，其特征在于所述载体蛋白是破伤风类毒素。
15. 根据前述权利要求中任一项的获得的荚膜多糖用于制备疫苗组合物的用途。
16. 用于制备疫苗组合物的方法，根据所述方法： -a)通过于在化学上确定的培养基中培养Hib的菌株在工业规模上制备由荚膜多糖 (PRP)组成的针对b型流感嗜血杆菌（Hib)的抗原，所述培养基的每种成分的性质和量是完 全确定的，且包含至少： -一种碳源， -原卟啉， -盐， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -维生素， -以及pH调节手段， _ b)收获该培养上清液，处理该培养上清液以便由其提取纯化的荚膜多糖， -c)将步骤b)中获得的荚膜多糖缀合至载体蛋白， -d)将步骤c)中获得的缀合物与用于针对以下感染中的一种或多种的接种的至少一 种或多种抗原组合：白喉、破伤风、脊髓灰质炎、乙型肝炎、水痘、腮腺炎、风疹、由脑膜炎奈 瑟氏菌（Afcisseria )或肺炎链球菌引起的感 染、由轮状病毒引起的感染，以便获得允许针对数种疾病同时免疫的疫苗组合。
【专利摘要】本发明涉及用于在工业规模上生产用于疫苗目的b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖(PRP)的方法，根据所述方法，将b型流感嗜血杆菌(Hib)的菌株在培养基中培养，收获该培养上清液，处理该培养上清液以便从其提取荚膜多糖，所述培养基包含至少：–一种碳源，–原卟啉，–盐，–氨基酸，–NAD或NADH，–维生素，–pH调节手段，其特征在于所述培养基是在化学上确定的。
【IPC分类】A61K39-102, C12N1-20, A61K47-26
【公开号】CN104583390
【申请号】CN201380035582
【发明人】勒希尔 J., 卢比埃 P., 巴比拉托 F., 林德利 N.
【申请人】赛诺菲巴斯德有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年7月2日
【公告号】CA2878053A1, EP2885397A1, US20150167036, WO2014006318A1