专利名称：流感嗜血杆菌多重降落pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感嗜血杆菌感染的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR检测方法在下呼吸道标本中流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)检测中的应用。
背景技术：
流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎的主要病原菌，为苛养菌，其培养需V因子与X因子。主要引起肺炎与脑膜炎，每年造成约300万人严重患病并造成约38. 6万人死亡。多数患者为5岁以下儿童。多数流感嗜血杆菌引起的死亡病例发生于发展中国家，这些国家尚未将流感嗜血杆菌疫苗纳入常规计划内免疫中(中国目前亦为计划外)。成人发生侵袭性流感嗜血杆菌肺炎的危险因素有免疫受损者、C0PD、糖尿病、癌症、脾切除与慢性酒精中毒、金黄色葡萄球菌或甲型流感病毒引起的重症肺炎。疫苗接种可预防由b型流感嗜血杆菌引起的侵袭性疾病的发生。发达国家由于疫苗的广泛接种，儿童流感嗜血杆菌肺炎已被消灭。但在未推广疫苗接种的国家，第年仍可造成数十万儿童死于流感嗜血杆菌感染引起的疾病。Guma M. K. Abdeldaim 等(Guma M. K. Abdeldaim, et al. , Detection ofHaemophilus influenzae in respiratory secretions from pneumonia patientsby quantitative real-time polymerase chain reaction. Diagn Microbiol InfectDisj 2009，64 (4) :366-373.)建立了以omp P6基因为靶标检测流感嗜血杆菌的实时定量PCR，然而他们发现该方法可将部分嗜血杆菌的其它菌种误鉴定为流感嗜血杆菌。同时针对流感嗜血杆菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特异性。Korbie，D. J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick,Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity inPCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3 (9) :p. 1452-1456.)发现降落 PCR 可提高 PCR的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对流感嗜血杆菌omp P6、frdB、16S rRNA基因以检测流感嗜血杆菌的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可直接检测下呼吸道标本中的流感嗜血杆菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中流感嗜血杆菌的多重PCR检测试剂盒及检测方法。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的一种流感嗜血杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括10 X PCR缓冲液，MgC12，dNTP,TaqDNA聚合酶，BSA,流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物；
第I 对5，-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3，( SEQ ID NO. I )与5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’ (SEQ ID NO. 2)；第2 对5，-CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3，( SEQ ID NO. 3)与5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ (SEQ ID NO. 4)；第3 对5，-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3，(SEQ ID NO. 5) (Hendolin
PH, et al. Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial
species in middle ear effusions. J Clin Microbiol, 1997, 35(11):2854-2858.)与
5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3’ (SEQ IDNO. 6)；本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法
(一)提取待检样本DNA(二)多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的omp P6、frdB、16S rRNA基因，具
体步骤如下
反应体系25
H2O12.55 nl
缓冲液(10XPCR)2.5 Jil
BSA (10 mg/ml)0.25 (il
Hi—omp P6-F (10 MinoI/L)0. 5 \il
Hi—omp P6-R (10 WiioI/L)0.5(11
Hi—frdB-F (10 ttnol/L)ItU
Hi—frdB-R (10 Wnol/L)I
Hi—16S rRNA-F (10 mol/L)Ipi
Hi—16S rRNA-R (10 Wnol/L)I
MgCl2 (25 mM)2 jil
ANTP (10 mM)0.5 fil
Taq DNA 聚合酶(.5 U/Ml )0.2 ^il
DNA 模板2 jil3对流感嗜血杆菌引物为Hi_omp P6-F:5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’ (SEQ ID NO. I)Hi_omp P6-R:5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3J (SEQ ID NO. 2)Hi_frdB-F :5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’ (SEQ ID NO. 3)Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ (SEQ ID NO. 4)Hi_16S rRNA-F :5’ -CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3J (SEQ ID NO. 5)Hi_16S rRNA-R:5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J (SEQ ID NO. 6)(三)PCR反应循环参数如下94°C 5min ；94°C 30s, 65°C (每循环降低 0. 5°C ) 30s, 72°C lmin,20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。(四)电泳检测鉴定对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有215bp、620bp、
821bp条带中的任意2条或3条则代表检出流感嗜血杆菌。有益效果本发明所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等
问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测流感嗜血杆菌的3个基因，对流感嗜血杆菌DNA的检测下限达0. 2pg。该多重降落PCR可用于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
图I为建立的多重降落PCR的特异性检测结果；泳道I 一 12模板依次对应为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、卡它莫拉菌(Moraxella (Branhamella) catarrhal is )、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝杆菌 BCG (Mycobacterium bovisBCG);泳道 13 为DL2000DNA分子质量标准；泳道14 一 16模板依次为阳性对照流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、b型流感嗜血杆菌、阴性对照。图2为实施例I检测结果；泳道M为DL2000DNA分子质量标准；泳道I — 10模板 为临床痰标本基因组DNA，泳道5于215bp、821bp处出现2条对应大小的条带，泳道6于215bp、620bp、821bp处出现3条对应大小的条带，判为检出流感嗜血杆菌，其相应标本的细菌培养结果亦证实检出流感嗜血杆菌；泳道11、12为阳性对照与阴性对照。图3为建立的多重降落PCR的检测限检测结果泳道I — 7模板依次对应为b型流感嗜血杆菌基因组DNA 20ng及其10 稀释模板；泳道8为DL2000DNA分子质量标准；泳道9为阴性对照；检出下限为5道模板，对应为2pgb型流感嗜血杆菌基因组DNA。
具体实施例方式实施例I :痰标本预处理痰标本应用生理盐水洗涤2次，加入等量的1%胰酶(当天现配现用)于37°C消化90min。提取痰标本中的细菌DNA :取已消化的痰标本I. 5ml用Takara minibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取痰标本中的细菌DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于一 20°C保存备用。PCR扩增总体系25iU，在200iil PCR小管内依次加入12. 55 U I双蒸水，2. 5 iU缓冲液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 Hi_omp P6-F (10 u mol/L) 0. 5 u l，Hi_ompP6-R (10 u mol/L) 0. 5 u I, Hi_frdB-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_frdB-R (IOu mol/L) Iu I,Hi_16S rRNA-F (lOumo/L) I u I, Hi_16S rRNA-R (10 u mol/L) I u 1, 2 u IMgCl2 (25mM),0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2 ill Taq DNA 聚合酶(5U/iU), 2 提取的痰标本基因组 DNA。同时设流感嗜血杆菌阳性模板对照与阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对流感嗜血杆菌引物为针对流感嗜血杆菌omp P6基因设计的Hi_omp P6_F 5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’，Hi_omp P6-R :5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’，扩增片断长度215bp ；
针对流感嗜血杆菌frdB基因设计的Hi_frdB_F 5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’，Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’，扩增片断长度 620bp ；/
针对流感嗜血杆菌16S rRNA基因设计的Hi_16S rRNA-F 5’-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’，Hi_16S rRNA-R :5’-AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J,扩增片断长度821bp。设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循环降低
0.5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 Ul与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于IXTAE溶液中，在100V电压下，电泳30min，电泳后经0. 5mg/L的溴化乙锭浸泡染色IOlOmin后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。如阴性对照无条带，阳性对照于215bp、620bp、821bp处出现对应大小的条带，检测样本出现215bp、620bp、821bp条带中的任意2条或3条则代表检出流感嗜血杆菌(见图2);如阳性对照于215bp、620bp、821bp处未出现对应大小的条带或阴性对照出现非特异性条带，则判为实验失败，需重新检测。实施例2 多重降落PCR的特异性检测。提取大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、卡它莫拉菌、粪肠球菌、耻垢分枝杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、流感嗜血杆菌与b型流感嗜血杆菌的基因组DNA，取上述细菌的纯培养物用Takaraminibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取其基因组DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于一 20°C保存备用。PCR扩增总体系25iU，在200iU PCR小管内依次加入12. 55 U I双蒸水，2. 5 iU缓冲液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 Hi_omp P6-F (10 u mol/L) 0. 5 u l，Hi_ompP6-R (10 u mol/L) 0. 5 u I, Hi_frdB-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_frdB-R (IOu mol/L) Iu I,Hi_16S rRNA-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_16S rRNA-R (IOu mol/L) Iu 1,2 u IMgCl2 (25mM),
0.5u I dNTP (IOmM)，0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/yl)，模板为2 yl提取的细菌基因组DNA。同时设阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对流感嗜血杆菌引物为针对流感嗜血杆菌omp P6基因设计的Hi omp P6-F 5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’，Hi_omp P6-R :5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’，扩增片断长度215bp ；针对流感嗜血杆菌frdB基因设计的Hi_frdB_F 5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’，Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’，扩增片断长度 620bp ；针对流感嗜血杆菌16S rRNA基因设计的Hi_16S rRNA-F 5 CGT A TT A TCGG A A G A TG A A A GTGC - 3 ’，Hi_ I 6S r RN A - R 5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGIT-3’，扩增片断长度 82Ibp。设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循环降低
0.5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。
扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 Ul与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于I X TAE溶液中，在100V电压下，电泳30min，电泳后经0. 5mg/L的溴化乙锭浸泡染色IOlOmin后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。流感嗜血杆菌与b型流感嗜血杆菌于215bp、620bp、821bp处出现对应大小的条带，其它细菌基因组模板及阴性对照无条带出现(见图I)。实施例3 多重降落PCR的检测限确定。提取b型流感嗜血杆菌的基因组DNA :取b型流感嗜血杆菌纯培养液I. 5ml用Takaraminibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取其基因组DNA。提取的DNA 直接用于PCR扩增或置于_20°C保存备用。PCR扩增总体系25iU，在200iil PCR小管内依次加入12. 55 U I双蒸水，2. 5 iU缓冲液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 Hi_omp P6-F (10 u mol/L) 0. 5 u l，Hi_ompP6-R (10 u mol/L) 0. 5 u I, Hi_frdB-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_frdB-R (IOu mol/L) Iu I,Hi_16S rRNA-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_16S rRNA-R (IOu mol/L) Iu 1,2 u IMgCl2 (25mM),
0.5 ill dNTP (IOmM)，0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/)，模板为2 提取的b型流感嗜血杆菌基因组DNA或其10 稀释模板。同时设阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对流感嗜血杆菌引物为针对流感嗜血杆菌omp P6基因设计的Hi omp P6-F 5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’，Hi_omp P6-R :5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’，扩增片断长度215bp ；针对流感嗜血杆菌frdB基因设计的Hi_frdB_F 5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’，Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’，扩增片断长度 620bp ；针对流感嗜血杆菌16S rRNA基因设计的Hi_16S rRNA-F 5’-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’，Hi_16S rRNA-R :5’-AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J,扩增片断长度821bp。设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循环降低
0.5°C )30s, 72 °C lmin, 20 个循环；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin, 20 个循环；72°C 7min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 iU与6 X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于IXTAE溶液中，在100V电压下，电泳30min，电泳后经0. 5mg/L的溴化乙锭浸泡染色IOlOmin后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。将于215bp、620bp、821bp处出现对应大小条带的最低b型流感嗜血杆菌基因组DNA浓度定义为该多重降落PCR的检测下限(见图3)。
权利要求
1. 一种流感嗜血杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，MgCl2, dNTP,Taq DNA聚合酶，BSA，流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物；其特征在于所述3对流感嗜血杆菌引物如下 第 I 对5，-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3，，与 5，-TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3，；第 2 对5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’ 与 5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ ；第 3 对5’ -CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’ 与 5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3’。
全文摘要
本发明公开了一种可快速检测下呼吸道标本中流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的多重降落PCR检测试剂盒。本发明属于下呼吸道感染性疾病的分子诊断技术领域，拟解决下呼吸道标本中流感嗜血杆菌的快速诊断。该试剂盒包括10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物。本发明并建立了可检测流感嗜血杆菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
文档编号C12Q1/04GK102653794SQ20121014861
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者侯艳娇, 杜蓬, 潘红, 罗欲承, 邵世和, 邵晨 申请人:江苏大学