专利名称：抗口蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种抗体及其制备方法和用途，特别涉及ー种抗ロ蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体。此外，本发明还涉及到该抗体的制备方法、功能鉴定和用途。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
ロ 蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由 ロ 蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus, FMDV)引起的以偶蹄动物发病为主的ー种急性、热性、高度接触性、烈性动物传染病，是世界范围内对畜牧业发展威胁最大的ー种动物传染病。ロ蹄疫传染性极强、发病率极高，对幼畜的致死率有时可达100%，故被世界动物卫生组织(OIE)列为动物14种A类传染病之首，我国动物卫生部门也将其列为ー类传染病。FMDV是小RNA病毒科，ロ蹄疫病毒书的成员，目前已经发现7个血清型，即O、A、C，SAT1、SAT2、SAT2、和AsiaI型，不同血清型之间不存在交叉反应和保护。完整AsiaI型病毒粒子包括衣壳和RNA两部分，其中结构蛋白VP0、VP3和VPl构成病毒衣壳衣壳蛋白是刺激动物机体产生保护性中和抗体的最主要部分，也是区分血清型的抗原表位所在。目前，流行ロ蹄疫国家主要通过接种灭活疫苗作为防止疫病发生的唯一手段。经过了高密度、大范围的不断疫苗接种，疫病流行得到有效控制，但偶蹄兽家畜活体带毒感染动物仍然隐藏在畜群中，是最危险的潜在传染源。消灭ロ蹄疫的发达国家，通过疫苗免疫和捕杀病原阳性动物的方式达到疾病浄化，但世界范围内尔频繁的畜产品自由贸易，使这些国家时刻面临疫病爆发的危险。面对如此严峻的疫病形式，建立快速、敏感、特异的病原诊断方法就变得尤为重要。OIE推荐的抗原诊断方法，包括病毒分离、多克隆抗血清为基础的美联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验和病毒核酸检测方法RT-PCR，这些方法需要在具有专门仪器设备、实验室和专业人员的条件下进行操作，同时需要用其余的血清型抗体作为对照。如果能够获得具有某一血清型具有型特异性的抗体，那么就可以推动对于ロ蹄疫疫情的诊断速度和准确性，从而及早采取措施控制疾病流行，減少造成的经济损失。1993年，Hamers等发现骆驼和鲨鱼等体内存在ー种天然缺失轻链，仅有重链的抗体，称为重链抗体(HCAbs)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区单域结构域组成，称为单域重链抗体(variable domain of the heavy chain of HCAbs, VHH)。虽然缺失可变区，VHH却仍同普通抗体一祥保持着良好和特异的抗原结合能力，它是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量仅为15kD，是常规抗体的1/10，单克隆抗体的1/3，分子高度4. 8nm,直径2. 2纳米,也称为纳米抗体(nanobody)。该类抗体具有伸展的抗原互补结合区以及更高的组织穿透性和更小的分子个体，可以结合一些常规抗体无法接触的抗原表位，充分发挥抗体的生物学功能。另外，VHH具有易表达、水溶性好、耐高温、耐极度pH值等独特性质，其作为小型化基因工程抗体在基础研究、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前景。目前，骆驼VHH单域重链抗体研究在欧美国家已成为研究热点。Lorena利用轮状病毒VP6蛋白免疫羊驼获得了具有中和活性的VHH，能够用来治疗小鼠腹泻。早期诊断和治疗效果跟踪始终是癌症诊断的研究热点和难点。Cortez-Retamoz利用小分子量VHH具有良好组织渗透性、高亲和カ和不损伤正常组织的特性，以其作为显影剂可在体内快速而准确检测肿瘤位置。由于VHH均具有高抗原特异性和亲和力，可用于靶向肿瘤特异抗原，将肿瘤治疗药物直接作用于病灶，发挥有效的杀伤肿瘤作用。国内在骆驼VHH研究仍处于起步阶段。严安等利用H5N1禽流感病毒抗原免疫羊驼，构建了抗H5N1VHH免疫库，并初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1VHH抗体，为H5N1的早期诊断和临床治疗奠定基础。利用双峰驼制备Asia I型免疫抗体库，从而筛选得到能够与ロ蹄疫Asia I型病毒抗原特异性结合VHH重链抗体，来研制病原快速诊断方法在国内外尚无报道。
发明内容
本发明的目的之ー是提供ー种抗ロ蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体；
本发明的目的之ニ是提供编码所述双峰驼VHH重链抗体的核苷酸序列；本发明的目的之三提供所述的双峰驼VHH重链抗体或其编码序列在制备检测ロ蹄疫AsiaI型病毒试剂中的应用。为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段本发明利用噬菌体展示技术建立AsiaI VHH免疫抗体库，经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆测序结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为I. 13X108的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NA L-Asial，从中筛选出具有高特异性和抗原结合能力的单域抗体。本发明的一种抗ロ蹄疫病毒AsiaI型的双峰驼VHH重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO. I所示的序列同源性在98%以上的氨基酸序列。在本发明中，优选的，所述的与SEQ ID NO. I所示的序列同源性在98%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。本发明提供了编码所述的双峰驼VHH重链抗体的核苷酸序列。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQID NO. 6所示的序列。进ー步的，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。更进一歩，本发明还提供了ー种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有以上所述的核苷酸序列的真核或原核细胞。优选的，所述的宿主细胞为含有以上所述的表达载体的真核或原核细胞，更优选的所述的宿主细胞为大肠杆菌TGl或大肠杆菌HB2151。再进ー步的，所述的双峰驼VHH重链抗体在制备检测或诊断ロ蹄疫AsiaI型病毒感染试剂中的应用。及所述的核苷酸序列在制备检测或诊断ロ蹄疫AsiaI型病毒感染试剂中的应用。
本发明首次利用重组的AsiaI型病毒样颗粒抗原免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立AsiaI VHH免疫抗体库，筛选与ロ蹄疫AsiaI型病毒抗原具有良好亲和カ的高特异性单域抗体，本发明的Asia I VHH重链抗体对于研究Asia I病毒感染机理和建立高度敏感和特异的抗原快速检测或诊断试剂具有重要意义。
图I为双峰驼外周血淋巴细胞RNA提取结果；I 总 RNA ；2 DL2000 标准分子量图2为VHH基因第一轮PCR扩增结果；M DL2000标准分子量；I. PCR扩增产物；
图3为VHH基因第二轮PCR扩增结果；I PCR扩增产物；M DL2000标准分子量图4为VHH基因第三轮PCR扩增结果； I PCR扩增产物；M DL2000标准分子量图5.为双峰驼VHH 4、5和6号克隆的PCR电泳结果；M DL2000Marker图6为双峰驼VHH 4、5和6克隆的SDS-PAGE结果；M =Protein Marker (85\50\35\25\20kDa) ；IB :包涵体；S :可溶性；C1~2 :空载体表达对照图7为pE-Sumo的载体示意图。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进ー步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例II.材料与方法I. I 材料I. I. I试验动物、抗原、佐剂和AsiaI抗体检测试剂盒I峰雄性双峰驼(I周岁)，I峰雌性双峰驼(6月龄)；重组AsiaI/YNBS/58株VLPs抗原，AsiaI/YNBS/58 (ロ蹄疫病毒AsiaI/YNBS/58株全基因组序列分析，常惠芸等，病毒学报，2007(5) :407-411)全病毒灭活抗原；206佐剂；FMDV AsiaI型抗体液相ELISA检测试剂盒由兰州兽医研究所研制提供。I. I. 2菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌TGl和HB2151、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2，由王祥斌博士惠赠。表达载体pE-Sumo (Kanr, LifeSensors, Inc,载体图谱如图7所示。)，限制性内切酶购自NEB、淋巴细胞分离液(I. 077)购自上海生エ、Trizol、镍亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品、PCR相关试剂购自宝生物公司、分子生物学试剂来自Sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯。I. 2 方法I. 2. I抗原接种剂量、免疫程序和血清抗体效价的測定在双峰驼的颈部皮下、背部皮下、腹部皮下和后腿皮下进行分点接种重组AsiaI/YNBS/58株VLPs抗原，重组VLPs抗原由表达的VPl抗原、VP3抗原以及VP2-VP4抗原通过自组装后形成的病毒样颗粒抗原(VLPs)，其中编码VPl抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，编码VP3抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，编码VP2-VP4抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，每个部位不少于3个接种点。首次免疫前和毎次免疫后采集静脉血，用FMDVAsiaI型抗体液相ELISA检测试剂盒检测血清抗体效价，第四次免疫后5天，静脉采血。具体动物免疫程序和抗原接种剂量见表I :表I双峰驼免疫程序和抗原剂量
免疫次数
Γ 免免.......i 免 _ 免
割 iHug)5080HO 200
与 免M隔时PtJ (人)O2135 49I. 2. 2淋巴细胞分离第四次免疫后5天，静脉采集抗凝血，用比重为1.077的淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，用MEM基础培养液洗涤分离的淋巴细胞，然后置于6孔板中在37°C孵育I小时，去除细胞碎片和大部分单核细胞，取悬浮细胞上清液并且计数后备用。I. 2. 3细胞总RNA的提取和RT-PCR利用Trizol抽提分离的淋巴细胞总RNA，进行RT-PCR扩增合成cDNA。I. 2. 4VHH基因扩增，噬菌体展示载体的构建和库容量计算根据參考文献(抗H5N1禽流感病毒VHH抗体库的构建，严安等，中国免疫学杂志2011 年果 27 卷；及 A single-step procedure of recombinant library constructionfor the selection of efficiently produced llama VH Dinders directed againstcancer markers， Damjana Kastelic et.al， Journal of Immunological Methods350 (2009)54-62 ；及 Llama-Derived Single-Chain Antibody Fragments Directed toRotavirus VP6 Protein Possess Broad Neutralizing Activity In Vitro and ConferProtection against Diarrhea in Mice， Lorena Garaicoechea et.al， JOURNAL OFVIROLOGY，Oct. 2008，p. 9753 - 9764)设计3对引物，以扩增得到的cDNA为模板扩增VHH基因片段，进行三轮扩增，引物序列见表2。表2VHH基因片段扩增用引物扩增轮次づ_片段(一)
第-轮扩增 Hl SOTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3^两条片段(900,600)，
GI 5f-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-35| i收 600
H2 S'-ggattgttaitacicgcggcccagccggccatggct-450 (Sjn)
第.轮ぎ.增SAKGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-35
H3 5f-gccccgtgatggigalgatgaigtgcg
gcTGAGGAGACRGTGACCWG^l Pl S'-ggaiigiiallaclcgcg -3'450 (Noil)■:轮il 'if! TN i^aMCggccgcgacaclggactacagalccicllctgaga· tgagiuttgucigcggccccglgatggtgaigalg-35以cDNA为模板，H1、G1为上下游引物扩增得到大小分别为600bp和900bp的2条带，回收600bp条带作为模板，进行第二轮PCR扩增。以第二轮PCR产物为模板，H2、H3为上下游引物得到约大小450bp条带。以第二轮PCR产物为模板，以P1，TN为上下游引物进行第三轮扩增，得到约450bp条带。将第三轮PCR产物经过Sfil/Notl双酶切后，连入pHEN2载体，利用电转化方法将连接产物转化到大肠杆菌TGl中，电转结束后，菌液37°C，180r/min摇床培养Ih，离心浓缩后涂氨苄抗性的2YTG平板(2%葡萄糖+AmpkZXYTdYTGX同时取10 μ L稀释至I X IO4倍进行涂板，37°C过夜培养，用于计算库容。37°C倒置培养16小时后，用IOmL的2XYT培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在_70°C备用，此为获得的抗FMDV AsiaI型抗体VHH重链抗体免疫库。电转化后的随机挑选电转后的克隆，抽提质粒进行测序，鉴定抗体库的多祥性，根据多样性和克隆数目来计算库容量。I. 2. 5制备噬菌体抗体库和初步筛选(I)取一支冻存的VHH重链抗体库，接种于500mL的2YTG培养基中，37°C，250rpm/min震荡培养至菌体浓度为OD6tltlたO. 8-0. 9。(2)加入辅助噬菌体M13K07至终浓度5\109 扣/111し37で静置301^11 ;然后在37°C条件下，200rpm/min,温和培养60min。(3) 2200g, 15min离心收集细菌沉淀,重新用等体积的2YT_AK( 100 μ g Ampr, 50 μ gKanr)培养基悬浮沉淀，30°C，300rpm/min过夜培养。(4) 7000g, 4°C离心15min，将上清转移至IL预冷的三角瓶中，加入O. 3体积的噬菌体沉淀，温和混匀后，冰浴lh。(5) 7000g, 4°C离心15min,弃净上清,用8mL PBS重悬沉淀。(6) 12000g离心10分钟，收集上清，然后滴定抗体库滴度，分成小份的噬菌体保存
在 4°C。I. 2. 6抗体库的淘洗(I)抗原包被在96孔酶标板中用碳酸盐缓冲液(pH9. 6)1 4包被ロ蹄疫AsiaI全病毒灭活抗原，100 μ L/孔，4°C包被过夜,制成抗体淘洗板。(2)封闭弃去孔内液体，加入10(^17孔封闭液び85了+5%脱脂奶粉+5%蔗糖)，37°C 封闭 2h。混合噬菌体抗体库和等体积的封闭液，30°C预封闭30min (注意第一轮淘洗噬菌体颗粒的数量应该比文库大小高100倍，例如如果文库大小为IOltlCfU,淘洗时最好加入IO12Cfu,)。(3)将预封闭后的抗体库混合物100 μ L/孔加入抗体淘洗板,室温孵育60min,用PBST洗涤15次，PBS洗涤5次，3min/次。(4)洗脱lmL0. IM pH2. 2HC1-Glycin (盐酸甘氨酸缓冲系统)洗脱，室温摇动lOmin，洗出洗脱液，80yL左右IM Tris (三羟甲基氨基甲烷)中和至7. 4 ;将免疫管用对I. 2mL数生长期的XLl-Blue直接感染，同时将HCl-Glycin (含4%BSA)洗脱并且中和的噬菌体抗体9倍体积对数期XLl-Blue感染。共4份样品室温感染lOmin，转入37°C、150rpm培养lh，分别取1%，0. 1%，0. 01%涂板计算产出量。剩余部分混合离心后浓缩到为lmL，分别涂于 2 块 12cm 直径 LBATGCLB 培养基中添加 Ampr :100 μ g/mL ；Tetr :10 μ g/mL ；Glucose 0. 5% ；)固体培养板，37°C培养过夜(约12h)。
(5)呈现将培养过夜培养板上的菌落刮下，部分投入下一轮筛选，剰余部分冻存。将部分菌液加入到IOOmL LBATG培养液中至菌浓度为0D_=0. 35左右，于37°C培养约Ih至OD600=O. 5 (菌量为I X IOVmL),加入50:1辅助噬菌体M13K07,混匀后室温静置15min,于37°C、150rpm/min培养Ih后离心获得沉淀。在90mL的LBATK ;混匀后等分为3份其中ー份加入 IPTG 至终浓度为 O. ImM 和 Glucose 至 O. 25% (g/1OOmL) (6 μ L O. 5Μ IPTG，300M125%葡萄糖);ー份加入IPTG至终浓度为O. ImM ;第三份为空白对照；三份样本继续于 300C，180rpm/min，培养过夜(约 12h)。(6) 4°C, 14000rpm/min, 30min离心细菌培养物，收培养上清；加入1/5体积预冷的PEG/NaCl (20%PEG8000+2. 5mol/L NaCl)缓冲溶液，混匀后冰预60min，沉淀噬菌体；4°C，14000rpm/min离心20min，重悬沉淀于IOmL的含2%BSA和15%甘油的PBS缓冲液中，常温下IOOOOrpm离心IOmin,去除沉淀,获取上清,O. 22 μ m膜过滤除菌,取10 μ L进行曬菌体抗体库滴度测定，其余分装成小份，冻存_70°C备用。按以上步骤进行“结合-洗涤-洗脱(感染)”，反复进行三轮。I. 2. 7噬菌体ELISA鉴定阳性克隆a)挑取经筛选后的克隆于96孔深孔板中，每孔250 μ L2X YTATG培养基，37°C摇床培养至OD600=O. 5，按照M0I=20 I加入辅助噬菌体，室温静置15min, 37°C, 150rpm/min培养lh，加入等体积2XYTATG，30°C，摇床200rpm培养过夜约。次日，10000rpm/min离心IOmin收取上清，加入BSA至终浓度2%，加入Tween-20至终浓度O. I %，37°C静置15min，备用。b)包被ロ蹄疫AsiaI全病毒灭活抗原包被液稀释至I : 4，加入96孔酶标板中，100 μ L/孔，4°C包被过夜。c)次日，弃包被液，用DPBS溶液220 μ L/孔洗3次，用5%脱脂奶粉+0. l%Tween-20封闭，100 μ L/孔，37°C封闭2h。d)弃去封闭液，加入经封闭后的单克隆噬菌体抗体，100 μ L/孔，37°C静置2h。e)弃去液体，用DPBS洗6次，220 μ I/孔。f)将鼠抗M13-HRP抗体用封闭缓冲液按I : 5000稀释，100 μ L/孔，37°C作用lh。g)弃去液体，酶标板用DPBS洗6次。h)弃去洗涤液，加入底物OPD显色液，100 μ L/孔，室温静置显色。用100 μ L/孔2moIH2SO4终止显色。酶标仪测定光吸收值。I. 2. 8筛选的AsiaIVHH重链抗体在E. coli中表达和鉴定上述实验共获得阳性克隆，通过序列分析比较，筛选特异性的抗FMDV AsiaI型抗体VHH重链抗体序列。利用PCR将这些序列扩增，胶回收PCR扩增后片段，然后双酶切酶切，酶切后的目的片段与E. coli表达载体pSMK连接，构建VHH重链抗体重组表达载体，并转化到E. coli中进行表达。利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的VHH抗体蛋白，利用双抗体夹心ELISA试验鉴定表达抗体的结合能力和型特异性。I. 2. 9重组AsiaIVHH重链抗体结合抗原能力和型特异性鉴定I. 2. 9. I双抗体夹心ELISA鉴定VHH抗体结合AsiaI/YNBS/58全病毒抗原能力(I)抗体包被纯化VHH抗体包被酶标板(I μ g/孔)，100 μ L/孔，兔抗FMDV AsiaI 全病毒抗原多克隆抗血清作为阳性对照(I 1000), SUMO蛋白作为阴性对照(I μ g/孔)，4°C过夜包被；(2)加入抗原I XPBST洗涤4次，220 μ L/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，按照
I 5加入AsiaI全病毒灭活抗原，37°C作用60min，洗板；(3)加入豚鼠抗体按照I : 1000比例加入豚鼠抗AsiaI多克隆抗体，37°C作用60min,洗板；(4)加酶标ニ抗1 1000加入兔抗豚鼠HRP标记ニ抗，37°C作用60min，洗板；(5)显色加入OPD底物显色37°C作用15min ；(6)终止并读数加入2Mol/L H2SO4终止反应，0D490读取吸光度值。2.结果2. I完整淋巴细胞总RNA的提取提取外送免疫后双峰驼外周血淋巴细胞的总RNA，凝结电泳分析提取的总RNA无基因组污染，大小与预期相符，见图I。2. 2VHH重链抗体基因PCR扩增以cDNA为模板，HU Gl为上下游引物，进行第一轮PCR扩增，得到大小600bp和900bp左右2条带，见图2。回收600bp条带，作为模板，进行第二轮PCR。以第一轮扩增的PCR产物为模板，H2、H3为上下游引物得到约450bp条带，见图3。以第二轮PCR产物为模板，以P1、TN为上下游引物得到约450bp条带，见图4，此时VHH基因两端分别引入了 Sfil/Notl限制性酶切位点。2. 3噬菌体展示抗体库多多样性的确定和库容量经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆测序结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为I. 13X108的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NA L~AsiaI。2. 4抗体库的淘洗采用噬菌体文库NAL-AsiaI淘洗能与AsiaI抗原特异性结合的噬菌体颗粒，测定每轮筛选的噬菌体的回收率，经过3轮淘选，表明选择性吸附的噬菌体量明显增加(表3)，能与AsiaI抗原特异性结合的噬菌体的得到了富集。表3三轮淘洗噬菌体富集结果
权利要求
1.抗ロ蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或 (b)与SEQID NO. I所示的序列同源性在98%以上的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的双峰驼VHH重链抗体，其特征在于所述的与SEQID NO. I所示的序列同源性在98%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。
3.编码权利要求I或2所述的双峰驼VHH重链抗体的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。
5.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.ー种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求3或4所述的核苷酸序列的真核或原核细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求5所述的表达载体的真核或原核细胞。
8.权利要求I或2所述的双峰驼VHH重链抗体在制备检测或诊断ロ蹄疫AsiaI型病毒感染试剂中的应用。
9.权利要求3或4所述的核苷酸序列在制备检测或诊断ロ蹄疫AsiaI型病毒感染试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗口蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体及其制备方法和用途，属于生物技术领域。本发明首次利用重组的AsiaI型病毒样颗粒抗原免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立AsiaI VHH免疫抗体库，筛选与口蹄疫AsiaI型病毒抗原具有良好亲和力的高特异性单域抗体，本发明所述的抗体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1所示的序列同源性在98%以上的氨基酸序列。本发明的AsiaI VHH重链抗体对于研究AsiaI病毒感染机理和建立高度敏感和特异的抗原快速检测或诊断试剂具有重要意义。
文档编号C12N5/10GK102702349SQ20121014852
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者刘湘涛, 周广清, 孙世琪, 尚佑军, 尹双辉, 杨顺利, 田宏, 靳野 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所