专利名称：Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测Asial型口蹄疫病毒抗原的快速诊断试纸条，以及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫作为重大动物疫病，世界各国对该病的检验检疫、预防控制都十分重视。目前检测、诊断口蹄疫的主要方法是检测发病或带毒动物体内的口蹄疫病毒及其抗体水平，如分离病毒、ELISA测定抗体等方法。分离病毒是对口蹄疫的最可靠的诊断，但较长的周期会延误对该烈性传染病的最佳控制时间；ELISA测定抗体虽然简单易行、但需要区分是自然感染还是由于疫苗免疫产生的抗体，不能及时做出诊断；此外，以上的实验方法还需要昂贵的仪器设备、专业技术人员等诸多条件。因此，研制直接检测口蹄疫病毒抗原的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒不仅有很强的实用价值和广阔的应用前景，而且对我国口蹄疫的防控具有重要意义。
我国曾于2005年突发大面积的Asial型口蹄疫，疫情波及十几个省市，给我国的畜牧业生产造成重大经济损失。此次暴发不仅持续时间长，而且疫情复杂。此次暴发警示我们要及早开发研究便捷、快速、敏感、特异的快速诊断试剂以及研制快速诊断试剂盒。因此，研制一种快速检测Asial型口蹄疫病毒抗原的测试物质是十分必要的。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种特异性高的检测Asial型口蹄疫病毒抗原金标快速诊断试纸条，和这种试纸条的制备方法。
本发明的检测Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条由固定于不透水材料上的用多孔纤维构成的加样段、位于加样段端部的由硝酸纤维膜构成的检测段和位于检测段端部的用多孔纤维构成的吸收段，其中加样段上载有Asial型口蹄疫病毒单抗和胶体金的结合物，其检测线由另一株Asial型口蹄疫病毒单抗构成，其对照线由兔抗鼠抗体构成。
本发明的检测Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条中，不透水材料为PVC，所用的多孔纤维为无纺布。
本发明的检测Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条的制备方法是首先制备Asial型口蹄疫病毒的单抗。
单抗制备过程以Asial型口蹄疫病毒(该病毒株保藏于中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室)的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1。将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株。将前述菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，将重组蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3～4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比5～10∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，再静置1～2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液，再将融合细胞按100μl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100μl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，大量生产单克隆抗体。
或者采用另一种方法制备，这种制备方法的前步骤与前述方法基本相同，但在后期大量生产单克隆抗体时是采用小鼠体内诱生法，即先用Asial型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的VP1基因，再将VP1基因插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株，将菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，将重组蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3～4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，将所得到的杂交瘤细胞注入经降植烷处理的雌性小鼠腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，取其上清液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化，得到抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体。
由前述方法所得抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析法进行纯化。
同时可根据现有技术制备出胶体金溶液。
在制备好单抗和胶体金后即可进行试纸条的制备，其过程如下取Asial型口蹄疫病毒单抗0.24mL(单抗储存浓度为1mg/mL)溶于100mL胶体金溶液中，迅速混匀，搅拌均匀，再向单抗与胶体金的混合液中加入1mg牛血清白蛋白充分溶解后，将胶体金溶液离心处理，弃去上清，将沉淀用含0.02M氯化钠，0.02M Tris，0.4mL冰醋酸pH为8.6的稀释液稀释为原体积的8％，将稀释好的胶体金标记单抗混合溶液用多孔纤维材料浸润，然后将多孔纤维材料在室温温度干燥，在硝酸纤维膜上设定出检测线和对照线位置，用喷膜机分别在其所在位置喷上0.2mg/L的另一株Asial型口蹄疫病毒单抗和兔抗鼠抗体形成检测线和对照线，再将硝酸纤维膜室温下干燥，将硝酸纤维膜贴于不透水材料上，再将浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料和另一个多孔纤维材料分别贴于不透水材料上并使两者位于硝酸纤维膜的两端，在浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料上且不与硝酸纤维膜相连的一端设置另一块多孔吸水材料，以作为手柄和吸水垫。
本发明能够直接、快速对Asial型口蹄疫病毒做出诊断，而不需要再进行定型鉴定，本发明的Asial型口蹄疫病毒抗原胶体金标记快速诊断试纸条具有敏感、特异、检测便捷，和适合于现场进行检测与诊断的优点，而且不需要特殊的设备，也无需专门的技术人员。
图1为本发明的试纸条纵截面结构示意图，图2为本发明的试纸条的立体结构示意图，图中1为PVC板，2为胶体金标记抗体的反应加样段，3为硝酸纤维膜构成的检测段，4为吸收段，5为位于加样段端部的手持段；A为检测线，B为对照线。
具体实施例方式
一、Asial型口蹄疫病毒的单抗的制备(1)用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒从Asial型口蹄疫病毒(注该毒株保藏于中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室)中提取的总mRNA为模板，用针对Asial型VP1的特异性引物进行反转录和PCR扩增，获得Asial型口蹄疫病毒VP1基因。在本发明中所用的引物为上游引物5′-CCGGAATTCGCTTACCAGTGGATGCTCG-3′下游引物5-′CCCAAGCTTCGCTAGCTTGAGCAGGTC-3′按照通常连接方法将PCR扩增的目的基因与pGEM-T easy载体连接，采用通常方法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，构建含有重组克隆载体的大肠杆菌菌株，用琼脂糖平板(amp+抗性)及蓝白斑筛选阳性克隆，挑取白斑克隆进行扩增。用PCR、酶切以及序列分析鉴定阳性克隆，采用双酶切从鉴定为阳性的克隆上切下目的基因，以分子生物学通常采用的方法回收酶切目的基因片段，将获得的目的基因定向插入表达载体pPROEX HTb，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)构建重组表达载体的大肠杆菌菌株，采用细菌涂板(Kan+抗性)筛选阳性克隆。经PCR、酶切和序列分析等方法鉴定为阳性的重组表达质粒进行原核表达。当重组表达菌生长至对数中期A550＝0.5-1.0时，通常A550＝0.6时，用终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达。诱导6小时后收获表达菌，8000rpm离心10min收集沉淀，弃上清。按每克重加5mL 20mM/L Tris缓冲液(pH8.0)悬浮菌体后，超声破碎菌体，12000rpm离心15分钟后留沉淀弃上清，用包涵体洗涤缓冲液(1M Tris pH8.0，0.5M EDTA pH8.0，3M NaCl，0.5％ Triton X-100)充分洗涤后，12000rpm离心30min以去除杂蛋白，重复4-5次。用8M尿素缓冲液(0.5M NaCl，0.02M Tris，8M尿素，pH8.0)悬浮沉淀，用亲和层析法(Ni-NTA His)纯化表达的重组蛋白，获得的重组蛋白用紫外分光光度计测定含量后-20℃冻存。
(2)制备免疫脾细胞取前述的纯化Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原与等体积佐剂充分混匀，分别注入健康小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次注射的病毒剂量为20～80μg抗原，间隔2～4周后，用同样的方法再次重复注入至少1次；第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂、第二次免疫所用佐剂改为不完全弗氏佐剂、第三次免疫不用佐剂、佐剂与抗原的比例为1∶1(体积比)最后一次免疫后2周，测小鼠血清中的抗口蹄疫病毒基因VP1原核表达抗原的抗体滴度，将显示有足够抗体滴度的小鼠作为免疫脾细胞的来源。
测定抗体滴度的方法，可用放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附(ELISA)测定法等，本发明中采用通常的ELISA法。
(3)制备骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞通常使用从小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0细胞系。在进行细胞融合前，将其在加有10％胎牛血清的DMEM(100u/mL青霉素、100ug/mL链霉素)的常规培养液中培养3～4天，以便在融合时可以得到2×107或更多的融合细胞。本发明通常选用SP2/0骨髓瘤细胞。
(4)细胞融合将20～80μg前述所得的纯化Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原向已按步骤(2)的方式免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞。分散脾细胞，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀。将上述(3)培养的小鼠骨髓细胞瘤SP2/0离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀。用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比(5～10)∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，再静置1～2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液，所用的HAT溶液为次黄嘌呤10-6～10-3M，氨基喋呤10-8～10-7M，胸苷10-6～10-4M，悬浮融合细胞，最后补加HAT培养液至沉淀物体积的140～160倍。再将融合细胞按100μl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100μl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞(约1～2×105个/孔)。将上述培养孔置于浓度为3～7％的CO2培养箱中，在温度为35～38℃条件下培养10～14小时，从第3天开始，每隔2～3天用每孔半量HAT培养液换液体一次。
当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，先取培养上清液，然后再在每孔加半量HAT培养液。再用ELISA检测抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的抗体及滴度。当检测表明其与对照相比有明显的升高时即视为合格。
将上述抗Asial型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株。可以通过一种经有限稀释该杂交瘤细胞使每一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法，或一种采用细胞分选仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。
(5)制备单克隆抗体用常规培养液培养上述(4)中得到的杂交瘤细胞株。大量生产单克隆抗体，可采用大转瓶旋转培养法。或同系小鼠体内诱生法。其中大转瓶旋转培养法可通过培养上述(3)杂交瘤细胞纯化得到抗口蹄疫病毒单克隆抗体。同系鼠(本发明用Balb/c小鼠)体内诱生法可通过将上述(3)得到的产生抗口蹄疫病毒抗体的杂交瘤细胞(5×105～106)注入经降植烷处理的雌性小鼠(4～8周龄)腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化。
将抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的单克隆抗体分别与包被Asial、O、A和C型口蹄疫病毒抗原进行间接ELISA试验，结果显示具有高度的血清型特异性，不与其它血清型发生交叉反应，可以用于制备检测Asial型口蹄疫病毒的胶体金检测试剂盒。
二、胶体金的制备(1)将1g氯化金溶于100mL双蒸水中制成1％的水溶液，取1％的氯化金水溶液1mL，加双蒸水99mL配置成0.01％的氯化金水溶液。加热至沸腾，迅速加入浓度为1％柠檬酸三钠水溶液1mL，继续煮沸，同时观察液体颜色变化情况，当煮沸约7～10min液体出现透明的酒红色时终止反应。用电镜测定制备的胶体金颗粒的大小及其形状。用0.1mol/L K2CO2或0.1N HCl调整胶体金的pH值至8.6，4℃避光保存。
(2)待标记单抗的准备取-20℃保存的纯化好的单抗放置室温，待其融化后于15000rpm离心20min，取上清，调整抗体浓度为1mg/mL置4℃备用。
(3)胶体金标记抗体最适稳定量的测定将标记的单抗逐级稀释后(10-80μg/mL，另设对照)，各取等体积顺序加入一系列装有1mL胶体金的Eppendorf管中，5mim后，在各管中分别加入0.1mL 10％(W/V)的NaCl溶液，空白对照不加单抗稀释液，加0.1mL缓冲液，充分混匀后静置2小时观察结果。取加入单抗浓度最低而染色没有发生变化的管为最适标记量，在此基础上再补加10％(V/V)浓度为1mg/mL(1mg/mL为本发明中单抗储存浓度)的单抗溶液，即为稳定胶体金所需抗体实际用量，根据相关试验确定为每100mL胶体金溶液加浓度为1mg/mL的单抗溶液0.24mL，其单抗终浓度为0.24mg/100mL(胶体金溶液)。
(4)抗体的胶体金标记根据待标记胶体金的量计算所需单抗的用量，在电磁搅拌器搅拌下，缓慢将单抗溶液加入胶体金溶液中，1mg的抗体大约用5min加完，加完后继续搅动20min。在搅拌状态下继续加入过滤的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，再缓慢搅动20min后，用0.45滤膜过滤，直接使用或-20℃冻存。
(5)胶体金标记抗体的纯化将胶体金标记抗体于1500rpm离心15min，弃沉淀留上清。将上清移入新的离心管后15000rpm于4℃离心40min，弃上清留沉淀。用与离心前相同体积的0.02M TBS(0.02M氯化钠，0.02M Tris，0.4mL冰醋酸，pH8.6)溶解沉淀，重复离心2-3次后，用原体积8％的0.02M TBS溶解沉淀，4℃保存备用。
(6)胶体金标记抗体吸附玻璃纤维或无纺布用0.02M pH8.6TBS稀释金标单抗，充分混匀后，将1cm×5cm大小玻璃纤维滤纸或无纺布浸入金标单抗溶液中，取出后阴干，裁成5mm×5cm的长条备用。
(7)检测线和控制线的印迹用试纸条喷膜机将另一株单抗(0.2mg/L)与兔抗鼠抗体(0.2mg/L)喷涂在NC膜上，37℃干燥过夜。
(8)胶体金标记试纸条的组装在操作台上放置PVC底板并揭开不干胶后，贴上(7)所述NC膜，随后将干燥好的吸附有胶体金的无纺布与NC膜的T线一端连接并粘贴在PVC底板上，然后在胶体金垫上覆盖吸水膜，最后用厚的吸水垫作手柄并且压在NC膜靠C线的一端，所有这些完成后用切割机将试纸条切成2.5mm×5cm即可。
该Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条对国家口蹄疫参考实验室提供的70份研磨的动物水泡皮悬液(用0.04M PBS缓冲液研磨)进行检测，结果显示，阴阳性成立，阳性两条带，阴性一条带，结果与其它经典方法检测结果基本一致。
权利要求
1.Asia1型口蹄疫病毒快速诊断试纸条，包括呈线性排列的固定于不透水材料上的用多孔纤维构成的加样段、位于加样段端部的由硝酸纤维膜构成的检测段和位于检测段端部的用多孔纤维构成的吸收段，其特征在于加样段上载有Asia1型口蹄疫病毒单抗和胶体金的结合物，其检测线由另一株Asia1型口蹄疫病毒单抗构成，其对照线由兔抗鼠抗体构成。
2.根据权利要求1所述的Asia1型口蹄疫病毒快速诊断试纸条，其特征是所用不透水材料为PVC，所用的多孔纤维为无纺布。
3.根据权利要求1或2所述的Asia1型口蹄疫病毒快速诊断试纸条的制备方法，首先制备Asia1型口蹄疫病毒的单抗，制备出胶体金溶液，其特征是将0.24mg Asia1型口蹄疫病毒单抗溶于100mL胶体金溶液中，再在其中加入5％的牛血清白蛋白使其终浓度为1％，再将胶体金溶液离心处理，弃去上清，将沉淀用含0.02M氯化钠，0.02M Tris，0.4mL冰醋酸pH为8.6的稀释液稀释为原体积的8％，将稀释好的金标混合溶液用多孔纤维材料浸润，然后将多孔纤维材料在室温温度干燥，在硝酸纤维膜上设定出检测线和对照线位置，用喷膜机分别在其所在位置喷上0.2mg/L的另一株Asia1型口蹄疫病毒单抗和兔抗鼠抗体形成检测线和对照线，再将硝酸纤维膜室温下干燥，将硝酸纤维膜贴于不透水材料上，再将浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料和另一个多孔纤维材料分别贴于不透水材料上并使两者位于硝酸纤维膜的两端，在浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料上且不与硝酸纤维膜相连的一端设置另一块多孔吸水材料，以作为手柄和吸水垫。
全文摘要
本发明公开一种用于检测Asia1型口蹄疫病毒抗原的快速诊断试纸条及制备方法。本发明是将口蹄疫病毒的单抗加入胶体金溶液中，将胶体金标记单抗的混合溶液用多孔纤维材料浸润，在硝酸纤维膜上设定出检测线和对照线位置喷上另一株口蹄疫病毒单抗和兔抗鼠抗体形成检测线和对照线，再将干燥后的硝酸纤维膜贴于不透水材料上，将浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料和另一个多孔纤维材料分别贴于不透水材料上并使两者位于硝酸纤维膜的两端，在多孔纤维材料另的一端设置多孔吸水材料，制成诊断试纸条。
文档编号G01N33/569GK101067627SQ20071012617
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者林彤, 常惠芸, 邵军军, 独军政, 丛国正, 杜惠芬, 李克生, 陈涓, 周广青, 谢庆阁 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所