专利名称：一种检测禽流感病毒的试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测禽流感病毒的试纸条以及该试纸条的制备方法、本发明还涉
及一种感染禽流感病毒动物的排泄物和分泌物的样品处理溶液，属于免疫诊断领域。
背景技术：
禽流感是一种家禽和鸟类的烈性传染病，在偶然的情况下也可感染人而致病，甚 至死亡。2004年禽流感席巻亚洲以来，波及欧美各国，引起家禽大批死亡，并感染人类，造成 近200多人死亡，流行的余波至今未平息。此次流行波及范围之广，感染人数之多为历史之 最。不仅如此，其病毒的变异可能引起人类流感的大流行。禽流感对人类的威胁已经引起 世界关注。如何有效预防和控制该病的流行，已经成为各国科学家的重要研究课题。很多 国家都开始进行这方面的研究，包括在疫苗、诊断技术和药物等方面。 免疫层析胶体金技术是近些年发展起来的一项新的诊断技术，它结合了免疫反应 和色谱层析的原理，是一种独特的免疫层析方法。该技术以条状纤维层析材料为固相，通过 毛细作用使样品溶液在层析条上运动，样品中的抗原与纤维材料上相应的抗体相结合发生 高特异和高亲和的免疫反应，并滞留或富集在检测区域，通过反应底物而出现呈色现象。这 是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术。现在临床广泛使用的人绒毛膜促性腺(HCG)、 乙型肝炎表面抗原(HbsAg)、可卡因等检测均是基于这种方法，其优点是快捷、简便、准确， 具有高度特异性及高敏感性，问世以来便成为检验学和诊断学的研究热点。免疫金银染色 (IGSS)的原理是金免疫技术测定的产物上的金颗粒可将银离子还原成银颗粒，在金颗粒的 表面形成色泽更深的黑色层，因而增强了金免疫技术的敏感性。具体方法是在免疫金染色 的基础上，在对苯二酚存在的情况下，通过含银离子的显影液中的还原反应，使在抗原抗体 反应部位的金粒子周围形成很多沉淀层，光镜下就可看到阳性反应部位呈清晰的蓝黑色， 从而显示不易被光镜定位的金粒，显示出组织中抗原的部位。这种方法不仅提高灵敏度，
同时金标记抗体可以稀释io倍以上后应用，此外还可避免使用具有致癌危险的有机色素。
IGSS法的主要优点是(l)敏感性高。与其他的免疫胶体金技术相比，IGSS法被认为是最 敏感的方法，尤其适合于只含微量抗原的标本检测。(2)定位准确。IGSS法的银颗粒沉积 在抗原抗体反应部位，一般无扩散，定位较为准确。(3)方法简便、安全、成本低、经济、同时 也可以长期保存。(4)用醋酸银代替硝酸银和乳酸银，不仅保持了原有方法的敏感性、特异 性、低背景、对比度好的特点，而且整个显影过程可以在常光下进行。 目前，在人类医学领域已广泛应用该技术进行诊断，但在动物医学领域的研究还 处于初级阶段。禽流感是一种严重的人与动物共患的传染病，2004年禽流感在亚洲的流行， 造成养殖业严重的经济损失和人的死亡。世界卫生组织(WHO)的专家预测这种威胁还将 持续、快速诊断是预防和控制本病的有效方法。目前所采用的方法主要还是琼脂扩散试验、 HA/HI试验ELISA和RT-PCR试验。这些方法要么敏感性差，要么操作繁琐，检测成本高。目 前研究的最新方法是荧光RT-PCR技术，虽然准确特异，但需要昂贵的设备和检测费用，需 要专门的实验室，很难普及。
本发明之前申请号为200410088716. 8专利申请公开了一种检测H5N1亚型禽 流感病毒的方法及其专用试剂盒；申请号为200510042631.0的专利申请公开了禽流 感病毒抗原检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法；申请号为200510042527. 1 的专利申请公开了复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒的方法；申请号为 200510057023.7的专利申请公开了禽流感免疫胶体金诊断试纸条和测试卡；申请号为
03126894. 3的专利申请公开了胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗原的试剂；申请号为
03126895. 1的专利申请公开了胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗体的试剂；申请号为 03142652. 2的专利申请公开了免疫纸层析条及用其快速检测食品中致病菌和毒素的方法； 申请号为02131321. 0的专利申请公开了一种免疫层析一步法检测13 -肾上腺素激动剂类 药物的方法及试纸的制备；申请号为02139704.X的专利申请公开了半定量快速检测盐酸 克伦特罗的胶体金试纸条及生产和使用方法。 本发明旨在提供一种简单、快速、敏感、特异的诊断粪便中禽流感病毒的方法，目 前虽有应用于禽流感研究方面的报道和相关专利，但多在检测动物血清、组织、分泌物等， 未见到能够同时检测粪便中禽流感病毒的报道。本发明建立一种免疫胶体金层析法快速诊 断粪便中禽流感病毒的方法，能够在野生动物禽流感野外快速诊断和检测中应用。
发明内容
本发明一 目的提供了一种检测禽流感病毒的试纸条。 本发明的另一 目的提供了一种处理禽流感病毒感染动物的粪便和分泌物的溶液。
本发明的再一 目的提供了一种制备检测禽流感病毒试纸条的方法。
本发明一方面提供了一种检测禽流感病毒的试纸条，该试纸条包括以下部分
垫板l，所述的垫板为塑料垫板； 位于垫板1上的硝酸纤维素膜3，其小于垫板(1)并与垫板l的长度差为垫板长度 的13/30-1/2，并与垫板1部分重叠，所述的硝酸纤维素膜与垫板在长度方向上一致，所述 的硝酸纤维素膜含有金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG ;
紧贴在垫板1和硝酸纤维素膜3之间的结合垫2，结合垫2贴在硝酸纤维素膜3和 垫板1之间部分的长度为垫板长度的1/5-1/4，并且所述的结合垫2为含有脱脂酪蛋白、金 标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纤维膜，优选地，所述的结合垫2为 一个结合垫； 紧贴在硝酸纤维素膜3上表面的结合垫2"，结合垫2"与硝酸纤维素膜3部分重 叠，该重叠部分的正投影与上述结合垫2贴在硝酸纤维素膜3和垫板1之间的部分至少部 分重叠，所述的结合垫2"与硝酸纤维素膜重叠部分的长度为垫板长度的1/30-1/20，所述 的结合垫2"为含有脱脂酪蛋白、金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃 纤维膜； 两片吸水滤纸4， 一片紧贴在结合垫2"的上表面，并且该吸水滤纸、结合垫2"、硝 酸纤维素膜3、结合垫2和垫板1的正投影有共同的重叠部分，另一片紧贴在硝酸纤维素膜 上表面与结合垫2"相距最远的位置，该吸水滤纸与另一吸水滤纸、结合垫2"或结合垫2之 间最近的距离为垫板长度9/20-7/15，并且该最近的距离内是相互重叠的垫板和硝酸纤维 素膜。
发明制备的检测禽流感病毒的试纸条不同于现有的试纸条，这是因为在本发明试 纸条的结合垫上含有脱脂酪蛋白，所以相对于不含有脱脂酪蛋白的试纸条来说，本发明的 试纸条具有检测灵敏度高的优点。此外，结合垫2贴在硝酸纤维素膜3和垫板1之间部分 的长度为垫板长度1/5-1/4，这是为了满足待测样品在试纸条上走样所必需的；并且结合 垫2"与硝酸纤维素膜重叠部分的长度为垫板1长度的1/30-1/20，该吸水滤纸与另一吸水 滤纸、结合垫2"或结合垫2之间最近的距离为垫板长度9/20-7/15，并且该最近的距离内是 相互重叠的垫板和硝酸纤维素膜，这都是为了满足待测样品在试纸条上走样所必需的，本 试纸条的结构见图1。在结合垫2，结合垫2"上脱脂酪蛋白是通过结合垫在处理液中浸泡， 之后再干燥结合垫得到的，所述的处理液含有脱脂酪蛋白和磷酸盐缓冲液。并且结合垫2、 结合垫2"和硝酸纤维素膜上的金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG是通过在 这两个结合垫和硝酸纤维素膜上喷涂金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG，之 后干燥结合垫和硝酸纤维素膜得到的。 优选地，其中紧贴在垫板1和硝酸纤维素膜3之间的结合垫2是两个结合垫，这两 个结合垫之间长度方向上的空隙为垫板长度的9/20-7/15，结合垫2"与硝酸纤维素膜部分 重叠，该重叠部分的正投影与一个所述的结合垫2贴在硝酸纤维素膜3和垫板1之间的部 分至少部分重叠，另一个结合垫2的正投影至少部分重叠于距离结合垫2"最远位置的吸水 滤纸4。该结构的试纸条相对于前述试纸条的结构在垫板1和硝酸纤维素膜3之间多了结 合垫2，因此更有利于两边平衡。 优选地，所述试纸条的结合垫2和结合垫2"还含有1)阿拉伯胶、2)对苯二酚和 3)醋酸银或硝酸银。 优选地，所述的硝酸纤维素膜还含有l)阿拉伯胶、2)对苯二酚和3)醋酸银或硝酸 银。 本发明试纸条的结合垫和硝酸纤维素膜含有阿拉伯胶、柠檬酸盐、对苯二酚和醋
酸银或硝酸银。这些成分不存在于现有的试纸条，并且含有这些成分的试纸条的显色好于
现有的试纸条。当待测物中含有禽流感病毒时，在本发明的试纸条上呈蓝黑色，而在现有的
试纸条上呈红色，同时现有试纸条显色的清晰度也不如本发明的试纸条。 本发明的另一方面提供了处理感染禽流感病毒动物的粪便和分泌物的溶液，该溶
液包含pH值为7. 0-7. 4的磷酸盐缓冲液、聚乙二醇和正丁醇。本发明中的感染禽流感病毒
的动物不仅是禽类动物，也可以是感染该病毒的家畜或者人。 现有技术中，没有专门用于处理感染禽流感病毒动物的粪便和分泌物的溶液，本 发明则提供了这种样品处理液，使用该处理液的目的是为了将感染禽流感动物的粪便和分 泌物中的病毒释放于所提供的处理液中。此外，释放的病毒更容易与试纸条上的抗病毒抗 体相结合，使得试纸条的显色更为灵敏。 优选地，所述溶液包含O. 5% -1. 5%质量浓度的聚乙二醇20000、8% _12%质量浓 度的正丁醇、pH值为7. 2的磷酸缓冲液。 更优选地，所述溶液包含1%质量浓度的聚乙二醇20000、 10%质量浓度的正丁醇 和0. 05mol/L pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液。 本发明的另一方面还提供了一种制备所述试纸条的方法，该方法包括以下步骤
a.将玻璃纤维膜充分浸泡于处理液中，再将处理后的玻璃纤维膜干燥，得到所述的结合垫，所述的处理液含有脱脂酪蛋白和磷酸盐缓冲液； b.将金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG喷涂于所述的步骤a得到 的结合垫和空白的硝酸纤维素膜并进行干燥； c.将吸水滤纸、步骤b得到的硝酸纤维素膜和结合垫按照前述的位置关系固定于 所述的垫板上，得到所述的试纸条。 优选地，在所述的步骤b和步骤c之间，还将干燥后的涂覆有金标记的AIV单克隆 抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的结合垫和硝酸纤维素膜用EDC(购自上海延长生化科技发展 有限公司，商品号4108，商品名称1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液浸 泡、干燥之后再置于银离子处理液浸泡并干燥。 优选地，所述的金标记的AIV单克隆抗体的浓度为3. 75-4. 25mg/ml，AIV血清的浓 度为4. 75-5. 25mg/ml，羊抗鼠IgG的浓度为4. 75-5. 25mg/ml。 优选地，所述银离子处理液含有阿拉伯胶、pH值为3. 5的柠檬酸盐缓冲液、对苯二 酚和醋酸银溶液，并且阿拉伯胶的体积PH值为3.5的柠檬酸盐缓冲液的体积对苯二酚
的体积醋酸银溶液的体积为6 :i:2:i。 优选地，其中所述的阿拉伯胶的质量浓度为14-16 %、对苯二酚的质量浓度为 80% _90%、醋酸银的浓度为9. 5-10. 5%。 更优选地，所述的阿拉伯胶的质量浓度为15%、对苯二酚的质量浓度为85%、醋 酸银溶液的浓度为10%。 优选地，所述的步骤a中处理液中含有0.75_1.25%质量浓度的脱脂酪蛋白和 0. 025-0. 075mol/L磷酸盐缓冲液。 更优选地，所述步骤a中处理液中含有1.0X质量浓度的脱脂酪蛋白和pH值为 7. 2的0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液。 优选地，本发明中的AIV血清为羊抗AIV血清或鼠抗AIV血清。 本发明的试纸条用于检测禽类动物粪便中的禽流感病毒，当AIV抗原与结合垫中
金标抗体结合后，通过层析运动到硝酸纤维素膜再与羊抗AIV抗体结合，出现沉淀线，该线
简称检测线或T线，未结合完的抗原与金标抗体结合物继续运动与NC膜上的羊抗鼠抗体结
合，形成第2条沉淀线，该线简称质控线或C线。若在测试条上方仅出现一条带，则表示为
阴性；若在测试条上方出现2条蓝黑色带，则表示为阳性；若在测试条上方不出现色带，则
表示测试条失效。 本发明的试纸条具有以下的有益效果①灵敏度好在进行灵敏度检验的时候， 将AIV抗原按0、0. 25、0. 5、1. 0、5. 0、7. 5、 10、20、40、80ng/ml稀释浓度进行检测，检测线出 现蓝黑色的最低可测定量，即为此试剂条的灵敏度。结果表明，当AIV抗原的浓度为7. 5ng/ ml时，检验线为蓝黑色。②特异性试验用本试纸条检测带有相同浓度的鸡新城疫病毒(英 文简称NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(英文简称IBV)、传染性法氏囊病病毒(英文简称 IBDV)的禽类动物的粪便和正常的尿囊液，观察测试结果，看有无假阳性反应、交叉反应。结 果表明，本发明研制的试纸条对AIV反应为阳性，对含有NDV、 IBV、 IBDV的禽类动物粪便及 正常尿囊液的检测为阴性。这说明本试纸条无交叉反应和假阳性反应。
图1为本发明试纸条的结构的示意图，图中1-垫板，2-结合垫(玻璃纤维素膜)， 3_硝酸纤维素膜，2"-结合垫，4-吸水滤纸。 图2为本发明试纸条的另一种结构的示意图，图中1-垫板，2_结合垫(玻璃纤维 素膜)，3-硝酸纤维素膜，2"-结合垫，4-吸水滤纸。 图3为本发明试纸条的外观示意图，图中1' _装试纸条外壳，2'-加样孔， 3'-观察孔。
具体实施例方式
实施例1 胶体金溶液的制备 向4ml质量浓度为1 %的柠檬酸三钠(Na3C6H507 2H20)中加入0. 5ml质量浓度为 1 %的鞣酸和0. 5ml 25mmo/L的K2C03溶液(K2C03溶液与鞣酸加入的体积量相等)，用双蒸 馏水补至柠檬酸三钠_鞣酸_K2C03的混合溶液最终体积为20ml，加热至60°C 。取1ml浓度 为1X的HAuCl4加入79ml的双蒸馏水中，水浴加热至60°C，然后迅速加入柠檬酸三钠-鞣 酸_K2C03的混合溶液，于6(TC温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色，大约30-60min 后，再将含有HAuCh的混合溶液加热至沸腾，保持沸腾5min即可。冷却至室温，得到胶体 金溶液，经过滤除菌，装入洁净的玻璃瓶中，在fC下保存备用。本实施例中的溶液均用超纯 水或双蒸水配置，并用微孔滤膜过滤，去掉水中的杂质。
实施例2
AIV单克隆抗体的制备 用H9N2亚型AIV作为抗原免疫接种SPF鸡制备高血清。用饱和硫酸铵法从该血 清中提取免疫球蛋白G(IgG)，以该IgG制备弗氏佐剂疫苗免疫SPF BALB/c小鼠，取其脾细 胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下融合，采用间接ELISA检测法筛选获得3株 (2H1D1、2H1G4、3H2D7)分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，这三株杂交瘤细胞分泌AIV 单克隆抗体。 AIV高免疫血清的制备 将禽流感病毒抗原纯化后制成弗氏佐剂抗原免疫山羊和小鼠，制备羊抗AIV高免 血清和鼠抗AIV高免血清。 羊抗鼠IgG购自于北京博迈世纪生物技术有限公司，抗体货号A8129，商品名称 羊抗鼠IgG。
实施例3 胶体金标记的AIV单克隆抗体的制备 取18nm的胶体金20mL，用K2C03溶液(pHll， 0. 05mol/L)调其pH为7. 5-8. 5 ;分别 加入200ml浓度为3. 75mg/mL和4. 25mg/mL实施例2获得的AIV单克隆抗体溶液，室温反 应4-5min ;加入含10% BSA、 10%蔗糖的PBS 200 y L， 4°C 30000g离心力下离心30min，弃上 清液；用O. 05mol/L pH 7. 2PBS 20mL溶解沉淀，4°C 30000g离心力下离心30min，弃上清液； 用含3%甘油、5% PEG、0. 05mol/L pH7. 2的PBS 20mL溶解沉淀，分别制的浓度为3. 75mg/ mL和4. 25mg/mL金标记的AIV单克隆抗体，4t:贮存备用
实施例4 结合垫和硝酸纤维素膜的制备 首先将玻璃纤维膜置于0. 75%脱脂酪蛋白和0. 05mol/L pH值为7. 2的磷酸缓冲 液组成的混合溶液中进行浸泡处理，1小时后取出并干燥15分钟，得到结合垫，该结合垫可 以作为附图中的结合垫2，也可以作为结合垫2"。 将实施例3得到的3. 75mg/mL的金标记的AIV单克隆抗体和实施例2制备得到AIV 血清的工作浓度调整到4. 75mg/ml和4. 75mg/ml的羊抗鼠IgG喷涂于所述的结合垫和空白 的硝酸纤维素膜，并在35-4(TC的烘箱内烘干20-30min。再将处理后的结合垫和硝酸纤维 素膜置于EDC溶液中浸泡15min，风干5min后，再将结合垫置于银离子处理液浸泡2小时， 风干15min。所述的银离子处理液的配方为体积比为6 :1:2: 1的质量浓度为15% 的阿拉伯胶、pH值为3. 5的柠檬酸缓冲液、质量浓度为85%的对苯二酚和质量浓度为10% 的醋酸银溶液混合后得到银离子处理液。本实施例的结合垫含有脱脂酪蛋白、金标记的AIV 单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纤维；本实施例的硝酸纤维素膜上含有金标记的 AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG。
实施例5 结合垫和硝酸纤维素膜的制备 首先将玻璃纤维膜置于1. 25%脱脂酪蛋白和0. 075mol/L pH值为7. 2的磷酸缓冲 液组成的混合溶液中进行浸泡处理，1小时后取出并干燥15分钟，得到结合垫，该结合垫可 以作为结合垫2，也可以作为结合垫2"。 将实施例3得到的4. 25mg/ml的金标记的AIV单克隆抗体和实施例2制备得到的 AIV血清的工作浓度调整到5. 25mg/ml和5. 25mg/ml的羊抗鼠IgG喷涂于所述的结合垫和 空白的硝酸纤维素膜，并在35-4(TC的烘箱内烘干20-30min。再将处理后的结合垫和硝酸 纤维素膜置于EDC溶液中浸泡15min，风干5min后，再将结合垫置于银离子处理液浸泡2 小时，风干15min。所述的银离子处理液的配方为体积比为6 :1:2: l的质量浓度为 16%的阿拉伯胶、pH值为3. 5的柠檬酸缓冲液、质量浓度为90%的对苯二酚和质量浓度为 10. 5%的醋酸银溶液混合后得到银离子处理液。本实施例的结合垫含有脱脂酪蛋白、金标 记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纤维；本实施例的硝酸纤维素膜上含有 金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG。
实施例6
试纸条的制备 在垫板1上表面的一侧上固定实施例4制备得到的结合垫，该结合垫作为结合垫 2，其长度为垫板长度的1/4，与垫板1的一端对齐，再将实施例4得到的硝酸纤维素膜固定 在结合垫2的上表面和垫板另一侧的上表面，硝酸纤维素膜为垫板长度的1/2，再在与结合 垫2相同的一侧的硝酸纤维素膜的上表面固定实施例4得到的结合垫，该结合垫作为结合 垫2"，结合垫2"与硝酸纤维素膜3重叠部分的正投影与结合垫2在硝酸纤维素膜3和垫板 1之间的部分部分重叠，结合垫2"与硝酸纤维素膜重叠部分的长度为垫板1长度的1/30， 最后在结合垫2"的上表面和与结合垫2"相对的硝酸纤维素膜另一侧的上表面分别固定两 片吸水滤纸，得到用于检测禽流感病毒的试纸条。与结合垫2"相对一端的吸水滤纸、结合 垫2"或结合垫2之间最近的距离是垫板长度的7/15，制备好的试纸条见图1。在本实施例中采用不干胶固定硝酸纤维素膜、结合垫和吸水滤纸。该垫板是白色的塑料垫板(购自上 海金标生物科技有限公司，商品名称塑料诊断胶板)。
实施例7
试纸条的制备 在垫板上表面的两侧分别固定实施例5制备得到的两个结合垫，该结合垫作为结 合垫2，两个结合垫的一样长，均为垫板长度的1/4，所以在两个结合垫之间存在空隙，再将 实施例5得到的硝酸纤维素膜固定在这两个结合垫2的上表面，硝酸纤维素膜为垫板长度 的17/30，再将实施例5得到的一个硝酸纤维素膜固定在这两个结合垫的上表面上，再在硝 酸纤维素膜上表面的一侧固定结合垫2"，结合垫2"与硝酸纤维素膜3重叠部分的正投影 与结合垫2在硝酸纤维素膜3和垫板1之间的部分部分重叠，结合垫2"与硝酸纤维素膜重 叠部分的长度为垫板1长度的1/30，在结合垫2"上表面固定一片吸水滤纸，与结合垫2" 相对的硝酸纤维素膜上表面的另一侧固定另一片吸水滤纸，与结合垫2"相对一端的吸水滤 纸、结合垫2"或结合垫2之间最近的距离是垫板长度的7/15，得到用于检测禽流感病毒的试 纸条，制备好的试纸条见图2。在本实施例中采用不干胶固定硝酸纤维素膜、结合垫和吸水滤 纸。该垫板是白色的塑料垫板(购自上海金标生物科技有限公司，商品名称塑料诊断胶板)。
实施例8
处理动物粪便溶液的制备 该溶液中含有1%质量浓度的聚乙二醇20000、 10X的质量浓度的正丁醇，pH值为 7. 2的磷酸缓冲液，该缓冲液中含有8. 5g/L的NaC1、2. 2g/L的Na2HPO^P 0. 3g/L的NaH2P04，
所述的其他成分的溶液均用磷酸缓冲液。 实施例9 处理动物粪便溶液的制备 该溶液中含有0. 5%质量浓度的聚乙二醇20000、8%的质量浓度的正丁醇和其余
量的PH值为7. 2的磷酸缓冲液。 实施例10 处理动物粪便溶液的制备 该溶液中含有1. 5%质量浓度的聚乙二醇20000、12%的质量浓度的正丁醇和其 余量的PH值为7. 2的磷酸缓冲液。
实施例11 本发明的试纸条检测动物粪便中是否含有禽流感病毒的方法 将野外采集的动物粪便首先用以下溶液进行处理，该溶液含有1%质量浓度的聚 乙二醇20000、 10%质量浓度的正丁醇和pH值为7. 2、的磷酸盐缓冲液。以12ml溶液溶解 lg动物粪便的比例溶解采集的动物粪便，充分搅拌直到动物粪便充分溶解分散于溶液中， 取05-lml的上清液滴加到试纸条上的加样孔中，从观察孔中观察到2条蓝黑色带，表明采 集的动物粪便中含有禽流感病毒，这证明被检验动物感染了禽流感病毒。采用不同浓度测 的病毒抗原检测试纸条的灵敏度，本发明试纸条的检测病毒的灵敏度可达到7. 5ng/ml。
实施例12 本发明的试纸条检测动物唾液中是否含有禽流感病毒的方法 采集可能感染禽流感病毒的动物唾液首先用以下溶液进行处理，该溶液含有1 %质量浓度的聚乙二醇20000、 10%质量浓度的正丁醇和pH值为7. 2、0. 05mol/L的磷酸盐缓 冲液。以1ml溶液溶解lg唾液的比例溶解采集的动物唾液，混匀后，取05-lml的溶液滴加 到试纸条上的加样孔中，从观察孔中观察到2条蓝黑色带，这表明被检测动物感染了禽流 感病毒。采用不同浓度测的病毒抗原检测试纸条的灵敏度，本发明试纸条的检测病毒的灵 敏度可达到7. 5ng/ml。
权利要求
一种检测禽流感病毒的试纸条，该试纸条包括以下部分垫板(1)，所述的垫板为塑料垫板；位于垫板(1)上的硝酸纤维素膜(3)，其小于垫板(1)并与垫板(1)的长度差为垫板长度的13/30-1/2并与垫板(1)部分重叠，所述的硝酸纤维素膜与垫板在长度方向上一致，所述的硝酸纤维素膜含有金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG；紧贴在垫板(1)和硝酸纤维素膜(3)之间的结合垫(2)，结合垫(2)贴在硝酸纤维素膜(3)和垫板(1)之间部分的长度为垫板长度1/5-1/4，并且所述的结合垫为含有脱脂酪蛋白、金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纤维膜，优选地，所述的结合垫(2)为一个结合垫；紧贴在硝酸纤维素膜(3)上表面的结合垫(2”)，结合垫(2”)与硝酸纤维素膜(3)部分重叠，该重叠部分的正投影与上述结合垫(2)贴在硝酸纤维素膜(3)和垫板(1)之间的部分至少部分重叠，结合垫(2”)与硝酸纤维素膜重叠部分的长度为垫板(1)长度的1/30-1/20，所述的结合垫(2”)为含有脱脂酪蛋白、金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纤维膜；两片吸水滤纸(4)，一片紧贴在结合垫(2”)的上表面，并且该吸水滤纸、结合垫(2”)、硝酸纤维素膜(3)、结合垫(2)和垫板(1)的正投影有共同的重叠部分，另一片紧贴在硝酸纤维素膜上表面与结合垫(2”)相距最远的位置，该吸水滤纸与另一吸水滤纸、结合垫(2”)或结合垫(2)之间最近的距离为垫板长度的9/20-7/15，并且该最近的距离内是相互重叠的垫板和硝酸纤维素膜。
2. 根据权利要求1所述的试纸条，其中紧贴在垫板(1)和硝酸纤维素膜(3)之间的结 合垫(2)是两个结合垫，这两个结合垫之间长度方向上的空隙为垫板长度的9/20-7/15，结 合垫(2")与硝酸纤维素膜(3)部分重叠，该重叠部分的正投影与一个所述的结合垫(2)贴 在硝酸纤维素膜(3)和垫板(1)之间的部分至少部分重叠，另一个结合垫(2)的正投影至 少部分重叠于距离结合垫(2")最远位置的吸水滤纸(4)。
3. 根据权利要求1或2所述的试纸条，其中所述的结合垫(2)和结合垫(2")还含有 1)阿拉伯胶、2)对苯二酚和3)醋酸银或硝酸银。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试纸条，其中所述的硝酸纤维素膜还含有1)阿拉 伯胶、2)对苯二酚和3)醋酸银或硝酸银。
5. —种处理感染禽流感病毒动物的粪便和分泌物的溶液，该溶液包含pH值为7. 0-7. 4 的磷酸盐缓冲液、聚乙二醇和正丁醇。
6. 根据权利要求5所述的溶液，其中所述溶液包含0. 5-1. 5%质量浓度的聚乙二醇 20000、8% _12%质量浓度的正丁醇^11值为7. 2的磷酸缓冲液，优选地，所述溶液包含1% 质量浓度的聚乙二醇20000、 10%质量浓度的正丁醇和0. 05mol/L pH值为7. 2磷酸盐缓冲 液。
7. —种制备权利要求1或2所述试纸条的方法，该方法包括以下步骤a. 将玻璃纤维膜充分浸泡于处理液中，再将处理后的玻璃纤维膜干燥，得到所述的结 合垫，所述的处理液含有脱脂酪蛋白和磷酸盐缓冲液；b. 将金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG喷涂于步骤a得到的结合垫和 空白的硝酸纤维素膜并进行干燥；c.将吸水滤纸、步骤b得到的硝酸纤维素膜和结合垫按照权利要求1或2所述的位置 关系固定于所述的垫板上，得到所述的试纸条。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中在所述的步骤b和步骤c之间，还将干燥后的喷涂 有金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的结合垫和硝酸纤维素膜用EDC溶液 浸泡、干燥之后再置于银离子处理液浸泡并干燥。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其中所述的金标记的AIV单克隆抗体的浓度为 3. 75-4. 25mg/ml， AIV血清的浓度为4. 75-5. 25mg/ml，羊抗鼠IgG的浓度为4. 75-5. 25mg/ ml。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中所述的银离子处理液含有阿拉伯胶、pH值为 3. 5的柠檬酸盐缓冲液、对苯二酚和醋酸银溶液，并且阿拉伯胶的体积pH值为3. 5的柠檬酸盐缓冲液的体积对苯二酚的体积醋酸银溶液的体积为6 :i:2:i。
11. 根据权利要求10中所述的方法，其中所述的阿拉伯胶的质量浓度为14-16%、对苯 二酚的质量浓度为80-90%、醋酸银的质量浓度为9. 5-10. 5%，优选地，所述的阿拉伯胶的 质量浓度为15%、对苯二酚的质量浓度为85%、醋酸银溶液的浓度为10%。
12. 根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中步骤a所述的处理液中含有 0. 75-1. 25%质量浓度的脱脂酪蛋白和0. 025-0. 075mol/L磷酸盐缓冲液，优选地，所述的 处理液中含有1. 0%质量浓度的脱脂酪蛋白和pH值为7. 2的0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种检测禽流感病毒的试纸条，该试纸条包括以下部分垫板1；硝酸纤维素膜3，所述的硝酸纤维素膜含有金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG；结合垫2和结合垫2”，所述的结合垫2和结合垫2”分别为含有脱脂酪蛋白、金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纤维膜；硝酸纤维素膜3，所述的硝酸纤维素膜含有金标记的AIV单克隆抗体、AIV血清和羊抗鼠IgG；两片吸水滤纸4；本发明还对这几部分的长度和位置关系作了限定。本发明还提供了一种处理禽流感病毒感染动物的排泄物和分泌物的样品处理溶液和制备试纸条的方法。本发明的试纸条具有灵敏度好，特异性强的优点。
文档编号G01N33/558GK101726597SQ20081022493
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月27日 优先权日2008年10月27日
发明者何宏轩, 吴艳云, 王承民 申请人:中国科学院动物研究所