专利名称：一种用于检测猪流感病毒的nasba方法
一种用于检测猪流感病毒的NASBA方法技术领域
本发明属于动物卫生检验技术领域，涉及一种用于检测猪流感病毒的NASBA方法。
背景技术：
猪流感(Swine influenza，SI)由流感病毒属A型流感病毒中的猪流感病毒 (Swine influenza virus，SIV)引起，是集约化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之一。该病典型临床症状为发热、厌食、体重减轻、精神萎靡、流涕、咳嗽以及呼吸困难等。 其单独感染时病死率较低，但该病常与其他传染病混合感染，如传染性胸膜肺炎放线杆菌等，使病情加重，大大的提高了病死率。
常见的流感病毒的受体有两种一种为唾液酸α-2，3半乳糖(SA α-2，3_Gal )， 另一种为唾液酸α-2，6半乳糖(3々(1-2，6-6&1)。不同流感病毒的HA受体特异性有所不同，多数禽流感病毒优先结合SA α-2，3Gal，而人流感病毒则优先结合SA α-2，6_Gal，猪流感病毒则对SAa-2，3-Gal与SA α _2，6_Gal均具有相同的结合能力。猪呼吸道上皮细胞表面同时存在人和禽流感病毒受体SAa-2，6-Gal和SAa_2，3_Gal，因此猪可被禽流感病毒和人流感病毒感染，同时SIV也具有感染人和禽的潜力。由此，猪成为了流感病毒基因重组或重配的“混合器”，不同亚型、不同宿主之间的A型流感病毒在猪体内进行重组，产生各种新的病毒株。20世纪以来人类每次流感大流行爆发的前后都伴随着SI的发生与流行，猪在流感病毒种间传播链中所起的作用不容忽视。2009年甲型Hmi流感病毒的产生就是其中的一例，该毒株的产生导致了大量人群的死亡。所以加强对SIV的检测不仅在兽医界具有重要意义，对人流感的研究也有一定的意义，可以最大限度的降低人流感大流行再次爆发的可能性，对人类的生命安全具有长远的公共卫生学意义。
核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一种分子生物学扩增新技术。是一种特异性等温扩增RNA的技术，是基于一个等温扩增酶系统，包括AMV逆转录酶(AMVRT)、RNaseH和T7RNA聚合酶。以RNA为模板，在AMV逆转录酶和引物I的作用下合成cDNA，引物I的5'端带有T7启动子序列，然后引物II与cDNA链退火合成cDNA链的互补链，进而形成了含完整T7启动子序列的双链DNA。T7RNA聚合酶以此双链DNA为模扳，合成大量拷贝的RNA片段。1991年，compton J首先介绍了该方法。与普通PCR不同的是，NASBA是由带有T7启动子序列的引物引导的、等温的核酸扩增技术。反应在41°C进行，能在1- 内将模板RNA扩增IO9倍，且不需特殊仪器，是一种快速、简便、特异的扩增技术。
猪流感病毒是负链RNA病毒，病毒基因组由8个分节段的RNA组成，其中核蛋白 (NP)基因相对保守，通过对A、B、C三型流感病毒NP蛋白氨基酸序列比对结果表明A和B型流感病毒的NP蛋白具有很高的同源性。同时，来自不同宿主A型流感病毒株的系统发育树也表明NP基因相当保守，毒株之间最大氨基酸差别不超过11%。因此核蛋白经常作为流感病毒型的分类和诊断的候选基因。本发明以猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，为猪流感的防控提高技术支撑，保障养猪业的健康、快速发展。发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测猪流感病毒的NASBA。为实现此目的，本发明提供如下的技术方案一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性扩增引物，其特征在于所述的扩增引物如 SEQ NO 1, SEQ NO 2 所示。
本发明进一步公开了采用SEQ NO 1, SEQ NO 2特异性扩增引物检测猪流感病毒 NASBA的方法，其特征在于按如下的步骤进行(1)提取病毒RNA使用TRIZOL试剂提取RNA ；(2)NASBA扩增体系 将待检样品RNA 3μ1 ； 缓冲液4μ1 10mM/L dNTP 2μ1 20mM/L NTP 2μ1 DMSO μ 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 引物 NP-DET 2μ1(3)NASBA扩增程序在DNA扩增仪上65 °C加热5min，41 V冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液，41 °C反应 90min ；4°C终止反应；(4)NASBA扩增产物鉴定1)将部分猪流感分离株的NASBA扩增产物稀释10倍，作为模板进行反转录后；2)反转录体系:5XRT buffer 4μ ,2. 5mmol dOTWL、Random Primer Ιμ , Rnase inhibitor 0. 5PL、AMV μ 、10 倍稀释的 NASBA 扩增产物 9. 5μ ；3)反转录程序将反转录反应管在PCR仪上按以下程序反应 30°C，10min，42°C，lh，99°C，5min，迅速降温到 4°C ；(5)PCR扩增1)引物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)PCR 反应体系10XRT-PCR buffer 2μ , Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反转录产物 9. 5μ 、水 3μ ；3)PCR扩增程序将PCR反应管放入在PCR仪上按以下程序反应95°C反应5min后； 940C 30s, 560C 30s, 72°C 30s，三个温度循环反应；35个循环；72°C 10min,4°C终止反应。
4) PCR结果观察用1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。
其中步骤(2)中所指的缓冲液为含40mM/LPH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl,12mM/L MgCl2, 5mM/L DTT 缓冲液。
其中步骤(3)中所指的酶混合液包含1 2U AMV, 0. 2 0. 5U RNaseH, 30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/mlBSA。
本发明更加详细的制备方法如下 1材料1.1 病毒猪流感病毒A/Swine/Tianjin/ ΤΛ/2004(HlNl)(可由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室的猪流感标准毒株A/Swine/ Coloraelo/1/77 (HlNl)代替)猪瘟弱毒(C 株，购自广东永顺生物制药有限公司)，猪伪狂犬病病毒(MinA株，购自中国兽药监察所)， 猪细小病毒(PPV7909株，购自中国兽药监察所)。
1.2分子生物学试剂RNA提取试剂Trizol购自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆转录酶、BSA购自Promega公司；dNTP、NTP购自上海生工生物工程有限公司。
1.3鸡胚购自天津市某鸡场。
1.4引物的设计与合成针对GENEBANK中已发表的猪流感病毒NP基因使用I^rimerpremierS. 0设计合成引物， 引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物如下 NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3' 2 方法2.1 提取病毒RNA病毒RNA的提取取猪流感病毒鸡胚尿囊液200mL加入1. 5mL离心管中，加入 600μ1 Trizol液，震荡混勻，室温静置5min，再加入200 μ 氯仿，震荡混勻，室温静置5min， 4°C 12000rpm离心IOmin ；取上清液到1. 5mL离心管中，加入800μ1含1%。DEPC的异丙醇，颠倒混勻，12000rpm离心lOmin，弃上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 40C 12000rpm离心lOmin，倒掉乙醇，室温晾干，加入20 PlDEPC水溶解，_80°C保存备用。
2.2 NASBA 扩增体系3μ1 待检样品 RNA和 4μ1 缓冲液、2μ1 10mM/L (1ΝΤΡ、2μ1 20mM/L ΝΤΡ、 μ1 DMS0、2Pl 引物ΝΡ-Τ7、2μ1引物NP-DET，加入到小离心管中。
2.3 NASBA 扩增程序在DNA扩增仪上65 °C加热5min，41 V冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液，41 °C反应 90min ；4°C终止反应。
2. 4 NASBA扩增产物鉴定(1)将部分猪流感分离株的NASBA扩增产物稀释10倍，作为模板进行反转录后。
(2)反转录体系 5X RT buffer 4μ ,2. 5mmoldNTP 4μ , Random Primer Ιμ , RNase inhibitor 0.5PL、AMV μ 、10 倍稀释的 NASBA 扩增产物 9· 5μ 。
(3)反转录程序将反转录反应管在PCR仪上按以下程序反应 300C lOmin, 42°C lh, 99°C 5min，迅速降温到 4°C。
(4) PCR 扩增1)引物即为NASBA扩增产物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)卩0 反应体系1(^肌-卩0 13肚作『2μ ,Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反转录产物 9. 5μ 、水 3μ 。
3) PCR扩增程序将PCR反应管放入在PCR仪上按以下程序反应95°C反应5min 后；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，三个温度循环反应；35个循环；72°C 10min,4°C终止反应。
4)PCR结果观察用1%的琼脂糖凝胶电泳(IOOmL琼脂糖加入ΙΟμ ΕΒ)，在紫外灯下观察结果。预期产物大小为391bp。见图1。
本发明采用NASBA方法检测猪流感病毒，完成如下的实验 (1)特异性实验1、提取猪流感病毒A/Swine/Tianjin/ ΤΛ/2004(HlNl)(可由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室的猪流感标准毒株A/Swine/ Coloraelo/1/77 (HlNl)代替)、A/ Swine/Tianjin/ TJ3/2006 (H3N2)(可由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室的猪流感标准毒株A/Swine/ Tennessee/26/77 (H3N2)代替)、猪瘟弱毒(C株，购自广东永顺生物制药有限公司)，猪伪狂犬病病毒(MinA株，购自中国兽药监察所)，猪细小病毒 (PPV7909株，购自中国兽药监察所)的DNA或者RNA，使用猪流感病毒NASBA方法检测。
2、提取病毒RNA病毒RNA的提取取猪流感病毒鸡胚尿囊液200mL加入1.5mL离心管中，加入 600μ1 Trizol液，震荡混勻，室温静置5min，再加入200 μ 氯仿，震荡混勻，室温静置5min， 4°C 12000rpm离心IOmin ；取上清液到1. 5mL离心管中，加入800μ1含1%。DEPC的异丙醇，颠倒混勻，12000rpm离心lOmin，弃上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 4°C 12000rpm离心lOmin，倒掉乙醇，室温晾干，加入20 μ DEPC水溶解，_80°C保存备用。
3、扩增反应(1)反应体系3μ1 待检样品 RNA (或 0ΝΑ)、4μ1 缓冲液、2μ1 10mM/L (1ΝΤΡ、2μ1 20mM/L ΝΤΡ、 μ1 DMS0、2Pl引物ΝΡ_Τ7、2μ1引物NP-DET，加入到离心管中。
(2)扩增过程65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液，41°C反应 90min ；4°C终止反应。
4、NASBA扩增产物鉴定将各菌(毒)株的NASBA扩增产物稀释10倍，取9. 5 μ 作为模板进行反转录后， 采用引物NP-DET和ΝΡ-Τ7进行RT-PCR扩增，结果猪流感病毒TJl株和TJ3株扩增出了 391bp的目的片段，猪瘟弱毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒均未扩增出目的片段。说明该方法具有较高的特异性。见图2。
(2)敏感性实验1、将猪流感病毒A/Swine/Tianjin/ TJ/2004 (HlNl)(可由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室的猪流感标准毒株A/Swine/ Coloraelo/1/77 (HlNl)代替)进行 KT1-IO-6的梯度稀释，每个稀释度均提取RNA，用NASBA方法进行检测。
2、提取病毒RNA病毒RNA的提取取猪流感病毒鸡胚尿囊液200mL加入1.5mL离心管中，加入 600μ1 Trizol液，震荡混勻，室温静置5min，再加入200 μ 氯仿，震荡混勻，室温静置5min， 4°C 12000rpm离心IOmin ；取上清液到1. 5mL离心管中，加入800μ1含1%。DEPC的异丙醇，颠倒混勻，12000rpm离心lOmin，弃上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 4°C 12000rpm离心lOmin，倒掉乙醇，室温晾干，加入20 μ DEPC水溶解，_80°C保存备用。
3、扩增反应(I)NASBA反应体系各种成分分别为，4μ1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 ΞΑ、2μ1引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET 和 3μ1 模板 RNA。
(2) NASBA扩增过程65°C加热5min，4rC冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液， 41°C反应90min ；4°C终止反应。
4.NASBA扩增产物鉴定猪流感病毒TJ1株的检测结果显示，能够检测到10_5稀释倍数的病毒液。(见图3)(3)临床样品的检测及对比实验采集怀疑为猪流感病毒感染的猪鼻腔拭子5份放入运输培养基中，送达实验室后，剧烈震荡，使病毒混合在运输培养基中，取200μ1运输培养基用于猪流感NASBA检测，其余接种鸡胚用于病毒分离。
1、临床样品的NASBA检测 (1)提取病毒RNA病毒RNA的提取取猪流感病毒鸡胚尿囊液200mL加入1.5mL离心管中，加入 600μ1 Trizol液，震荡混勻，室温静置5min，再加入200 μ 氯仿，震荡混勻，室温静置5min， 4°C 12000rpm离心IOmin ；取上清液到1. 5mL离心管中，加入800μ1含1%。DEPC的异丙醇，颠倒混勻，12000rpm离心lOmin，弃上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 4°C 12000rpm离心lOmin，倒掉乙醇，室温晾干，加入20 μ DEPC水溶解，_80°C保存备用。
(2)扩增反应①反应体系取 3μ1 模板 RNA、4“1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 DMS0、2Pl 引物 ΝΡ_Τ7、2μ1 引物NP-DET加入扩增管。
②扩增过程65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液，41°C反应 90min ；4°C终止反应。
(3 ) NASBA扩增产物鉴定在5份样品中3样品为阳性结果，其他样品均为阴性。见图4。
2、临床样品的病毒分离(1)方法将采集的临床样品用滤膜过滤后接种10日龄鸡胚的羊膜腔和尿囊腔，每个样品接种5个鸡胚。将鸡胚放入孵化器中培养96h，每天早晚两次照蛋，弃去Mh内死亡的鸡胚。孵化后，采集未死亡鸡胚的羊水和尿囊液，继续传代2次。将低3次传代的鸡胚羊水和尿囊液用血凝试验和血凝抑制试验，测定是否含有猪流感病毒。
(2)结果在5份样品中3样品含有猪流感病毒。
结论利用上述NASBA和病毒分离两种实验同时对临床样品进行检查，两种方法的符合率为100%，但NASBA方法较之病毒分离法可以更快的获得结果，可用于临床可疑的猪流感病毒样品的快速检测。
图1 NASBA扩增产物PCR检测结果；其中1 :DL2000，2 阳性样品，3 水对照；
图2特异性结果图；其中1 猪瘟弱毒，2 猪伪狂犬病病毒，3 猪细小病毒，4 猪流感 病毒TJl株，5 猪流感病毒TJ3株，6 猪流感病毒TJ4株，M =IOObp DNA ladder ；
图3敏感性实验图；其中1 =KT1稀释毒液，2 :10_2稀释毒液，3 :10_3稀释毒液，4 :10_4 稀释毒液，5 :10_5稀释毒液，6 :10_6稀释毒液；
图4为临床样品检测；其中Γ5 5份临床样品，6 阳性对照，7 阴性对照，M :DL2000 DNA Marker。
具体实施例方式
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪流感病毒NASBA-ELISA试 剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中RNA提取试 剂Trizol购自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆转录酶、BSA购自 Promega公司；dNTP、NTP购自上海生工生物工程有限公司。实施例1
(1)提取病毒RNA 取猪流感病毒鸡胚尿囊液200mL加入1.5mL离心管中，加入 600μ1 Trizol液，震荡混勻，室温静置5min，再加入200 μ 氯仿，震荡混勻，室温静置5min， 4°C 12000rpm离心IOmin ；取上清液到1. 5mL离心管中，加入800μ1含1 %。DEPC的异丙 醇，颠倒混勻，12000rpm离心lOmin，弃上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 40C 12000rpm离心lOmin，倒掉乙醇，室温晾干，加入20 PlDEPC水溶解，_80°C保存备用。(2 ) NASBA 扩增体系 将待检样品RNA 3μ1
缓冲液 4μ1 (含 40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2, 5mM/L DTT 缓 冲液)
lOmM/L dNTP 2μ1
20mM/L NTP 2μ1
DMSO μ
引物 ΝΡ-Τ72μ1
引物NP-DET 2μ1，加入到小离心管中；
(3)NASBA扩增程序
在DNA扩增仪上65°C加热5min，4rC冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液(包含1 2U AMV，0.2 0.5U RNase H，30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/ml BSA)，41°C 反应 90min ； 4°C终止反应；
(4)NASBA扩增产物鉴定
1)将部分猪流感分离株的NASBA扩增产物稀释10倍，作为模板进行反转录后；
2)反转录体系5XRT buffer 4μ ,2. 5mmol dNTP 4μ , Random Primer Ιμ , RNase inhibitor 0. 5μ , AMV μ , 10 倍稀释的 NASBA 扩增产物 9. 5μ ；
3)反转录程序将反转录反应管在PCR仪上按以下程序反应 30°C，10min，42°C，lh，99°C，5min，迅速降温到 4°C ；(5) PCR扩增1)引物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)PCR 反应体系10XRT-PCR buffer 2μ , Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反转录产物 9. 5μ 、水 3μ ；3)PCR扩增程序将PCR反应管放入在PCR仪上按以下程序反应95°C反应5min后；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，三个温度循环反应；35个循环；72°C 10min，4°C终止反应。
4) PCR结果观察用1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。
权利要求
1.一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性扩增引物，其特征在于所述的扩增引物如 SEQ NO 1, SEQ NO 2 所示。
2.一种采用权利要求1所述的特异性扩增引物检测猪流感病毒NASBA的方法，其特征在于按如下的步骤进行(1)提取病毒RNA使用TRIZOL试剂提取RNA ；(2)NASBA扩增体系 将待检样品RNA 3μ1 ； 缓冲液4μ1 10mM/L dNTP 2μ1 20mM/L NTP 2μ1 DMSO μ 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 引物 NP-DET 2μ1(3)NASBA扩增程序在DNA扩增仪上65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1酶混合液，41 °C反应 90min ；4°C终止反应；(4)NASBA扩增产物鉴定1)将部分猪流感分离株的NASBA扩增产物稀释10倍，作为模板进行反转录后；2)反转录体系5XRT buffer 4μ ,2. 5mmol dOTWL、Random Primer Ιμ , RNase inhibitor 0. 5PL、AMV μ 、10 倍稀释的 NASBA 扩增产物 9. 5μ ；3)反转录程序将反转录反应管在PCR仪上按以下程序反应 30 0C，IOmin，42 °C，lh，99°C，5min，迅速降温到 4°C ；(5)PCR扩增1)引物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)PCR 反应体系10XRT-PCR buffer 2μ , Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反转录产物 9. 5μ 、水 3μ ；3)PCR扩增程序将PCR反应管放入在PCR仪上按以下程序反应:95 V反应5min后； 940C 30s, 560C 30s, 72°C 30s，三个温度循环反应；35个循环；72°C 10min,4°C终止反应；4)PCR结果观察用1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中所指的缓冲液为含40mM/LPH8. 5 Tris-HCL,70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2, 5mM/L DTT 缓冲液。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中所指的酶混合液包含1 2UAMV,0. 2 0.5U RNaseH，30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/mlBSA。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测猪流感病毒的NASBA方法，主要包括提取病毒RNA；NASBA扩增体系；NASBA扩增程序；NASBA扩增产物鉴定；PCR扩增等步骤，本发明以猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于猪流感病毒的诊断，该方法具有较高的特异性及敏感性，能够检测到10-5稀释倍数的病毒液，可用于临床可疑的猪流感病毒样品的快速检测。同时也为提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，保障养猪业的健康、快速发展。
文档编号C12R1/93GK102534052SQ20121006926
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者任卫科, 吴莹, 崔尚金, 张国伟, 张荣升, 张莉, 李秀丽, 王志军, 鄢明华, 高荣玲 申请人:天津市畜牧兽医研究所