专利名称：一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及视网膜感光前体细胞的分离培养方法。
背景技术：
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,简称RP)是遗传性盲目最常见的病因之一。由于RP患者视力持续性下降的原因是感光细胞的变性和凋亡，而感光细胞不能再生，移植健康的视网膜组织或者感光细胞，已经成为目前最具前景的治疗策略。理想的供体细胞应当具有一定的可塑性，即处于由干细胞向成熟细胞发育的关键期，此时其正逐渐与上一级神经元发生整合，意味着这一时期的细胞具备与新生的、成年的、甚至病变的宿主视网膜发生突触联系的功能，早于或者晚于这一时期供体细胞均不能与宿主细胞发生融合。研究表明，处于特定时期的小鼠的视网膜感光前体细胞(Photoreceptor progenitor cell,PPC)可以与病变的视网膜建立突触联系，有效改善宿主视功能，这一开创性基础研究为视网膜移植临床试验指引了方向。根据这一研究成果，若能在人胚胎发育过程中寻找到具有该特性的理想的PPC细胞，就有可能对临床视网膜移植带来推动作用。目前关于人胚胎视网膜感光细胞发育的生物学特性研究较少，如何分离获得胚胎感光细胞也仅仅在动物实验中开展。因此，研究人胚胎视网膜感光细胞发育变化，分离、纯化视网膜感光前体细胞，显得尤为重要。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法，能够从视网膜中分离感光前体细胞，尤其能从人胚胎视网膜中分离，且分离效率高，获得的感光前体细胞纯度高。本发明提供了一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法，包括如下步骤a.提供视网膜；b.从步骤a中所述视网膜中分离出神经上皮组织；c.消化分离步骤b中的神经上皮组织并制成细胞悬液；d.将步骤c中的细胞悬液采用差速贴壁分离出视网膜感光前体细胞；e.低氧培养步骤d中视网膜感光前体细胞。该方法可以对不同物种、不同阶段的视网膜进行分离而得到感光前体细胞。优选的，步骤a中所述视网膜为人胚胎视网膜。优选的，所述人胚胎视网膜为12-16周的胚胎的视网膜。视蛋白(Opsin)是感光细胞的标记物，成熟感光细胞(主要是视杆细胞)的典型特征是生色团块即Opsin的形成，表明该细胞具有光电转换的功能。通过收集不同胚龄的人胚胎视网膜，进行常规固定，冰冻包埋切片，做Opsin免疫荧光鉴定，然后对Opsin表达变化确定PPC细胞来源的最佳胚胎周龄为12-16周。如图IA-图IF所示，图IA-图IF分别为9 周、12周、16周、20周、26周和32周的Opsin免疫荧光鉴定图，胚胎9周、12周时视网膜发育不成熟，大致可分为视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium,简称RPE)层、夕卜成神经细胞层(Outer neuroblast layer,简称ONBL)、内成神经细胞层(Innerneuroblast layer,简称INBL)，Opsin在该期视网膜中表达阴性；胚胎16周时视网膜各层细胞迅速分化，层次较前期鲜明和丰富，显微镜下可见RPE层、外核层(outer neuclear layer,简称 ONL)、外丛状层(outer plexiform layer,简称 OPL)、内核层(inner neulclear layer,简称 INL)、内丛状层(innerplexiform layer,简称 IPL)及神经节细胞层(ganglion cell layer,简称GCL)，首次可见少量细胞的Opsin染色阳性，即在第16周左右ONL层开始表达 Opsin ;随着周龄的增加，阳性细胞比例增多，20周时大部分ONL层细胞染色阳性，但着色程度较轻；而到26周、32周时，视网膜发育接近成熟，各层细胞排列更为紧密和有序，接近出生时的视网膜，Opsin在ONL和外节层(outer segment,简称OS)呈强阳性表达。Opsin在人胚胎第16周左右的视网膜ONL层开始表达，由此表明PPC细胞来源的最佳胚胎周龄为 12-16 周。 优选的，步骤b中所述神经上皮组织分离出后剪碎并用无钙镁液清洗。剪碎并用无钙镁液清洗有利于之后的组织消化。优选的，步骤c中所述消化分离采用的方法包括用lU/ml木瓜蛋白酶+0.02% EDTA的消化液于37°C消化10-30分钟；加入含DNA酶(DNase I)的NB培养基(Neurobasal medium)稀释消化液，轻轻晃动10秒并静置2分钟澄清，此时上清含有感光细胞，因此弃掉上清；加入NB，摇匀并静置澄清，此时上清含有感光前体细胞，因此收集上清并以2400g转速离心5分钟；离心后细胞沉于管底,弃上清,得细胞沉淀；所述细胞悬液通过向所述细胞沉淀中加入B27的NB培养基(含20ng/ml hBFGF, 20ng/ml hEGF的NB培养基)制成。神经细胞在分离过程中，突起易受到损伤，从而导致细胞死亡，使细胞的获得率大大降低，降低程度达10倍以上，因此神经细胞较少采用胰蛋白酶消化，而用消化作用较为温和的木瓜蛋白酶，本发明采用lU/ml浓度的木瓜蛋白酶和0. 02%的EDTA联合消化人胚胎视网膜，木瓜蛋白酶的浓度仅相当于正常浓度的1/10，消化效果较好。感光细胞位于神经层视网膜的最外层，其排列较为密集，在酶消化过程中，最先脱落。消化时，晃动和静置时间不能太长， 使不同种类的细胞得以较好分离，晃动10秒、静置2分钟较好。优选的，步骤d中所述差速贴壁采用的方法包括将所述细胞悬液接种于铺有基质胶的培养器皿，37°C培养2小时；收集未贴壁细胞接种普通培养器皿。差速贴壁是利用各种不同的细胞在体外培养时贴壁速度不同而区分的方法。将细胞悬液接种到培养器皿中， 置培养箱中孵育一定的时间，大多数成纤维细胞、成熟神经细胞、血细胞和部分胶质细胞贴附到培养器皿底壁上，收集未贴壁细胞再接种，从而提高了感光前体细胞的纯度。优选的，步骤e中所述低氧培养是在37°C，5% O2和5% CO2的环境中进行。低氧培养广泛应用于干细胞培养，能促进细胞增殖，本发明将低氧培养运用于视网膜前体细胞的培养，能很好地保持该类细胞特性和活性。与现有技术相比，本发明提供的从视网膜分离出神经上皮组织，再经消化分离、差速贴壁、低氧培养的方法，能有效去除视网膜中主要胶质细胞和成熟神经细胞，分离效率高且获得的感光前体细胞纯度高，还能保持细胞特性和活性，而且本发明能从人胚胎视网膜中分离感光前体细胞。
图1A-1F为本发明不同发育时期的人胚胎视网膜的视蛋白免疫荧光鉴定示意图；图2A-2G为本发明分离培养的视网膜感光前体细胞的免疫荧光鉴定示意具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。本实施例视网膜感光前体细胞的分离培养方法，具体实施方法如下a.提供视网膜；本步骤中，所述视网膜为16周的人胚胎的视网膜，当然也可以采用不同发育阶段的或者其他物种的视网膜进行分离培养，均能够实现发明目的，但采用12-16周的人胚胎的视网膜，尤其是16周的效果更佳；b.从步骤a中所述视网膜中分离出神经上皮组织；本步骤中，所述神经上皮组织在解剖显微镜下分离，且分离后剪碎组织并用无钙镁液清洗；c.消化分离步骤b中的神经上皮组织并制成细胞悬液；本步骤中，所述消化分离采用的方法包括用lU/ml木瓜蛋白酶+0. 02% EDTA的消化液于37°C消化10分钟；加入含DNase I的NB培养基稀释消化液，轻轻晃动10秒并静置2分钟澄清，弃上清；加入NB培养基，摇匀并静置澄清，收集上清并以转速2400g离心5 分钟；弃离心后的上清，得细胞沉淀；所述细胞悬液通过向所述细胞沉淀中加入B27的NB 培养基制成。本步骤中消化时间在10-30分钟均可实现发明目的，但采用消化10分钟效果较佳。d.将步骤c中的细胞悬液采用差速贴壁分离出视网膜感光前体细胞；本步骤中，所述差速贴壁采用的方法包括将所述细胞悬液接种于铺有基质胶的培养瓶(T75)，37°C培养2小时；2小时后即可见部分细胞贴壁，此时收集未贴壁细胞接种普通培养瓶。经检测，未贴壁细胞密度达到了 lX105/ml，说明分离效率高；e.低氧培养步骤d中视网膜感光前体细胞。本步骤中，所述低氧培养是在37°C，5% O2和5% CO2的环境中进行。可见细胞主要以贴壁形式生长，少量细胞悬浮生长，培养14天后，收集所有细胞继续传代培养。将第二代细胞调整细胞密度至lX106/ml，接种在24孔培养板中经Fibronectin处理的盖玻片上，50iU/盖片，置37°C和5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，4小时后轻缓添加全培养液至铺满孔底，二天后进行免疫细胞化学鉴定。免疫细胞化学鉴定结果如图2A-图2G所示，图 2A-图 2G 分别为 PAX6、CRX、S0X2、nestin、Ptublin III、Opsin、GFAP 七种蛋白的免疫荧光鉴定图。PAX6、S0X2、Nestin是视网膜干细胞的标志物，可见分离的细胞均呈阳性表达； CRX是感光前体细胞的标志物，可见分离的细胞大部分着色阳性；P -TublinIII在刚分化的幼稚神经细胞中即开始表达，可见大部分细胞神经元胞浆着色，主要由微管蛋白组成的突触显示清晰；0psin是成熟感光细胞的标记物,本研究中，仅少量细胞阳性,表明获得的细胞仍没有发育成熟，处于前体阶段；GFAP是胶质细胞的标志物，本研究中，可见GFAP表达阴性。综上表明获得的细胞为感光前体细胞。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本 发明技术方案的宗旨和范围 ，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于包括如下步骤a.提供视网膜；b.从步骤a中所述视网膜中分离出神经上皮组织；c.消化分离步骤b中的神经上皮组织并制成细胞悬液；d.将步骤c中的细胞悬液采用差速贴壁分离出视网膜感光前体细胞；e.低氧培养步骤d中视网膜感光前体细胞。
2.根据权利要求I所述的视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于步骤a中所述视网膜为人胚胎视网膜。
3.根据权利要求2所述的视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于所述人胚胎视网膜为12-16周的胚胎的视网膜。
4.根据权利要求3所述的视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于步骤b中所述神经上皮组织分离后剪碎并用无钙镁液清洗。
5.根据权利要求4所述的视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于步骤c中所述消化分离采用的方法包括用lU/ml木瓜蛋白酶+0. 02% EDTA的消化液于37°C消化10-30分钟；加入含DNase I的NB培养基稀释消化液，轻轻晃动10秒并静置2分钟澄清，弃上清；加入NB培养基，摇匀并静置澄清，收集上清并以转速2400g离心5分钟；弃离心后的上清，得细胞沉淀；所述细胞悬液通过向所述细胞沉淀中加入B27的NB培养基制成。
6.根据权利要求5所述的视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于步骤d中所述差速贴壁采用的方法包括将所述细胞悬液接种于铺有基质胶的培养器皿，37°C培养2小时；收集未贴壁细胞接种普通培养器皿。
7.根据权利要求6所述的视网膜感光前体细胞的分离培养方法，其特征在于步骤e中所述低氧培养是在37°C，5% O2和5% CO2的环境中进行。
全文摘要
本发明公开了一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法，通过从视网膜分离出神经上皮组织，再经消化分离、差速贴壁、低氧培养的方法分离培养视网膜感光前体细胞；与现有技术相比，本发明通过从视网膜分离出神经上皮组织，再经消化分离、差速贴壁、低氧培养的方法能有效去除视网膜中主要胶质细胞和成熟神经细胞，分离效率高且获得的感光前体细胞纯度高，还能保持细胞特性和活性，而且本发明能从人胚胎视网膜中分离培养感光前体细胞。
文档编号C12N5/073GK102618489SQ201210068790
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者刘勇, 曾玉晓, 阴正勤 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院