专利名称：流式细胞术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑膜转移的荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗检测试剂，尤其涉及一种流式细胞术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑膜转移的荧光探针。
背景技术：
视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，对视力和生命有严重的威胁和危害。它发生于视网膜核层，多发生于5岁以下，可单眼、双眼先后或同时罹患，90%的患者可以通过手术治疗得到康复。但本病易发生颅内脑脊液转移，常危及患儿生命，需及时采取化疗、放疗甚至自体干细胞移植等治疗措施。因此对脑脊液转移的早期发现、早期诊断及早期治疗是提闻治愈率、降低死亡率的关键。目前国内外主要通过MRI和CT及脑脊液细胞形态学检查来诊断视网膜母细胞瘤脑脊液转移，但MRI和CT对于早期转移的患者的诊断不敏感，容易产生假阴性结果，脑脊液细胞形态学检查由于脑脊液肿瘤细胞因变性或凋亡与淋巴细胞及炎症细胞难以区别，以及在转移早期肿瘤细胞数少不易发现等原因，其诊断的准确性及敏感性均较差，对治疗疗效的监测亦有不足(N. R. Cohen. Cytopathology2009 (20) 256-260)。正是由于目前的对诊断视网膜母细胞瘤脑脊液转移的各种检查方法还无法满足临床医生的要求，寻求一种快速简便且准确性和敏感性高的方法来诊断视网膜母细胞瘤脑脊液转移及监测疗效的方法极为重要。流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是近年来发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。流式细胞术不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行多参数分析，即在同一细胞上进行2-3种或多种抗原的共同表达的分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析，具有敏感性和准确性高的特点。目前临床上多运用于白血病和淋巴瘤的骨髓标本的诊断，而对视网膜母细胞瘤的诊断罕见报道。由于视网膜母细胞瘤细胞目前没有单一的特异性的抗原标志物，流式细胞术对视网膜母细胞瘤的诊断关键在于多种抗体的组合。
发明内容
本发明提供了一种流式细胞术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑膜转移的荧光探针，利用该荧光探针可以快速得到诊断结果。一种流式细胞术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑脊液转移的荧光探针，包括三种荧光标记抗体，所述三种荧光标记抗体为⑶2-FITC抗体、⑶56-PE抗体和⑶45-PerCP抗体。视网膜母细胞来源于多能神经外胚层的细胞，而CD56是一类免疫球蛋白样区域的膜糖蛋白神经细胞粘附分子，在神经外胚层来源的细胞表面表达，NK细胞主要也表达这种140kDa的⑶56异构体，而⑶45是血细胞系列限制性的膜蛋白分子，表达在除了红细胞外的包括造血干细胞到成熟血细胞(包括NK细胞)膜表面上，因此⑶56+/⑶45-表型可以避免误诊为NK细胞肿瘤，并可以作为判断神经内分泌肿瘤存在的指证。Chantada等用免疫组化检测骨髓中细胞神经节苷脂⑶2表达评价进展性的视网膜母细胞瘤[G. L. Chantada. J Pediatr Hematol Oncol 2006(28)369-373]。Laurent 等报道PCR检测脑脊液细胞⑶2mRNA表达可诊断视网膜母细胞瘤的脑脊液转移[V. E. Laurent.Molecu Lar MedicineR印orts2010 (3) 253-259]。本发明联合 GD2、CD56 和 CD45 三种荧光标记抗体作为探针检测脑脊液中的视网膜母细胞瘤细胞，运用多色流式细胞术检测细胞CD45-/CD56+/GD2+的免疫表型来诊断视网膜母细胞瘤细胞脑脊液转移。三种荧光标记抗体均为单克隆抗体。本发明还提供了一种流式细胞技术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑脊液转移的试剂盒，包括探针溶液，以磷酸缓冲液为溶剂，包含G D2-FITC抗体、⑶56-PE抗体和CD45-PerCP 抗体；溶血剂；磷酸缓冲液；阳性标准品。三种荧光标记抗体的浓度比为1:1 :1。所述探针溶液包含防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠。与现有技术相比，本发明的有益效果为本发明的荧光探针能够与脑脊液中的视网膜母细胞特异性结合，能够准确快速通过流式细胞术检测肿瘤细胞是否转移，具有较好的应用前景。
图1为本发明对视网膜母细胞瘤患者脑脊液标本的检测结果图；图2为本发明对视网膜母细胞瘤患者治疗后脑脊液标本的检测结果图；图3为本发明对病毒性脑膜炎患者脑脊液标本的检测结果图；图4为本发明对化脓性脑膜炎患者脑脊液标本的检测结果图；图5为本发明对急性白血病患者脑脊液标本的检测结果图；各图中，A :细胞前散射和侧散射双参数散点图设门(Rl) ；B :显示流式细胞检测这群细胞呈CD56+/CD45-表型(R2) ；C :显示这群细胞呈CD45XD56+/⑶2+表型(R3)。
具体实施例方式实施例1研究对象15例病毒性脑膜炎、19例化脓性脑膜炎、52例急性白血病及21例视网膜母细胞瘤患者的脑脊液标本，脑脊液标本均来自浙江大学医学院附属儿童医院门诊及住院患者。操作步骤ImL脑脊液500G离心沉淀5分钟，弃上清，沉淀物加PBS200 U L，混匀，分别加入单克隆荧光标记抗体(⑶2-FITC，CD56-PE，CD45_PerCP) 20 y L，4°C避光反应30分钟，加入溶血剂lmL，静置5分钟，加PBS5mL，500G离心沉淀5分钟，弃上清，沉淀物加PBS300 u L，混匀，上流式细胞仪检测。流式图像分析策略1、FSC和SSC设Rl门；2、CD56+和CD45-细胞设R2门；3、⑶2+和CD56+细胞设R3门分析；4、计算R3门内的阳性细胞百分率。(R2来源于Rl ；R3来源于R2)。5、以脑脊液出现⑶2+⑶56+⑶45-免疫表型细胞为脑膜转移阳性，同时设立阴性对照。统计方法利用软件SPSS11. 5 (SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)，分析评价诊断方法的敏感性和特异性。各类型标本的检测结果如图1、2、3、4、5所示。结果表明病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎及急性白血病患者脑脊液均未检测到⑶45-/⑶56+/⑶2+免疫表型细胞；3例视网膜母细胞瘤患者手术后6-13个月脑脊液出现CD45-/CD56+/GD2+免疫表型细胞，诊断为视网膜母细胞瘤脑脊液转移，与临床最终综合诊断为视网膜母细胞瘤脑脊液转移结果一致，诊断的敏感性和特异性均为100%。实施例2试剂盒组成I)探针溶液(2mLX I瓶):⑶2-FITC 2mL PBS (含0. 1%叠氮钠)含异硫氰酸荧光素标记的IOOil g抗体蛋白(50 u g/mL) ；CD56-PE :2mLPBS (含0. 1%叠氮钠)含藻红蛋白标记的IOOii g抗体蛋白(50 u g/mL) ；CD45-PerCP 2mL PBS (含0. 1%叠氮钠)含草履虫叶绿素蛋白标记的100 u g抗体蛋白(50 u g/mL);组合物抗体浓度比例⑶2-FITC :⑶56-PE CD45-PerCP 为1:1 :1。2) IOX溶血剂(IOOmLXl瓶):8. 3%氯化铵，含15%多聚甲醛;3) IOX 磷酸盐缓冲液(PBS, pH = 7. 4，1M，含 1%叠氮钠)(IOOmLX I 瓶)；4)阳性标准品(2mLX I瓶)固定和保存液处理的细胞株(5X IO7个细胞/mL)。研究对象鞘内化疗及颅脊柱的放射治疗等综合治疗的2例脑脊液转移患者穿刺脑脊液标本。操作步骤、分析策略和统计方法同上。结果表明2例患者经过8个疗程的鞘内化疗(甲氨蝶呤12. 5mg及地塞米松5mg)及颅脊柱的放射治疗等综合治疗后，穿刺脑脊液再次经本抗体组合流式细胞仪检测，其中一例未发现⑶45-/⑶56+/⑶2+免疫表型细胞，治愈出院。另一例仍然检测到⑶45-/⑶56+/GD2+免疫表型细胞，继续化疗及放疗，脑脊液检测仍持续阳性，最终死亡。表明本发明的荧光探针能够监测视网膜母细胞瘤脑脊液转移的治疗疗效，指导临床合理用药。
权利要求
1.一种流式细胞术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑脊液转移的荧光探针，包括三种荧光标记抗体，其特征在于，所述三种荧光标记抗体为GD2-FITC抗体、CD56-PE抗体和 CD45-PerCP 抗体。
2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，三种荧光标记抗体均为单克隆抗体。
3.一种流式细胞技术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑脊液转移的试剂盒，包括探针溶液，以磷酸缓冲液为溶剂，包含⑶2-FITC抗体、⑶56-PE抗体和⑶45-PerCP抗体；溶血剂；磷酸缓冲液；阳性标准品。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，三种荧光标记抗体的浓度比为1:1 :1。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针溶液包含防腐剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠。
全文摘要
本发明公开了一种流式细胞术诊断和监测视网膜母细胞瘤脑脊液转移的荧光探针，包括三种荧光标记抗体，所述三种荧光标记抗体为GD2-FITC抗体、CD56-PE抗体和CD45-PerCP抗体。本发明的荧光探针能够与脑脊液中的视网膜母细胞特异性结合，能够准确快速通过流式细胞术检测肿瘤细胞是否转移，具有较好的应用前景。
文档编号G01N15/10GK103018459SQ201210520970
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者沈红强, 舒强, 赵正言, 汤永民 申请人:浙江大学