视网膜肌养蛋白转基因及其应用方法

专利名称：视网膜肌养蛋白转基因及其应用方法
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背景技术：
发明领域本发明涉及进行性假肥大性肌营养不良(DMD)。更具体地说，本发明涉及DMD的新模型以及治疗DMD的方法。更具体地说，本发明涉及一种新型转基因、包含该转基因的载体以及将该转基因引入动物DNA以表达肌养蛋白的方法。更具体地说，本发明涉及利用新型转基因进行DMD的体内治疗。
现有技术描述进行性假肥大性肌营养不良(DMD)是男孩最常见的神经肌肉病。这是一种性染色体连锁的隐性遗传病，其特征是进行性的肌肉退化，导致在十多岁时发生重度残疾，在20到30岁的早期到中期发生致命的心功能或呼吸功能衰竭。目前还没有能够延长生命或明显改善该疾病临床进程的方法。标准的治疗方法主要集中在维持患者的总体健康状况以及改善其生活质量上。虽然有多个研究表明糖皮质激素(如强的松龙)可延缓肌肉强度的下降速度，但是其效应维持时间相对较短(28-36个月)，并且无法改变该疾病的临床进程。
肌养蛋白基因的突变导致了肌养蛋白表达的缺失，从而产生了DMD。427kDa的肌养蛋白同种型将膜内在蛋白连接到肌动蛋白骨架上，这被认为可以在肌肉活动时起到稳定肌纤维膜的作用。当缺乏肌养蛋白时，膜丧失了机械稳定性，发生钙流入，最终导致肌纤维坏死。
肌养蛋白是一种多结构域蛋白，由N端肌动蛋白结合结构域、含24个血影蛋白样重复序列的杆状结构域、半胱氨酸富集结构域以及C端结构域组成。后两个结构域与DAP(肌养蛋白相关蛋白)复合体的蛋白质和肌养蛋白结合蛋白结合。肌养蛋白基因79个外显子的另路剪接可产生几种肌养蛋白同种型，范围从71kDa到全长427kDa。至少有7个独立的启动子驱动7种不同肌养蛋白同种型的转录，以细胞特异性的方式表达。
mdx小鼠已被用作人DMD的遗传模型。mdx小鼠在其生命的前6周就会显现出肌营养不良的症状，但是与人DMD不同，其随后的疾病进程是温和的。成年mdx小鼠的四肢肌肉并没有呈现出如人DMD所见的显著衰弱或严重的进行性退化。mdx小鼠的膈膜确实发生与人DMD肌肉一样的变性和坏死，但是小鼠却不会发生呼吸损伤，其寿命也正常。
肌养蛋白相关蛋白(utrn)是能与肌养蛋白相关蛋白相互作用的肌养蛋白的常染色体同源物，它可以补偿mdx小鼠肌肉肌养蛋白的缺乏。肌养蛋白相关蛋白表达水平上升最大的肌肉所表现出的损伤最小。但是，这种补偿替代不会发生在人类身上，这可能可以解释mdx小鼠和人DMD之间的表型差异。
相应的，本领域所需要做的一件事情就是寻找一种人DMD的遗传模型，该模型具有与人DMD一样的表型特征和临床表现。本领域还需要找到表达肌养蛋白或其同源物的基因。本领域还需要包含表达肌养蛋白或其同源物的基因的载体，该载体能够转染动物的基因组，这样肌养蛋白基因或其同源物就可以表达，从而可以补偿肌肉内肌养蛋白的缺乏。还需要的是利用已转染肌养蛋白或其同源物表达DNA的细胞治疗DMD的方法。还需要的是利用表达肌养蛋白或其同源物的基因所表达的游离蛋白质治疗DMD的方法。最后需要的是利用载体治疗DMD的方法，其中载体转染到被感染动物的基因组内，肌养蛋白或其同源物表达，从而补偿肌肉内肌养蛋白的缺乏。
发明概述本发明解决了在先技术所固有的问题，使技术水平有了明显的提高。概括地说，本发明的一个方面包括一种游离的转基因，该基因包含人视网膜肌养蛋白的同种型，被命名为Dp260，以及合适的调节元件。本发明的另一方面提供了将此Dp260转基因引入或插入载体以将基因插入到动物基因组内，从而使其表达视网膜肌养蛋白的方法。优选的，动物选自哺乳动物，更优选的是选自人、小鼠、犬或马，最优选的动物是人。本发明的相关方面提供了含Dp260转基因的动物。在本发明另一方面，Dp260转基因可用于转化骨髓细胞和成肌细胞，用于动物肌营养不良的基因治疗中。优选的动物是哺乳动物。更优选的动物选自小鼠、犬、马或人。在本发明的另一方面，Dp260转基因用于其他合适的载体内，或者结合其他合适的转染方法，如脂质体转染，用于肌营养不良基因治疗的其他方法中。在本发明的另一方面，将Dp260所表达的蛋白质给予需要的动物。
本发明的一个实施方式构建自人Dp260的DNA序列。人Dp260是肌养蛋白的同种型，由肌养蛋白基因独特的第一外显子R1与外显子30经过另路剪接而产生。人视网膜肌养蛋白包含肌养蛋白所具有的半胱氨酸富含结构域、C端和大部分杆状结构域，但缺乏肌养蛋白的N端肌动蛋白结合结构域。另外，次级肌动蛋白结合结构域位于人Dp260的血影蛋白重复序列内。人Dp260在视网膜内正常表达，与肌动蛋白和肌养蛋白相关蛋白共同定位。它还具有肌养蛋白的许多功能。在这个实施方式中，转基因构建自人视网膜肌养蛋白和合适的调节元件。合适的人Dp260序列可来源于ATCC克隆57670、57672、57674和57676，可通过本领域熟知的技术直接克隆到质粒内。为了实现本发明，用于转基因中的优选DNA序列具有与人Dp260相同的功能，更优选的是，转基因的Dp260部分的DNA序列与人Dp260有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、再优选至少95％、再优选至少97％、最优选的是99-100％的序列相同性。本发明的转基因序列还可以是肌养蛋白经过另路剪接而形成的同种型。可用于实现本发明的肌养蛋白的一种另路剪接形式包含肌养蛋白的外显子71。在优选的形式中，最终的转基因还包含位于Dp260序列上游的启动子和增强子序列，这些序列可促进转基因的表达。优选的调节元件包括小鼠肌肉肌酸激酶(MCK)启动子和增强子，以及作为调节元件的小鼠MCK外显子1和2。转基因表达可通过将转基因稳定转染到细胞系内，然后分析蛋白产物的序列来检测。剪接中出现的错误可通过常规的定点突变技术加以修复以提高正确剪接位点的外显子受体得分。在其他优选的形式中，转基因还含有其他的调节位点以确保所得到的转录子具有适宜的稳定性。一种这样的调节位点是添加到构建物3’末端的牛生长激素(BGH)poly A信号序列，该序列可确保进行适当的多聚腺苷酸化。
在其他实施方式中，本发明包括含在适合转染其他细胞的载体内的Dp260转基因及其上述的相关调节元件。这种载体优选包含表达蛋白质的DNA序列，该蛋白质具有与肌养蛋白相似的功能。优选的是，用于这种载体内的DNA序列与人Dp260有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％、95％、97％，最优选的是99-100％的序列相同性。在某些优选形式中，载体还包含一种形式的人Dp260，该序列包含人肌养蛋白的外显子71。在更优选的形式中，载体还包含如上所述调节元件，如启动子、增强子和poly A信号位点。该载体可以是各种市售质粒、腺病毒或慢病毒。
在其他实施方式中，本发明包括被Dp260转基因转染的动物。在优选的形式中，转染所用的Dp260表达与肌养蛋白具有类似功能的蛋白质，优选的Dp260是人Dp260。这种动物的基因组应当包含至少一个DNA序列的拷贝，所述序列与人Dp260有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％、95％、97％，最优选的是99-100％的序列相同性。在某些形式中，所述动物在其基因组内含有至少一个包含肌养蛋白外显子71的Dp260序列的拷贝。优选的动物是哺乳动物，更优选的动物来自于人、小鼠、马或犬。
在本发明的其他实施方式中，Dp260转基因通过显微注射过程被插入动物的基因组内，显微注射过程包括通过限制性内切酶消化将转基因从其质粒上切下并直接注射到动物的卵母细胞内。基因组内已掺入有转基因的动物可通过适宜的常规方法鉴定，其中包括测序和PCR反应。优选的是，这些动物在其肌肉细胞内表达Dp260，这是一个可通过常规技术如PCR和western印迹来检测的特性。可从这种实施方式获益的动物包括人、小鼠、犬和马。在本实施方式的一个实施例中，优选将人Dp260转基因插入到双突变(DM)小鼠的基因组内，其过程为将Dp260转基因注射到DM小鼠的卵母细胞内，然后与mdx和肌养蛋白相关蛋白敲除小鼠进行一系列杂交。当然，小鼠也可通过其他任何的常规方法转染，其中包括通过使用其他载体如腺病毒或慢病毒，以及裸DNA电穿孔。未转化的DM小鼠所表现出的生理症状与人的肌营养不良相似，即不会产生肌养蛋白，也不会产生肌养蛋白的鼠类似物肌养蛋白相关蛋白。另外，DM小鼠出现严重的表型，寿命缩短，其肌肉发生高度的坏死，在其老化时出现复合性重复放电(CRD，complex repetitive discharge)升高的迹象，这是肌营养不良的标志。相反，表达Dp260转基因的DM小鼠(DM/Tg+)只表现出轻微的肌病症状，其寿命也正常。另外，DM/Tg+小鼠未发生DM小鼠所见的严重脊柱弯曲(驼背)或四肢肌无力。这些小鼠在老化时所发生坏死水平也较低，CRD的迹象也不明显。由于DM小鼠与人DMD患者之间的相似性，因此，DM小鼠可能是该疾病的理想模型。
在本发明的另外一个实施方式中，Dp260转基因被用于稳定转染从小鼠、犬、马和人分离的细胞。这可通过使用引入可选标记(即新霉素抗性)的慢病毒载体来实现。优选的转染细胞是成肌细胞，因为这种细胞可分化成肌细胞。更优选的转染细胞是骨髓细胞，更优选的转染细胞是骨髓细胞边缘群(side population bone marrow cell)，最优选的转染细胞是带有Lin-、Sca+和Kit+细胞表面标记的边缘细胞群。这些转染细胞可通过已知的方法如荧光激活细胞分类术(FACS)来鉴定。还可以通过其排出Hoechst染料的能力对其进一步鉴定。另外，这些转染细胞分化成肌细胞的可能性升高。转化这些细胞的方法包括使用载体，如质粒、腺病毒、慢病毒，更优选的是裸DNA电穿孔。Dp260的稳定表达可通过PCR或western印迹试验来检测。
在本发明的另外一个实施方式中，提供了通过基因治疗为动物提供Dp260的方法。优选的动物是哺乳动物，更优选的动物来自于人、小鼠、犬或马。这种治疗的目的在于缓和肌营养不良的症状。在本实施方式的一个优选形式中，从患者体内取出细胞，用转基因稳定转染细胞，其中的转基因优选包含与人Dp260有至少80％，优选至少85％，更优选的是至少90％、95％、97％，最优选的是99-100％序列相同性的DNA序列。在该方法的某些优选形式中，这种细胞用包含一种形式的Dp260的DNA序列转染，该种形式的Dp260包含人肌养蛋白的外显子71。本发明的优选转基因还包含用于稳定表达Dp260的合适调节元件。优选地，被转染的细胞是成肌细胞或骨髓细胞。更优选的是，这些细胞是上述具有上述细胞表面标记的骨髓细胞边缘群，这种细胞尤其可能分化成肌细胞。最优选的是，这些细胞取自接受治疗的患者，在体外用Dp260转基因转染，然后在自体移植过程中将其回植到某些患者体内。这种自体移植可降低发生免疫反应的可能性，还可以进一步减少免疫抑制的需要，因为转染细胞是患者自身的。转染细胞的自体骨髓移植可在疾病过程的任何时间点使用。骨髓细胞可更强地吸附到损伤较重的细胞上，因此使这种方法更适合于长期患有肌营养不良的老年患者。另外，这个过程可在患者的一生中多次进行，因为这种自体骨髓移植的效应是累加的，因此可提高健康的有功能的肌肉的数量。
重要的是，本发明从免疫学意义上来讲是有优势的。一般而言，所有类型的基因治疗的障碍都是转基因产物的免疫原性。全长的肌养蛋白可诱导免疫反应，导致转基因表达失灵(1)。Dp260转基因的独特特性在于其表达人肌养蛋白的天然同种型。Dp260蛋白主要在视网膜表达，在其他组织只有少量表达。因此，视网膜肌养蛋白是一种天然同种型。转基因来源的Dp260的引入不会在患者体内诱导免疫反应，尤其是其缺失了上游的外显子30，这也不会影响Dp260的表达。这与全长的肌养蛋白转基因以及大部分血影蛋白结构域编码区已被去除或切掉的微肌养蛋白(micro-dystrophin)转基因相比具有明显的优势，其中的。微肌养蛋白也具有诱导免疫反应的能力，因为这个蛋白可能被认为是新抗原(微肌养蛋白包含对于进行性假肥大性肌营养不良患者来说是外源蛋白的序列)。本发明的Dp260转基因克服了这个阻止成功地进行基因治疗的重要障碍。
如本文所述，下列术语将被使用如其在本领域所熟知的那样，“序列相同性”是指两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，即，参考序列和与参考序列进行比较的给定序列。序列相同性可通过将给定序列与参考序列进行比较而定，序列可以排列在一起以产生最大程度的序列相似性，如通过这种序列串之间的匹配来确定。排列以后，根据位置对位置来确定序列相同性，如，如果在某位置上核苷酸残基或氨基酸残基是一样的，那么在该位置上的序列就是“一致的”。这种位置一致的总数除以参考序列的核苷酸或残基总数就得到了百分序列相同性。序列相同性可通过已知的方法很容易地确定，其中包括而不限于下列文献中所描述的方法《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.N编，OxfordUniversity Press，纽约(1988)；《生物计算信息学与基因组计划》(BiocomputingInformatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，Academic Press，纽约(1993)；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence Data)，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西(1994)；《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M.StocktonPress，纽约(1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)，其教义本文已纳入作为参考。确定序列相同性的优选方法可以给出两个被检测序列之间的最大匹配值。确定序列相同性的方法已被编入公用计算机程序中，这种程序可用于分析给定序列之间的序列相同性。这种程序的例子包括而不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)，BLASTX程序可从NCBI或其他地方免费获得(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCVINLMNIHBethesda，MD 20894，Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol，215403-410(1990)，其教义本文已纳入作为参考)。这些程序还可以利用默认的间隙权重来排列序列以得到给定序列与参考序列之间最高水平的序列相同性。作为说明，如果一个多核苷酸所具有的核苷酸序列与参考核苷酸序列有至少，例如，95％的“序列相同性”，那么，这就意味着给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的，除非每100参考核苷酸序列的核苷酸中给定的多核苷酸序列包含的点突变达到5个。换言之，相对于参考核苷酸序列来说一个多核苷酸所具有的核苷酸序列至少有95％的序列相同性，参考序列中有高达5％的核苷酸是缺失的或被其他核苷酸替换，或者占参考序列总核苷酸数高达5％的核苷酸被插入到参考序列内。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端，或者两端之间的任何位置上，单独地分散在参考序列的核苷酸之间，或者以一个或几个连续核苷酸组的形式分散在参考序列内。同样，如果一个多肽所具有的给定氨基酸序列与参考氨基酸序列有至少，例如，95％的序列相同性，那么，这就意味着多肽的给定氨基酸序列与参考序列是一致的，除非每100参考氨基酸序列的氨基酸中给定的多肽序列包含高达5个的氨基酸改变。换言之，为了获得与参考氨基酸序列至少有95％序列相同性的给定多肽序列，参考序列中有高达5％的氨基酸残基是缺失的或被其他氨基酸替换，或者占参考序列总氨基酸数高达5％的氨基酸被插入到参考序列内。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基端或羧基端，或者两端之间的任何位置上，单独地分散在参考序列的残基之间，或者以一个或几个连续氨基酸组的形式分散在参考序列内。优选的是，不一致的残基位置由保守的氨基酸残基替代来区分。但是，在确定序列相同性时保守替代不计为相匹配。还应当理解的是，因密码子的简并性，编码特定蛋白的DNA可以在核苷酸序列上有区别，但是却表达或编码同一个蛋白质。DNA编码的这种微小改变可以很容易地被本领域的技术人员所理解，也包括在本发明的范围之内。
本文所用的术语“转染”是指核酸通过核酸介导的基因转移引入，例如通过表达载体，到受体细胞内。本文所用的“转化”是指一个过程，其中细胞的表型因细胞摄取了外源DNA或RNA而改变，例如，转化细胞表达重组形式的肌养蛋白，或者在转移基因反义表达的情况下天然形式的肌养蛋白的表达被阻断。
本文所用的术语“转基因”是指核苷酸序列(编码，如，肌养蛋白或其反义转录子)，该序列对于转基因动物或被引入的细胞来说是部分或完全异源的，即外源的，或者对于转基因动物或被引入的细胞的内源性基因来说是同源的，但是被设计成可插入到动物的基因组内，其插入方式可导致被插入的细胞的基因组发生改变(如，插入到与天然基因所处位置不同的位置上，或者其插入导致了基因敲除)。转基因可包含一个或多个调节序列以及所选核酸达到最佳表达所需的其他任何核酸，如内含子。
术语“载体”是指能运送与之相连的其他核酸的核酸分子。优选的载体是那些能自我复制并能表达其相连核酸的载体。
“转基因”动物是包含带遗传信息的细胞的任何动物，其中的遗传信息是在亚细胞水平通过精细的基因操作，如显微注射或重组病毒感染或裸DNA电穿孔，直接或间接接受的。在本文中“转基因的”并不包括经典的杂交或体外受精，但是却代表有一个或多个细胞接受了重组DNA分子的动物。虽然最优选的是该分子能整合到动物的染色体内，但是本发明也包括使用染色体外复制的DNA序列，例如，可以插入到酵母人工染色体内。本发明的优选转基因动物包括“生殖细胞系转基因动物”，这是指已经摄取了遗传信息并掺入到生殖细胞内，因而能够将遗传信息传给子代的动物。事实上，如果这种子代拥有这些信息的一部分或全部，那么它们也是转基因动物。
本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)，以及某些情况下的核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解为包含由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物，以及如本文所描述的实施方式所用的单链(正义或反义)或双链多核苷酸。
术语“稳定转染”或“稳定转染的”是指外源DNA引入并整合到转染细胞的基因组内。术语“稳定转染子”是指基因组DNA内稳定整合了外源DNA的细胞。
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图1是人Dp260转基因构建物的示意图，图中指示出了构建转基因所用的所有限制性酶切位点；图2a是转染Dp260转基因构建物的成肌细胞与只转染MCK质粒的成肌细胞的western印迹凝胶分析图谱；图2b是DM/Tg+和DM小鼠后肢肌肉的western印迹凝胶分析图谱；图3a是8周龄DM/Tg+小鼠比目鱼肌横截面的照片，该标本用肌养蛋白C端特异性的单克隆抗体进行免疫标记并用Alexa-488偶联的第二抗体检测；图3b是8周龄DM小鼠比目鱼肌横截面的照片，该标本用肌养蛋白C端特异性的单克隆抗体进行免疫标记并用Alexa-488偶联的第二抗体检测；图3c是16周龄DM/Tg+小鼠比目鱼肌横截面的照片，该标本用肌养蛋白C端特异性的单克隆抗体进行免疫标记并用Alexa-488偶联的第二抗体检测；图4a是DM/Tg+和DM小鼠的扫描及相对大小照片；图4b是DM/Tg+小鼠的X射线影像，其中脊柱弯曲通过测角分析方法测定；图4c是DM小鼠的X射线影像，其中脊柱弯曲通过测角分析方法测定；图4d是DM/Tg+小鼠的核磁共振成像(MRI)研究；图4e是DM小鼠的MRI研究；图4f是正常对照小鼠的MRI研究；图5a是DM/Tg+小鼠的肌电描记术(EMG)轨迹；图5b是DM小鼠的EMG轨迹；图5c是MD和DM/Tg+小鼠老化时腹肌四分体所展现的复合性重复放电(CRD)平均数的图；图5d是显示MD和DM/Tg+小鼠老化时CRD的总平均数；图6a是8周龄DM/Tg+小鼠比目鱼肌甲苯胺蓝染色的横截面图；图6b是8周龄DM小鼠比目鱼肌甲苯胺蓝染色的横截面图；图6c是8周龄野生型小鼠比目鱼肌甲苯胺蓝染色的横截面图；图7a是定量描述DM和DM/Tg+小鼠趾长伸肌坏死面积百分数与鼠龄之间关系的图；图7b是定量描述DM和DM/Tg+小鼠比目鱼肌坏死面积百分数与鼠龄之间关系的图；图8a是定量描述DM和DM/Tg+小鼠趾长伸肌中出现中央集中核的肌纤维的百分数与鼠龄之间关系的图；图8b是定量描述DM和DM/Tg+小鼠比目鱼肌中出现中央集中核的肌纤维的百分数与鼠龄之间关系的图；图9是利用反作用力测定板活动度测量计测定的DM、DM/Tg+、成年mdx和成年C57BL/6J小鼠运动活力的条形图，其中每个误差棒的托架代表±1平均值的标准差，水平虚线代表DM/Tg+小鼠三个运动活力期间的95％置信区间；以及
图10描述的是Dp260转基因，其中标注了所有的限制性酶切位点和感兴趣的区域。
优选实施方式的详细描述下面的实施例阐述了与本发明有关的优选方法。但是应当理解的是，这些实施例只是以说明的方式来提供的，不应该被看作是对本发明整体范围的限制。
实施例1人Dp260转基因构建物的制备和分析小鼠肌肉肌酸激酶(MCK)启动子和增强子(SEQ ID NO1)与MCK外显子1(SEQIDNO2)、内含子1(SEQ IDNO3)及外显子2的一部分(SEQ ID NO4)，包含外显子2的5’非翻译区，用于组成最终的转基因。MCK的调节元件及其第一外显子和第一内含子的一部分(SEQ ID NO5)被直接克隆到pBluescript II SK载体(Stratagene，LaJolla，CA)内。通过PCR扩增出由MCK内含子1和外显子2的其余部分直到MCK ATG起始密码子(SEQ ID NO6)组成的第一PCR扩增子，得到NdeI限制性酶切位点。这个位点可用于将该片段连接到人基因组PCR扩增子的NdeI位点上。第二PCR扩增子起始于视网膜肌养蛋白独特的第一外显子R1的ATG起始密码子，接着是内含子R1，终止于外显子30(SEQ ID NO7)，该片段被插入到正确的位置上，这样MCK起始密码子就能够正常定位。第二PCR扩增子(SEQ ID NO7)还包含一个人工的FspI位点。第三PCR产物是用人肌养蛋白cDNA克隆cDMD 4-5a(ATCC No57670)扩增的。这个产物被设计成在其5’端带有FspI位点，在其3’端有天然的AatII位点，该产物被添加到构建物内。利用天然的限制性酶切位点将三个人肌养蛋白cDNA克隆cDMD 5b、8和9-14(ATCC Nos.57672、57674和57676)连接到构建物上构建出人肌养蛋白编码序列的其余部分。将牛生长激素(BGH)poly A信号序列(SEQ ID NO8)(Invitrogen，Carlsbad，CA)添加到构建物的3’末端以保证转录子的足够稳定性和正确腺苷酸化。这个信号序列是利用Incitrogen.com网站的pCDNA 3.1 Hygro质粒引物从PCR产物中得到的。本文所包括的引物序列分别为SEQ ID NOS21和22。SEQ IDNO21包含BGH-Afl上的AflIII限制性酶切位点，是下游引物。SEQ ID NO22包含BGH-Not上的NotI限制性酶切位点，是上游引物。这样就产生了如
图1所示的构建物(SEQ ID NO9)，其中包含所示构建所需的所有限制性酶切位点。
ABI377自动化测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)用于确定Dp260转基因(SEQ ID NO10)整个编码区的序列准确性。发现了两个保留野生型氨基酸序列的沉默突变。序列中还有两个其他突变，根据厂家的使用说明书(Quick Change SiteDirected Mutagenesis Kit，Stratagene)通过定点突变技术可以将其恢复。测序还发现构建物缺少外显子71(SEQ ID NO11)。这是人和小鼠基因内正常剪接变体的结果，血影蛋白结合位点位于该外显子的下游。根据Jaynes等，Mol.Cell.Biol.62855-2865(1986)所述的方法，通过稳定转染MM14成肌细胞系(Hauschka，University ofWashington)，这是一个分化的肌细胞系，来检测人Dp260转基因转录子及其蛋白产物的表达，其教义和内容本文已纳入作为参考。
在将转基因稳定转染入MM14成肌细胞系内以后，通过cDNA PCR产物分析和测序发现大部分转基因mRNA都是从MCK外显子1剪切下来直接连接到肌养蛋白外显子30上，其中缺失了MCK外显子2/外显子R1节段(SEQ ID NO12)。通过信息内容分析发现，与MCK外显子2受体弱得多的6.2位(bit)得分相比，较强的外显子30受体位点得分达到12.1位。MCK内含子1的3’区的三个核苷酸通过定点突变(Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit，Stratagene)加以改变，可以将外显子2受体的位得分增加到12.4位，使其成为较强的剪接受体位点。随后的转染试验证明了RNA产物的正确剪接。在SEQ ID NO5的位置6363、6364和6368上发现了突变的核苷酸(在
图10中用星号标记)，所有的突变都是从“g”到“t”。利用转染的成肌细胞的蛋白制备物通过western印迹试验分析表达的蛋白质(SEQ ID NO13)。western印迹试验结果表明，与Dp427相比，Dp260蛋白在转染细胞内有很高的表达(图2a)。用不含插入片段的MCK质粒进行对照转染，结果表明没有Dp260蛋白的表达，但是却有Dp427肌肉肌养蛋白的表达。
实施例2DM人Dp260转基因小鼠的制备用Endo Free Plasmid Kit(Quiagen，Valencia，CA)提取人Dp260转基因构建物，在卵母细胞注射前用NotI限制性内切酶消化，从质粒载体上切下转基因构建物。将构建物注射到200个卵子内，然后植入到假孕的母体内，分娩，断奶。通过Dp260转基因的基因分型鉴定出了两个包含人Dp260转基因的小鼠。基因分型是利用MCK特异性的正向引物(SEQ ID NO14)和肌养蛋白人外显子30特异性的反向引物(SEQID NO15)通过PCR反应完成的，这两个引物可扩增出小于400bp的转基因特异性的产物(SEQ ID NO16)。两只小鼠都有高水平的转基因表达，其区别可能在于插入片段在基因组内的位置以及插入到小鼠基因组内的转基因的拷贝数。因此，被鉴定为含有TgN(DMD260)1Raw转基因的转基因小鼠被描述为Tg+动物。
根据肌养蛋白相关蛋白基因的外显子64上是否存在插入的新霉素(neo)抗性基因通过PCR反应来鉴定肌养蛋白相关蛋白敲除utrn-/-小鼠(Stephen Hauschka，Universityof Washington)。利用来自插入的neo基因(SEQ ID NO18)和肌养蛋白相关蛋白基因(SEQ ID NO19)外显子64的3’末端()的引物来制备312bp的扩增子(SEQ ID NO17)。利用另外一个5’末端的正向引物(SEQ ID NO20)来鉴定野生型的等位基因，在utrn敲除小鼠中该基因缺失。通过与C57BL/6J回交10代以上来制备utrn敲除小鼠和Tg+小鼠的同系C57BL/6J小鼠。
带转基因和不带转基因的DM(utrn-/-，mdx)雄性小鼠是通过utrn敲除小鼠、Tg+小鼠和mdx小鼠的一系列交配来制备的(得自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。按照以前Amalfitano & Chamberlain在Muscle & Nerve 191549-1553(1996)中所描述的ARMS PCR方法来鉴定携带mdx突变的小鼠。mdx雌鼠与utrn-/-雄鼠首先交配，产生的雌鼠随后与Dp260 Tg+雄鼠交配。这样就得到雌性携带者(Xmdx、X+、utrn-/-、Tg+)，与纯合的utrn-/-雄鼠交配得到含有和不含有Dp260转基因的DM(XmdxY、utrn-/-)雄鼠。这些交配得到48只DM小鼠和48只DM/Tg+小鼠。
实施例3Western印迹收获稳定转染人MCK/Dp260Tg或单独MCK质粒的分化的MM14成肌细胞培养物。用Dounce匀浆器在1mL匀浆缓冲液(50mM Tris pH8，150mM NaCl，1mMEDTA，0.04mg/mL抑酞酶，0.0025mg/mL胃酶抑素A，0.025亮肽酶素，1mM苯甲基磺酰氟化物，0.1％Triton X100)中匀浆，从而从3百万个细胞中提取蛋白质。从DM/Tg+和DM小鼠的后肢取肌肉组织(100mg)。组织冷冻后在1mL匀浆缓冲液中用冰研钵和研棒匀浆。匀浆物在4℃以13,000rpm离心10分钟，以沉淀细胞碎片。
将4×载样缓冲液(Invitrogen)加到上清中，蛋白在70℃加热变性10分钟。利用NuPAGE Tris-醋酸盐SDS凝胶系统(Invitrogen)在4-8％丙烯酰胺凝胶上分析24μL样品。在Novex室(Invitrogen)内将蛋白质转移到Hybond-C超级膜(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)上。膜在含4％奶粉的Tris-NaCl-Tween缓冲液(TNT)内4℃封闭过夜以防止非特异性的结合。随后膜与第一抗体在室温下共孵育2小时。对于成肌细胞的western印迹来说，第一抗体(VIA4-2 A3，Upstate Biotechnology，LakePlacid；NY)是针对肌养蛋白羧基端最后17个氨基酸的小鼠单克隆IgM。对四肢肌肉的western印迹来说，第一抗体是肌养蛋白C端特异性IgG(MANDRA-I，Sigma)。
对于成肌细胞制备物来说，膜用TNT缓冲液洗涤数次。加入第二抗体(抗小鼠IgM，过氧化物酶偶联的，Sigma)，在室温下孵育1小时或4℃过夜。再次洗涤之后将膜放入ECL(增强的化学发光)检测液(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)中，随后暴露于x射线胶片。对于后肢肌肉的western印迹来说，使用抗小鼠IgG碱性磷酸酶偶联物(Sigma)和BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化四唑氮蓝)试剂盒(KPL，Gaithersburg，MD)比色显影肌养蛋白条带。
小鼠后肢肌肉的western印迹试验结果表明DM/Tg+小鼠有很强的Dp260表达，而DM小鼠后肢肌肉的western印迹分析却显示没有Dp260的表达。
实施例4免疫细胞化学和组织学研究将刚刚处死的动物的后肢取下，剥去皮后浸入含2％多聚甲醛的磷酸缓冲盐水，pH7.4(PBS)中，浸泡4到6小时。从一个后肢上取下比目鱼肌和趾长伸肌(EDL)，切开后在4℃固定24到48小时，然后用石蜡包埋。然后将其切片，按照标准的组织学方法用甲苯胺蓝染色。对侧肢的肌肉剪成1-2mm3的小块，按照Tokuyasu在HistochemJ.21163-171(1989)中描述的方法在蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮的混合物内冷冻保存，在液氮中快速冷冻。用带FCS附件的Reichert Ultracut S切片机将其切成1.5μL厚的横向切片。
冷冻切片用含0.2％明胶和0.5％脱脂奶粉的TBS(50mM Tris，150mM NaCl，0.001％NaN3，pH7.6)于4℃封闭过夜。切片用TBS在室温下洗涤5分钟，然后在用封闭液稀释的第一抗体中孵育90分钟。所使用的抗体是1∶25稀释的C末端特异性肌养蛋白单克隆抗体(MANDRA-I)(Sigma)或1∶200稀释的兔多克隆抗层粘连蛋白抗体(Sigma)。切片用PBS漂洗两次，每次5分钟，然后在含5％羊血清的TBS中封闭30分钟，再用TBS漂洗两次。与Alexa-488偶联的种特异性第二抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)共孵育60分钟，然后漂洗，安装好后观察。层粘连蛋白标记的载玻片用0.2mg/mL碘化丙啶复染10分钟以使核染色，然后漂洗并安装好。用配备有CCD照相机的Olympus BX-50落射荧光显微镜拍照。
在定量分析组织学切片时，利用公用软件NIH Image程序在Macintosh计算机上将横截面数字化。数值表达为肌肉横截面总面积内坏死/再生之百分比。带非外周核的肌纤维所占的百分比利用碘化丙啶和抗层粘连蛋白抗体标记的冷冻切片的数字图形来确定。利用斯氏t-检验分析平均值之间的差异。
免疫细胞化学分析结果表明，在Dp260，Tg+小鼠中，Dp260蛋白定位在肌纤维膜上。DM小鼠无肌养蛋白表达，因此看不到蛋白的定位(图3b)。在8周龄的DM/Tg+小鼠中，细胞与细胞之间的荧光强度是不同的，如图3a所示，但是在16周时，表现得更均匀且定位在细胞膜上，如图3c所示。
在肌肉的组织学分析中，无Dp260的DM小鼠(图6b)呈现出了大面积的肌纤维变性、纤维化，以及被巨噬细胞浸润，这说明肌肉组织有大量坏死和炎症。这一病理学特征在DM/Tg+小鼠中并未因为Dp260转基因的表达而完全消失，但是与DM小鼠所见的相比，影响面积更局域化，而且更有限。DM/Tg+小鼠比目鱼肌的表现很接近于野生型且年龄相对应的对照动物的比目鱼肌的形态学(图6c)。定量分析表明两种类型的动物坏死面积所占的百分比都随着年龄的增长而降低，但是到16周时，DM/Tg+小鼠的EDL和比目鱼肌中几乎没有坏死，而DM小鼠却逐渐有更多肌肉坏死，直到死亡。带有中心局域化核的肌纤维所占的百分比是骨骼肌慢性退化和再生的标志。在DM小鼠和DM/Tg+小鼠中该数值都随着年龄的增加而增加，但是对于比目鱼肌和EDL肌来说，DM/Tg+小鼠的平均值明显低于与其年龄相对应的对照小鼠的平均值。
实施例5磁共振成像(MRI)和放射照相术利用小鼠体积线圈(volume coil)和自旋回波成像序列在水平镗孔9.4Varian系统上进行DM和DM/Tg+小鼠的矢状MRI()，所用的参数如下TR/TE＝2000/14ms；视场角＝60×30mm；图象矩阵＝256×256像素；层面厚度＝1mm；平均次数＝2。MRI结果显示，DM小鼠所见的严重损伤(图4e)未在DM/Tg+小鼠中出现(图4d)。通过MRI发现，与野生型动物相比，DM小鼠的椎旁肌束和心肌膜厚度都有明显的下降(图4f)。MRI的结果显示，DM/Tg+动物的这些特征与野生型动物无明显区别。DM/Tg+小鼠的心肌厚度好像比DM小鼠要厚，与正常的对照小鼠更加一致。
四足动物的脊柱后凸与DMD所见的脊柱侧弯类似，是严重肌营养不良DM小鼠的一个特征。利用标志方法对3只DM小鼠和3只DM/Tg+小鼠进行放射影像学检查，结果发现人Dp260的表达对DM小鼠的脊柱后凸有影响。图4b所示的X射线影像显示DM小鼠的脊柱严重弯曲，通过侧角分析发现其曲率达到120°，与此相比，DM/Tg+小鼠的脊柱曲率为56°，如图4c所示，与正常小鼠相似。
实施例6肌电图描记术(EMG)试验利用以前由Carter等在Am.J.Phys.Med.Rehabil.712-5(1992)中以及Dumitru在《电诊断医学》(Electrodiagnostic Medicine)(第二版)26-27页中所描述的方法记录DM/Tg+小鼠和DM小鼠四肢肌肉对插入的针状电极的肌电图描记反应。使用Neuromax EMG系统(XL Tek，安大略，加拿大)在胫骨前肌上进行EMG试验。设定都是标准化的，阶式滤波器和自适应滤波器都在60Hz，低频滤波器在30Hz，高频滤波器在10,000Hz，增益在200mv/分部(division)，时间基线在10ms/分部，负激发斜率。接地电极和参比电极都是皮下放置的EEG皮下记录针(Nicolet019-409700，Nicolet Biomedical，Madison，WI)，这是一种具有0.25mm2记录表面的单极针状电极(TECA Corp.，安大略，加拿大)。所有小鼠都用0.6mg/g体重的阿佛丁(三溴乙醇，Sigma)麻醉。记录每个EMG试验的体重。
EMG试验中存在CRD则说明肌膜不稳定，肌肉出现病变。为了记录CRD，将肌腹分成相等的四分体，在四周的期间内记录有多少四分体出现CRD，以及总共有多少CRD(具有插入活性)。在四个方向上记录EMG活动，针从中心向外放射状插入约0.5mm。每个四分体插四个，试验动物的侧卧方向每四周改变一次，以使人为的损伤降到最低。有CRD的四分体记录为0到4，CRD总数记录为0到16。
肌电图描记术可直接评价DM小鼠和DM/Tg+小鼠肌膜的稳定性和肌肉出现的病变。较老的DM/Tg+小鼠表现出正常的EMG模式，每个运动单位都有放电(图5a)。DM小鼠所呈现的CRD模式显示出异常的肌营养不良病变。CRD常见于与肌肉去神经和肌病相关的神经疾病。收集两组小鼠随时间变化的电生理反应，其结果与其临床表现相关。在四周龄的小鼠中，有CRD的四分体的数量或者CRD的总发生率在DM和DM/Tg+组的小鼠之间无显著性差异(图5c和5d)。当小鼠老化时，DM小鼠出现了更多的有CRD的四分体，以及更高的CRD总数，而DM/Tg+小鼠相对较少(图5c和5d)。在第8周时，有CRD的四分体数量(p＝0.002)(图5c)以及有CRD的四分体总数(p＜0.001)(图5c)都有明显的差异。DM小鼠的所有4个四分体中都出现了CRD，而DM/Tg+小鼠中发生CRD的四分体数较少。DM小鼠在8到12周之间死亡，而DM/Tg+小鼠是存活的，一直被研究到24周。这些EMG试验表明有CRD的四分体数量以及CRD总数都下降到轻微肌病的典型水平。
实施例7活动度研究在一个反作用力测量板活动度测量计(得自Steve Fowler)上记录活动能力的数据。反作用力测量板活动度测量计上所使用的传感区面积为12cm×12cm。空间分辨率为1mm，时间分辨率为0.02s。小鼠在用精细砂纸粗糙的丙烯酸塑料表面上运动，记录持续时间为15分钟，在黑暗且隔音的房间内进行。Steve Fowler所编写的软件用于记录和分析数据，通过寻找DM/Tg+小鼠的平均95％置信区间来分析这些数据。
反作用力测量板活动度测量计通过测量小鼠的活动距离来测定其活动度。在第6周时，DM小鼠的运动少于DM/Tg+小鼠(图9)，DM组的数据刚好落在95％置信区间之外，t检验表明有边缘显著性(p＝0.07)。在第10周时，与DM/Tg+小鼠相比，DM明显受到损伤(p＝0.002)。DM/Tg+小鼠的运动水平与未处理的mdx小鼠以及C57BL/6J对照小鼠相似，落在DM/Tg+小鼠的95％置信区间之内。DM/Tg+的活动正常，一般健康状况良好，未表现出运动能力下降、畸形、步态蹒跚、活动受限、肢体僵硬等DM小鼠的典型症状。
实施例8DM/Tg+小鼠的严重肌营养不良表型的减轻DM小鼠所见的严重肌营养不良表型在DM/Tg+小鼠中有明显改善，DM/Tg+小鼠的生长正常，寿命比DM小鼠长。DM小鼠体型缩小，而DM/Tg+小鼠生长正常(图4a)。通过测定体重来评价临床健康状况，因为体重与肌肉重量和强度相关。在第四周时，DM/Tg+小鼠的平均体重[18.1±0.7g(n＝14)]明显高于(p＝0.001)DM小鼠的平均体重[14.1±.6g(n＝7)]。到第8周时，DM/Tg+小鼠生长到26.9±0.7g(n＝12)，16周时生长到30.8±1.2g(n＝6)。到第8周时，DM小鼠只生长到17.9±1.3g，并且在不久后死亡。
总之，DM/Tg+小鼠的体重增长到与年龄相关的正常水平，而DM小鼠的体重增长缓慢，过早死亡。参加寿命研究的所有28只DM/Tg+小鼠的寿命都长于30只DM小鼠的平均死亡年龄(2.9±0.3月)。23只DM/Tg+小鼠的寿命超过了6个月，其中只有6只死亡。对于试验小鼠来说，这个21％的损耗率是正常的。7只DM/Tg+小鼠的寿命达到1年或更长。
实施例9通过细胞提取、转染和输入治疗DMD从小鼠、犬、马和人体内取出细胞，利用上述的常规方法用编码视网膜肌养蛋白的遗传插入片段稳定转染这些细胞。然后将稳定转染的细胞施用于动物以减缓至少一种DMD临床症状的严重程度。优选的，细胞的提取自并给予同一个动物，如自体移植所发生的那样。这个过程可在动物的整个生命周期中根据需要重复进行。更具体地说，分离骨髓细胞，在能维持干细胞可塑性的条件下培养这些细胞，然后用含Dp260转基因的慢病毒转染细胞，其中的慢病毒包含筛选标记基因，即新霉素抗性基因。另外，电穿孔可作为引入转基因的方法用于转染骨髓细胞。这可与筛选遗传标记一起共转染含新霉素抗性基因的第二质粒。用新霉素筛选细胞以后就可以将细胞植入到受体体内。
序列表<110>儿童慈善医院(CHILDREN’S MERCY HOSPITAL)R.怀特(WHITE，ROBERT)R.加伊迪克(GAEDIGK，ROGER)K.菲茨杰拉德—古斯塔夫松(FITZGERALD-GUSTAFSON，KATHLEEN)<120>视网膜肌养蛋白转基因及其应用方法<130>34444<160>22<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3350<212>DNA<213>鼠(Murinae gen.sp.)<400>1ccatcctggt ctatagagag agttccagaa cagccagggc tacagataaa cccatctgga60aaaacaaagt tgaatgaccc aagaggggtt ctcagagggt ggcgtgtgct ccctggcaag 120cctatgacat ggccggggcc tgcctctctc tgcctctgac cctcagtggc tcccatgaac 180tccttgccca atggcatctt tttcctgcgc tccttgggtt attccagtct cccctcagca 240ttccttcctc agggcctcgc tcttctctct gctccctcct tgcacagctg gctctgtcca 300cctcagatgt cacagtgctc tctcagagga ggaaggcacc atgtaccctc tgtttcccag 360gtaagggttc aatttttaaa aatggttttt tgtttgtttg tttgtttgtt tgtttgtttg 420tttttcaaga cagggctcct ctgtgtagtc ctaactgtct tgaaactccc tctgtagacc 480aggtcgacct cgaactcttg aaacctgcca cggaccaccc agtcaggtat ggaggtccct 540ggaatgagcg tcctcgaagc taggtgggta agggttcggc ggtgacaaac agaaacaaac 600acagaggcag tttgaatctg agtgtatttt gcagctctca agcaggggat tttatacata 660aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa accaaacatt acatctctta gaaactatat ccaatgaaac 720aatcacagat accaaccaaa accattgggc agagtaaagc acaaaaatca tccaagcatt 780acaactctga aaccatgtat tcagtgaatc acaaacagaa caggtaacat cattattaat 840ataaatcacc aaaatataac aattctaaaa ggatgtatcc agtgggggct gtcgtccaag 900gctagtggca gatttccagg agcaggttag taaatcttaa ccactgaact aactctccag 960ccccatggtc aattattatt tagcatctag tgcctaattt ttttttataa atcttcacta 1020tgtaatttaa aactatttta attcttccta attaaggctt tctttaccat ataccaaaat 1080tcacctccaa tgacacacgc gtagccatat gaaattttat tgttgggaaa atttgtacct 1140atcataatag ttttgtaaat gatttaaaaa gcaaagtgtt agccgggcgt ggtggcacac 1200gcctttaatc cctgcactcg ggaggcaggg gcaggaggat ttctgagttt gaggccagcc 1260tggtctacag agtgagttcc aggacagcca gggctacaca gagaaaccct gtctcgaacc 1320ccccaccccc caaaaaaagc aaagtgttgg tttccttggg gataaagtca tgttagtggc 1380ccatctctag gcccatctca cccattattc tcgcttaaga tcttggccta ggctaccagg 1440aacatgtaaa taagaaaagg aataagagaa aacaaaacag agagattgcc atgagaacta 1500
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<223>小鼠启动子和增强子序列以及人肌养蛋白编码序列<400>10atgagtgcca ggaagctgcg aaatctgtct tacaaaaagg tgattgtgga agagtctaga 60atcttcattt attgttcagc aggattacag aaaagctatc aagagtaaac atttaactga120tacactctta ttccttcttt ttaggctgta aggaggcaaa agttgcttga acagagcatc180cagtctgcgc aggagactga aaaatcctta cacttaatcc aggagtccct cacattcatt240
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108510901095Val Thr Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile110011051110Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala111511201125Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu113011351140Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly114511501155Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr116011651170Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile117511801185Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala119011951200Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp120512101215Asp Glu Val Gln Glu His Leu Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn122012251230Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu123512401245Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp125012551260Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr126512701275Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn128012851290Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr129513001305Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile131013151320
Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu132513301335Ala Ala Leu Glu Glu Thr His Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu134013451350Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr135513601365Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu137013751380Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu138513901395Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp140014051410Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp141514201425Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp143014351440Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu144514501455Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu146014651470Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln147514801485Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp149014951500Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val150515101515Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln152015251530Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu153515401545
Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys155015551560Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His156515701575Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu158015851590Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg159516001605Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu161016151620Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu162516301635Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn164016451650Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro165516601665Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu167016751680Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala168516901695His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser170017051710Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro171517201725Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro173017351740Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val174517501755Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln176017651770Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp
177517801785Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp179017951800Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu180518101815Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp182018251830Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr183518401845Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu185018551860Cys Lys Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln186518701875Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu188018851890Leu Leu His Asp Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val189519001905Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys191019151920Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe192519301935Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro194019451950Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala195519601965Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr197019751980Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe198519901995Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met200020052010
Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp201520202025Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe203020352040Ala Lys His Pro Arg Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu204520502055Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr Pro Ala Ser Ser Pro Gln Leu Ser206020652070His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr Ala Ser Arg Leu207520802085Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ile209020952100Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile Gln His210521102115Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro Arg212021252130Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu Arg Gly213521402145Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn Arg Asn215021552160Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu His Lys216521702175Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro Thr Ser218021852190Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala Lys Leu219522002205Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln Ile Leu221022152220Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg Leu Arg222522302235
Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Ala Lys Val Asn Gly Thr224022452250Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp Ser Ser225522602265Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser Asp Ser227022752280Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro Pro Gln Asp Thr Ser Thr228522902295Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu Asn Asn Ser Phe Pro Ser230023052310Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys Pro Met Arg Glu Asp Thr231523202325Met<210>14<211>30<212>DNA<213>鼠(Murinae gen.sp.)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(14)<223>这是MCK特异性正向引物<400>14cccagcaact gagttcttaa gtctgaaacc 30<210>15<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>这是人肌养蛋白外显子30特异性反向引物<400>15ctgggcttcc tgaggcattt g 21
<210>16<211>368<212>DNA<213>人工的<220>
<223>小鼠肌酸激酶特异性正向引物和人肌养蛋白外显子30特异性反向引物的扩增产物<400>16cccagcaact gagttcttaa gtctgaaccc tttcttctca cagggtccca aaggccgcca 60atatgagtgc caggaagctg cgaaatctgt cttacaaaaa ggtgattgtg gaagagtcta120gaatcttcat ttattgttca gcaggattac agaaaagcta tcaagagtaa acatttaact180gatacactct tattccttct ttttaggctg taaggaggca aaagttgctt gaacagagca240tccagtctgc gcaggagact gaaaaatcct tacacttaat ccaggagtcc ctcacattca300ttgacaagca gttggcagct tatattgcag acaaggtgga cgcagctcaa atgcctcagg360aagcccag 368<210>17<211>312<212>DNA<213>人工的<220>
<223>新霉素抗性基因引物和人肌养蛋白相关蛋白外显子64的引物的扩增产物<400>17cccactttgt ggttctaagt acgtggtttc aaatgtgtca gtttcatagc ctgaagaacg 60agatcagcag cctctgttcc acatacactt cattctcagt attgttttgc caagttctaa120ttccatcaga agctgactct agaggatccg aaggctgcaa aaagcattat gtcgtgagtt180atcacactaa ctgaatcacc ttgctttggg aggttgactt tgttgttatc attaagacag240agacaaatgg cgaggctgag gtatttgcag agtcaatctg actttcagtg ccccctcatt300gaaggagtta gc312<210>18<211>25<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>该序列是neo基因的引物<400>18cccactttgt ggttctaagt actgt 25
<210>19<211>24<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>这是肌养蛋白相关蛋白外显子64的引物<400>19gctaactcct tcaatgaggg ggca24<210>20<211>26<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<400>20gaataatgta cgtttctctg cctacc 26<210>21<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>这是Invitrogen的PCDNA 3.1 Hygro质粒的正向引物<400>21acttatacac gtgcctcgac tgtgccttct agttg35<210>22<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>这是Invitrogen的PCDNA 3.1 Hygro质粒的反向引物<400>22ataagaatgc ggccgctccc cagcatgcct gctattgtct tc4权利要求
1.一种转化的载体，其包含编码肌养蛋白的核酸序列，所述载体在转化前不包含所述核酸序列。
2.如权利要求1所述的转化的载体，其特征在于，所述载体还包含至少一种选自下组的调节元件启动子、增强子和poly A信号位点。
3.如权利要求1所述的转化的载体，其特征在于，所述核酸序列是能够表达所述肌养蛋白的转基因。
4.如权利要求1所述的转化的载体，其特征在于，所述核酸序列与SEQ ID No.10至少有80％的序列相同性。
5.如权利要求1所述的转化的载体，其特征在于，所述载体选自质粒或病毒载体。
6.如权利要求1所述的转化的载体，其特征在于，所述肌养蛋白是视网膜肌养蛋白。
7.一种细胞，该细胞包含插入到细胞基因组内从而转化所述细胞的核酸序列，所述核酸序列编码肌养蛋白。
8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述核酸序列与SEQ ID No.10至少有80％的序列相同性。
9.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述核酸序列还包含至少一种选自下组的调节元件启动子、增强子和poly A信号位点。
10.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自成肌细胞、骨髓细胞或骨髓细胞边缘群。
11.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述肌养蛋白是视网膜肌养蛋白。
12.一种转基因动物，所述动物具有稳定整合到其基因组内的外源核酸序列，所述核酸序列编码肌养蛋白。
13.如权利要求12所述的转基因动物，其特征在于，所述动物选自小鼠、人、犬或马。
14.如权利要求12所述的转基因动物，其特征在于，所述核酸序列与SEQ ID No.10至少有80％的序列相同性。
15.如权利要求12所述的转基因动物，其特征在于，所述核酸序列还包含至少一种选自下组的调节元件启动子、增强子和poly A信号位点。
16.如权利要求12所述的转基因动物，其特征在于，所述肌养蛋白是视网膜肌养蛋白。
17.一种其中含有权利要求1所述载体的转化细胞。
18.一种降低动物的进行性假肥大性肌营养不良的至少一种临床症状的严重性的方法，该方法包括如下步骤将一种遗传插入片段引入所述动物的基因组内，所述插入片段编码肌养蛋白。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述插入片段是与SEQ ID No.10至少有80％序列相同性的核酸。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述插入片段还包含至少一种选自下组的调节元件启动子、增强子和poly A信号位点。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述肌养蛋白是视网膜肌养蛋白。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述引入步骤包括将载体稳定转染入所述基因组内的步骤，所述载体包含所述遗传插入片段。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述载体选自质粒或病毒载体。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述临床症状选自复合性重复放电、脊柱后凸、坏死、姿态松弛、生长迟缓或严重的肌无力。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述动物选自人、小鼠、马或犬。
26.一种降低动物的进行性假肥大性肌营养不良的至少一种临床症状的严重性的方法，该方法包括如下步骤将细胞施用于所述动物，所述细胞已用编码肌养蛋白的遗传插入片段转染。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述施用步骤前从所述动物取出细胞并用所述遗传插入片段转染所述细胞的步骤。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述转染步骤利用载体或裸DNA电穿孔进行。
29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述肌养蛋白是视网膜肌养蛋白。
30.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述插入片段与SEQ ID No.10至少有80％的序列相同性。
31.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述细胞选自成肌细胞、骨髓细胞或骨髓细胞边缘群。
32.一种包含表达肌养蛋白的核酸序列的转基因。
33.如权利要求32所述的转基因，其特征在于，所述肌养蛋白是视网膜肌养蛋白。
34.如权利要求32所述的转基因，其特征在于，所述核酸序列与SEQ ID No.10至少有80％的序列相同性。
35.如权利要求32所述的转基因，其特征在于，所述核酸序列来源于ATCC克隆57670、57672、57674和57676。
36.如权利要求32所述的转基因，其特征在于，所述核酸序列来源于所述肌养蛋白经另路剪接所形成的同种型。
37.如权利要求32所述的转基因，该转基因还包含至少一种选自下组的调节元件启动子、增强子和poly A信号位点。
全文摘要
进行性假肥大性肌营养不良(DMD)是一种由肌养蛋白基因的严重缺陷所引起的进行性肌肉疾病，可导致患者在20到30岁之间死亡。本发明利用双突变小鼠(DM)作为合适的人DMD模型，因为这些小鼠的肌养蛋白和肌养蛋白相关蛋白都有缺陷(mdxl+，utrn－/－)，在3个月时死亡，患有严重的肌无力、明显的生长迟缓、脊柱后凸、体重下降、姿态松弛以及运动能力下降。新型人视网膜肌养蛋白Dp260转基因的表达被证明可防止过早死亡，将严重的肌营养不良表型缓解到轻微的临床肌病的程度。肌电图描记术、组织学、放射影像学、磁共振成像以及行为试验证明，转基因DM小鼠生长正常，有正常的脊柱弯曲和运动能力，肌肉病变减轻。转基因DM小鼠的EMG和组织学数据表明，转基因DM小鼠的异常症状可降低到轻微肌病的典型水平，而DM小鼠却出现了人肌营养不良疾病所常见的严重异常症状。转基因DM小鼠还表现出与未处理mdx小鼠和对照相似的可检测运动水平。
文档编号A01K67/00GK101065487SQ200580030456
公开日2007年10月31日 申请日期2005年7月15日 优先权日2004年7月16日
发明者R·怀特, R·加伊迪克, K·菲茨杰拉德－古斯塔夫松 申请人:儿童慈善医院