芸苔indehiscent1序列的制作方法

专利名称：芸苔indehiscent1序列的制作方法
芸苔7M^F/5TEVn序列
相关专利申请的交叉参考
本专利申请要求2004年6月18日提交的美国临时专利申请号 60/608， 967的权利，将其为了所有目的引入本文作为参考。
关于在联邦政府赞助的研究或者研发下做出的发明的权利的申明
本发明在政府支持下根据国家科学基金会(National Science Foundation)授权号IBN-9985530做出。政府享有本发明中的某些权 利。
背景技术：
油菜籽是排在大豆和棉籽之后的最重要的油料种子作物之一， 1990年占世界油料种子产量的10%。油菜籽含有40%油，从种子搾取 油后剩下具有动物饲料和氮肥价值的高蛋白质种渣(meal)。油菜籽油， 也称作芸苔油，是有价值的产品，代表世界上第四位最普遍交易的植 物油。
不幸的是，从油菜籽和相关植物得到的种子的产量受到豆荚开裂 的限制，豆荚开裂是在果实发育的晚期发生的一种过程，从而豆荚打 开并且释放被包住的种子。细胞壁沿着细胞的分离层的降解和分裂将 豆荚分成两半，称作"开裂区(dehiscence zone)"，导致豆荚的两半 分离并且释放所含的种子。开裂区是仅仅1到3个细胞宽的区域，其 沿着瓣膜/胎座框边界的整个长度延伸(Meakin和Roberts, J. Exp. Botany 41:995-1002 (1990))。由于开裂区中的细胞相互分开，所以 瓣膜从胎座框脱离，允许种子散布。种子"落粒"是商业种子生产商 面临的严重问题并且代表工业上收入的损失，通过"落粒"，种子在可 以农作物被收获前就通过开裂而永久地脱落。不利的天气条件可以加重开裂过程，导致种子产量损失50%以上。
果实是开花植物特有的复合体结构，其介导种子的成熟和散布。 在多数开花植物中，果实由源自子房壁的果皮和从受精的胚珠发育的
种子组成。3000种以上的十字花科植物的代表拟南芥"i^ZuVop幻'50
产生果实，其中两个心皮瓣膜(子房壁)结合胎座框，胎座框是分来 两片芯片的可见的缝。
植物激素乙烯由正发育的种子产生并且似乎是开裂过程的重要调 节剂。支持乙烯在开裂的调节中的作用的一个证据来自对果实成熟的 研究，果实成熟像果实开裂一样，是涉及细胞壁物质分解的一种过程。 在果实成熟中，乙烯部分通过激活细胞壁降解酶，如多聚半乳糖醛酸
酶而起作用(Theologis等人，Develop. Genetics 14:282-295 (1993))。此外，在遗传修饰的番茄植物(其中乙烯应答被阻断)中，
如表达反义多聚半乳糖醛酸酶的转基因番茄植物中，果实成熟有显著 延迟(Lanahan等人，The Plant Cell 6:521-530 (1994) ; Smith等人， Nature'334:724-726 (1988))。
在开裂中，超微结构改变以开裂区细胞的胞间层的降解结束，使 得油菜籽豆荚变得脆弱，并且最终导致豆荚落粒。如在果实成熟中一 样，包括多聚半乳糖醛酸酶的水解酶在该程序化分解中起作用。例如， 在油菜中，特异性内切多聚半乳糖醛酸酶RDPG1被上调并且仅在豆荚 发育的晚期在开裂区中表达(Petersen等人，Plant Mol. Biol. 31:517-527 (1996)，将其引入本文作为参考)。如在果实成熟中一样， 乙烯可以调节参与开裂过程的水解酶的活性(Meakin和Roberts, J Exp. Botany 41:1003-1011 (1990)，将其引入本文作为参考)。然而， 直到现在，控制开裂的过程的蛋白质，如调节相关水解酶的蛋白质还 没有被鉴定。
过去20年中解决豆荚落粒和过早果实开裂的尝试都集中在培育 落粒抗性的品种上。然而，这些植物杂种经常是不育的并且丢失了有 利的特征，这些特征必须通过回交再次获得，回交耗时而且费力。减 轻豆荚落粒的其他策略包括使用化学品，如豆荚封闭剂或者机械技术， 如包裹，以减小风刺激的落粒，然而，迄今为止，还没有一种用于产生不打开和释放它们的不成熟的种子的遗传修饰的植物的简单方法。
从而，存在对鉴定调节开裂过程的基因和开发其中天然的种子散 布过程被延迟的遗传修饰的植物品种的需要。本发明满足了该需要并 且还提供了相关的优点。
发明概述
本发明提供了分离的核酸，其包含编码与SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10具有至少90%同一性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中， 所述多肽包含SEQIDN0:9。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:IO。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID N0:7。在一些 实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ IDN0:8。在一些实施方案中，所 述多核苷酸包含SEQ ID NO:ll。在一些实施方案中，所述多核苷酸包 含SEQ ID NO: 12。
本发明还提供了表达盒，其包含有效连接多核苷酸，或者其互补 体(complement)的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 7或SEQ ID N0:8的至少200个连续核苷酸具有至少90%的同 一性。在一些实施方案中，所述序列包含SEQIDN0:9。在一些实施方 案中，所述序列包含SEQ ID N0:10。在一些实施方案中，所述多核苷 酸与编码SEQ ID N0:9的核苷酸序列有至少90%同一性。在一些实施 方案中，所述多核苷酸包含编码SEQ ID N0:9的核苷酸序列。在一些 实施方案中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO: 10的核苷酸序列有至少 90。Z同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码SEQIDN0:10 的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子是组成型的。在一些 实施方案中，启动子是组织特异的。在一些实施方案中，启动子是开 裂区特异的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸以反义方向有 效连接启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸以有义方向有效连 接启动子。
本发明还提供了包含重组表达盒的植物，该表达盒包含有效连接 多核苷酸，或者其互补体的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷 酸包含与编码SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10的序列的至少200个连续核苷酸具有至少90%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所
述序列包含SEQ ID N0:9。在一些实施方案中，所述序列包含SEQ ID N0:10。在一些实施方案中，所述多核苷酸与编码SEQ ID N0:9的核苷 酸序列有至少90%同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编 码SEQ ID N0:9的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸与 编码SEQ ID NO: 10的核苷酸序列有至少90%同一性。在一些实施方案 中，所述多核苷酸包含编码SEQ ID N0:10的核苷酸序列。在一些实施 方案中，所述启动子是组成型的。在一些实施方案中，启动子是组织 特异的。在一些实施方案中，启动子是开裂区特异的启动子。在一些 实施方案中，所述多核苷酸以反义方向有效连接启动子。在一些实施 方案中，所述多核苷酸以有义方向有效连接启动子。在一些实施方案 中，在植物的瓣膜边缘细胞(valve margin cell)中木质化减少。在 一些实施方案中，在植物中的木质化增强。在一些实施方案中，植物 是芸苔属物种。在一些实施方案中，植物的特征是与不包含所述表达 盒的植物相比具有延迟的种子开裂。
本发明还提供了延迟植物中果实开裂的方法。在一些实施方案中， 该方法包括通过向植物中导入包含有效连接多核苷酸或者其互补体的 启动子的重组表达盒，抑制植物中IND1核酸的表达，其中所述多核苷 酸包含与编码SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10的序列的至少200个连续 核苷酸有至少90%同一性的核苷酸序列；并选择与其中没有导入所述 表达盒的植物相比，具有延迟的果实开裂的植物。在一些实施方案中， 所述序列包含SEQ IDN0:9。在一些实施方案中，所述序列包含SEQ ID N0:10。在一些实施方案中，所述多核苷酸与编码SEQ ID N0:9的核苷 酸序列有至少90%同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编 码SEQ ID N0:9的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸与 编码SEQ ID NO: 10的核苷酸序列有至少90%同一性。在一些实施方案 中，所述多核苷酸包含编码SEQ IDN0:10的核苷酸序列。在一些实施 方案中，所述启动子是组成型的。在一些实施方案中，启动子是组织 特异的。在一些实施方案中，启动子是开裂区特异的启动子。在一些 实施方案中，所述多核苷酸以反义方向有效连接启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸以有义方向有效连接启动子。在一些实施方案 中，使用土壤杆菌"^Ws"eh腿)向植物中导入重组表达盒。在一 些实施方案中，植物是芸苔属物种。
定义
术语"核酸"和"多核苷酸"可以同义地使用并且指从5'到3'
末端阅读的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合 物。核酸或者多核苷酸还可以包括经修饰的核苷酸，其允许聚合酶正 确地连读并且不改变该核酸编码的多肽的表达。"核酸序列"可以包括 作为单链或者双链体中核酸的有义和反义链。它包括但不限于，自身
复制的质粒、染色体序列，和DNA或者RNA的感染性多聚体。
短语"编码核酸序列"指编码一个读框中至少5个连续氨基酸的 氨基酸序列的核酸。当导入细胞或者其他表达载体时不必表达氨基酸， 而是可以仅仅基于遗传密码确定。例如，序列ATGATGGAGCATCAT编码 MME朋。从而，多核苷酸可以编码包含终止密码子的多肽序列或者含有 改变的读框，只要在一个读框中有至少5个连续氨基酸。核酸序列可 以包含转录成RNA的DNA链序列和翻译成蛋白质的固A序列。核酸序 列包括全长核酸序列以及来自全长序列的片段。将进一步理解，序列 包括天然序列的简并密码子或者可以导入序列以提供在特定宿主细胞 中的密码子偏爱。
术语"启动子"或者"调节元件"指位于转录开始处上游或者下 游并且涉及RNA聚合酶和其他蛋白质启动转录的识别和结合的区域或 者序列决定子。"植物启动子"是能够启动植物细胞中转录的启动子。 此类启动子不必是植物来源的，例如，来自植物病毒的启动子，如CaMV 35S启动子可以用于本发明中。
本文所用的术语"开裂区选择性调节元件"指核苷酸序列，其当 有效连接核酸分子时，赋予所述有效连接的核酸分子在有限数目的植 物组织，包括瓣膜边缘或者开裂区中的选择性表达。瓣膜边缘是开裂 区中的未来位点并且包括外侧胎座框的边缘以及与外侧胎座框相邻的 瓣膜细胞。在瓣膜边缘区中发育的开裂区指在开裂过程中分开的一组细胞，允许瓣膜与胎座框分离和释放封闭的种子。从而，如本文定义 的开裂区选择性调节元件在成熟开裂区中赋予选择性表达，或者在瓣 膜边缘赋予选择性表达，其标记了开裂区的将来位点。
开裂区选择性调节元件可以仅在细胞的瓣膜边缘或者开裂区中赋 予特异表达或者可以在有限数目的植物细胞类型，包括在瓣膜边缘或 者开裂区的细胞中赋予选择性表达。例如，赋予在胚珠和胎座以及开
裂区中选择性表达的5"朋7Ti5y /^^F7或者5"朋7T^57 /^6^^ (SHP1禾口 SHP2，以前分别称作AGL1和AGL5)调节元件是如本文定义的开裂区选 择性调节元件。类似地，IND调节元件也在开裂区中赋予选择性表达。 开裂区选择性调节元件通常通过在薄膜边缘或者开裂区中赋予选择性 表达而不在整个相邻的心皮瓣膜赋予表达而与其他调节元件不同。
可以理解可以进行有限的修饰而不破坏调节元件的生物学功能并 且这种有限的修饰可以导致开裂区选择性调节元件，其与野生型IND 调节元件相比具有基本上等同的或者增强的功能。这些修饰可以是有 意的，例如，通过定点诱变，或者可以是偶然的，如通过含有调节元 件的宿主中的突变。所有此类修饰的核苷酸序列包括在开裂区选择性 调节元件的定义中，只要在瓣膜边缘或者开裂区中赋予选择性表达的 能力被基本上保存。
术语"植物"包括完整植物、芽营养器官/结构(例如，叶、茎干 和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、翼瓣膜、雄蕊、 心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、 植物组织(例如，维管组织、地下组织，等等)和细胞(例如，保卫 细胞、卵细胞、细胞列等等)，和它们的后代。可以用于本发明方法中 的植物的种类通常宽泛至可以进行转化技术的高等和低等植物类别， 包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、厥类和多细胞 藻类。它包括多种倍数性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍 体、单倍体和半合子。
术语"种子植物"指被子植物或者裸子植物。被子植物是具有种 子的植物，其种子在成熟子房中产生(果实)。通常将被子植物认为是 开花植物。将被子植物根据子叶数目分成两大类，子叶是通常贮存和吸收食物的子叶。从而，单子叶被子植物是具有单个子叶的被子植物， 而双子叶被子植物是具有两片子叶的被子植物。多种被子植物是已知 的，包括例如，油料种子植物、豆科植物、结有果实的植物、观赏花、 谷类植物和阔叶树，其一般类别不必是排他性的。技术人员将认识到 如希望，可以使用这些或其他被子植物进行本发明的方法。裸子植物 是种子不封闭在子房中的结有种子的植物。
短语"宿主细胞"指来自任何生物的细胞。示例性宿主细胞来自 植物、细菌、酵母、真菌、昆虫或者其他动物。向多种类型的宿主细 胞导入多核苷酸序列的方法是本领域公知的。
本文所用的术语"延迟的"当涉及通过本发明的非天然发生的植 物产生的果实中的种子散布的计时时，指与在表达天然发生的水平的 IND的相同发育阶段时种子通常与对应的植物散布的时间相比，种子散 布时间的统计学上的显著较晚。从而，术语"延迟的"广义地使用以 包括与对应植物中种子散布相比显著推迟的种子散布，还包括种子散 布被完全阻碍，从而果实从不释放它们的种子，除非人为干预或者其 他千预。
认为到在植物品种或者变种内种子散布的时间存在自然变异。然 而，可以容易地鉴定在本发明的非天然发生的植物中种子散布时间的 "延迟"，可以通过对非天然发生的植物的群体采样并确定种子散布时
间的正态分布平均比不含有外源頂D多核苷酸的对应的植物品种或者 变种群体中种子散布时间的正态分布更晚来完成所述鉴定。从而，本 发明的非天然发生的植物的群体提供了倾斜来自授粉的种子散布时间 的正态分布的手段，从而，种子的平均散布比对应的不含有编码IND 基因产物的外源核酸分子的植物品种中晚至少约1%、 2%、 5%、 10%、 30%、 50%、 100%、 200%或500%。
术语"受抑制的"或者"减少的"包括植物中不存在IND蛋白质， 以及存在蛋白质表达但是与野生型植物中IND蛋白质表达水平相比减 少。此外，术语"受抑制的"指IND蛋白质表达在IND表达整个区域 减少，或者表达在IND表达区域的一部分区域减少，条件是所得植物 的特指是延迟的种子散布。术语"受抑制的"还包括IND蛋白质的量，其等同于野生型IND表达，但是IND蛋白质的活性水平降低。如上面
讨论的，IND每种含有保守的碱性HLH结构域；HLH结构域内减小頂D 的DNA结合活性的点突变或者总体缺失可以减小或者破坏IND的活性， 并且因此，如本文定义"抑制"IND表达。本领域技术人员将认识到优 选地，IND表达基本上不存在于植物的瓣膜边缘或者工ND蛋白质基本上 是无功能的。
IND基因的"增加的"或者"增强的"IND活性或表达指IND活性 的增强的改变。此类增加的活性或表达的实例包括下面的。IND活性或 者IND基因的表达增加到高于野生型的非转基因对照植物中的水平 (即，IND活性或者IND基因的表达的量增加)。IND活性或者IND基 因的表达在器官、组织或细胞中，通常在野生型、非转基因的对照植 物中的所述器官、组织或细胞中检测不到所述IND活性或者IND基因 的表达(即，IND活性或者IND基因表达的空间分布增加)。当IND活 性或者IND基因表达存在于器官、组织或者细胞中比在野生型、非转 基因对照中存在更长的时间时，IND活性或表达增加(即，IND活性或 者IND基因表达的持续时间增加)。
如果多核苷酸序列来自外来物种，或者如果来自相同物种，但是 被人的活动将其最初形式修饰，那么该多核苷酸序列与第二种多核苷 酸是"异源的"。例如，启动子有效连接到异源编码序列是指编码序列 来自的物种与启动子所来自的物种不同，或者如果来自相同物种，编 码序列与天然发生的等位基因变体不同。
如果第二核苷酸序列来源于外来种类，或者，如果是来自相同种 类的话，其是通过人为作用被从其原先类型修饰，则多核苷酸序列"异 源于"第二核苷酸序列。例如，有效连接到异源于编码序列的启动子 指的是来自不同于启动子源，或者如果是相同的种类，不同于任何天 然发生等位变体的编码序列的编码序列。
个体植物"外源的"多核苷酸是通过不同于性交配的方式导入植 物，或者植物的祖先世代的多核苷酸。外源核酸分子可以具有天然发 生的或者非天然发生的核苷酸序列并且可以是来自与该核酸分子所导 入的植物不同的植物种的异源核酸分子，或者可以是来自与该核酸分子所导入的植物相同植物种的核酸分子。可以实现该导入的手段的实 例在下文描述，并且包括农杆菌介导的转化、生物射弹方法、电穿孔、
植物内(in planta)技术，等等。
"IND多核苷酸"是与SEQ IDN0:1、 7、 8、 11或12基本上相似 核酸序列或者编码与SEQ ID N0:2、 9或10基本上相似的bHLH多肽的 核酸序列。IND多肽将通常在该蛋白质的碱性区的9位具有丙氨酸(例 如，SEQIDN0:2的氨基酸位置129、 SEQ ID N0:9的140位、和SEQ ID N0:10的112位)并且通常不包含PAS结构域(Nambu (1991) Cell 67:1157-1167; Wilk， R. (1996) Genes Dev. 70:93-102)。 IND多核 苷酸可以包含(或者组成为)约50到约10，000或者更多核苷酸，有 时约100到约3， 000个核苷酸，有时约200到约600个核苷酸的编码 区，其在严格条件下(如下文定义)与SEQ IDNO:l、 7或8杂交，或 者编码IND多肽或者其至少15个氨基酸的片段。还可以通过IND多核 苷酸在低严格条件(例如，Tm 4(TC)下与具有SEQ ID NO:l、 7、 8、 11或12的序列的核酸探针杂交的能力来鉴定IND多核苷酸。SEQ ID N0:1、 7、 8、 11或12是IND多核苷酸的实例。
"来自IND基因的启动子"或者"IND启动子"将通常长为约500 到约3000个核苷酸，通常约750到2750。示例性启动子序列显示为 SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。 SEQ ID N0:3代表IND的5，非翻译区， SEQ ID N0:4代表IND的3'非翻译区。IND启动子还可以通过它指导 果实中瓣膜边缘的表达的能力来鉴定。具体地，IND启动子指导刚好在 受精前(阶段13)到果实成熟(阶段17)期间正发育的雌蕊的瓣膜边 缘的表达。启动子在叶组织中不提供显著表达。
"IND多肽"是与SEQ ID N0s:2、 9或10基本上相似的氨基酸序 列或者其片段。活性IND多肽通常在该蛋白质的碱性区域的9位具有 丙氨酸(例如，SEQ ID N0:2的氨基酸位置129)并且通常不包含PAS 结构域(Nambu (1991) Cell 67:1157-1167; Wilk， R. (1996) Genes Dev. 70:93-102)。全长IND多肽的特征是存在碱性螺旋一环一螺旋(HLH) 结构域，其特异结合多核苷酸序列。例如，氨基酸残基ISDDPQTVVARRR RERISEKIRILKRIVPGGAKMDTASMLDEAIRYTKFLK代表SEQ ID N0:2中所示的多肽的HLH结构域。HLH结构域是本领域已 知的并且由其他转录因子共有，所述转录因子包括GenBank检索号 E1283552和2262147代表的未表征的序列和基因产物PIF3 (Ni等人. Cell 95:657 (1998))。因此，IND的HLH结构域是DNA结合结构域。
如本文所用的，特定IND基因(例如，SEQ ID NO: 1)的同源物或 者直向同源物是相同植物类型或不同植物类型中的第二种基因，其多 核苷酸序列有至少50个连续核苷酸与第一种基因的序列基本上同一
(如下文描述的确定)。认为通常同源物或直向同源物具有共同的进化 历史。
特定基因的"多核苷酸序歹廿(polynucleotide sequence from" 是頂D基因的子序列或者全长多核苷酸序列，其当存在于转基因植物 中时，具有所希望的效果。例如， 一种效果是抑制内源基因的表达， 驱动异源多核苷酸的表达。
如本文所用的术语"繁殖组织"包括果实、胚珠、种子、花粉、 雌蕊、花或者任何胚组织。
"表达盒"指核酸构建体，其当导入宿主细胞时，分别导致RNA 或者多肽的转录和/或翻译。不翻译或者不能翻译的翻译构建体或者有 义构建体特别地被该定义包括。
对于转基因的表达和内源基因的抑制(例如，通过反义抑制、或 者有义抑制)，技术人员将认识到插入的多核苷酸序列不必相同并且可 以与它所来源的基因的序列"基本上同一"。如下面解释的，这些变体 特别被该术语覆盖。
当所插入的多核苷酸序列被转录和翻译以产生功能多肽时，技术 人员将认识到因为密码子简并性，许多多核苷酸序列将编码相同的多 肽。这些变体特别被术语来自特定瓣膜边缘基因如IND的"多核苷酸 序列"所覆盖。此外，该术语特别包括与IND基因序列基本上同一 (如 下文描述的确定)的序列(例如，全长序列)并且编码保留IND多肽 的功能的蛋白质。
当多核苷酸用于抑制内源基因的表达时，所导入的序列不必与靶 内源基因的序列完全同一。所导入的多核苷酸序列将通常与靶内源序列至少基本上同一(如下文确定)。
两种核酸序列或者多肽当如下述进行比对以得到最大对应时，如 果两种序列中分别核苷酸或者氨基酸残基的序列相同时，那么说这两 种核酸序列或者多肽是"同一的"。术语"互补"在本文中用于表示该 序列与参考多核苷酸的全部或者部分互补。
用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch J Mol. Biol. 48:443 (1970)的局部比对算法，通过Pearson和Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)的相似性搜索算 法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package ( Genetics Computer Group (GCG)， 575 Science Dr. ， Madison， WI)中的GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA和TFASTA)，或者通过检査来进 行。
"序列同一性百分数"通过比较在比较窗口中最佳比对的序列来 确定，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中多核苷酸序列的部 分与参考序列(其不包含添加或者缺失)相比可以包含添加或缺失(即， 缺口)。通过确定在两个序列中发生相同核苷酸碱基或者残基的位置数 目得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中位置总数并将结果 乘以IOO得到序列同一性百分数来计算百分数。
术语多核苷酸序列的"基本同一性"指多核苷酸包含具有至少25 %序列同一性的序列。备选地，百分比同一性可以是从25%到100% 的任意整数。示例性实施方案包括至少25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或99%。使用本 文描述的程序与参考序列相比，优选使用BLAST用标准参数进行比较， 如下述。因此，本发明的IND序列包括与SEQ ID N0:1、 7、 8、 11或 12具有基本同一性的核酸序列。本发明的IND序列还包括与SEQ ID N0:2、 9或10具有基本同一性的多肽序列。技术人员将认识到考虑到 密码子简并性、氨基酸相似性、读框定位等等，可以适当调整这些值 来确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应的同一性。对于这些目的， 氨基酸序列的基本同一性通常指至少40%的序列同一性。多肽的优选的百分比同一性可以是40 %到100 %的任意整数，例如，至少40%、 45°/0、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或99%，有时至 少61%、 62%、 63%、 64%、 65%、 66%、 67%、 68%、 69%、 70%、 71%、 72%、 73%、 74%和75%。"基本上相似的"多肽共有如上面提到的序列，只是 不同一的残基位置可以由于保守氨基酸改变而不同。保守氨基酸替代 指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨 基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟 基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺的侧链的一组氨 基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸 和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选 的保守氨基酸替代组是缬氨酸一亮氨酸一异亮氨酸，苯丙氨酸—酪 氨酸，赖氨酸一精氨酸，丙氨酸一缬氨酸，天冬氨酸一谷氨酸，和天 冬酰胺一谷氨酰胺。
核苷酸序列基本上同一的另一表示是如果两种分子在严格条件下 相互杂交或者与第三种核酸杂交。严格条件是依赖序列的并且将在不 同环境中不同。通常，选择严格条件比特定序列在确定的离子强度和 pH下的热解链温度(Tm)低约5r。 Tm是50^的靶序列与完全匹配的 探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常，严格条件将为 在pH7下盐浓度为约0. 02摩尔/升并且温度为至少约6(TC的条件。
在本发明中，使用本发明的cDNA或者至少约100个核苷酸的片段， 在严格条件下在RNA印迹中可以鉴定本发明的IND基因编码的mRNA。 对于本公开，此类RNA-DNA杂交的严格条件是包括在0. 2XSSC中63°C 下至少一次洗涤，每次20分钟的条件，或者等同条件。包含本发明基 因的基因组DNA或者cDNA可以用相同cDNA(或者至少约100个核苷酸 的片段)在严格条件下鉴定，对于本公开，严格条件包括在0. 2XSSC 中至少约5CTC，通常约55'C的温度下至少一次(通常2次)洗涤，每 次20分钟的条件，或者等同条件。
术语"分离的"当应用于核酸或者蛋白质时，表示该核酸或者蛋 白质基本上无它在天然状态下结合的其他细胞组分。它优选在同质状态并且可以为干燥的或者水溶液。通常使用分析化学技术，如聚丙烯 酰胺凝胶电泳或者高效液相层析来确定纯度或者同质性。在制备物中 作为主要种类存在的蛋白质是基本上纯化的。具体地，分离的基因与 位于该基因侧翼并且编码不同于目的基因的蛋白质的可读框分离。
附图简述


图1描绘了拟南芥IND1的氨基酸序列与欧洲油菜(^^ w'ca /7，5)的Bn INDl和Bn IND2的氨基酸序列的比对。
图2描绘了拟南芥IND1的核苷酸序列与欧洲油菜的Bn頂D1和 Bn IND2的核苷酸序列的比对。
发明详述
I. 介绍
本发明提供了编码IND序列的多核苷酸，包含该多核苷酸的转基 因植物，和调节植物中木质化和/或种子开裂的方法。本发明的序列部 分基于发现了两种欧洲油菜多核苷酸，其编码拟南芥IND1基因的直向 同源物并且可以互补拟南芥indl突变体。
通常，下面描述的重组DNA技术中的术语和实验步骤是公知的并 且通常用于本领域。标准技术用于克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。 通常根据生产商的说明书进行酶促反应，其涉及DNA连接酶、DNA聚合 酶、限制性内切酶等等。这些技术和其他技术通常根据Sambrook等人， Molecular Cloning - A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) 禾口 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等人.，eds.: Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc(增补到2004)进行。
II. 本发明核酸的分离
可以通过多种技术完成本发明的多核苷酸的分离。例如，基于本 文公开的序列的寡核苷酸探针可以用于从所希望的植物种的cDNA或者基因组DNA文库鉴定所希望的多核苷酸。为了构建基因组文库，通过
随机片段化，例如使用限制性内切酶分离基因组DNA的大片段，并用 载体DNA连接形成多联体，其可以包装成合适的载体。备选地，可以 从植物或者植物部分(例如，花)构建cDNA文库。
然后可以使用基于所克隆的IND1基因的序列如本文公开的多核 苷酸的探针筛选cDNA或者基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或 者cDNA序列杂交以分离相同或者不同植物物种中的同源基因。
备选地，可以用扩增技术从核酸样品扩增目的核酸。例如，用聚 合酶链式反应(PCR)技术从mRNA、 cDNA、基因组文库或者cDNA文库 直接扩增基因的序列。PCR和其他体外扩增方法还可以用于例如，克隆 编码待表达的蛋白质的核酸序列，以制备用作探针的核酸，其用来检 测样品中所希望的mRNA的存在，用于核酸测序，或者用于其他目的。
通过本文提供的序列的比较产生了用于鉴定来自植物组织的基 因，如IND1的合适的引物和探针。对于PCR的一般综述，见PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis， M， Gelfand， D. ， Sninsky， J. and White, T. , eds.)， Academic Press, San Diego (1990)。用于扩增拟南芥IND1或者IND1 cDNA的基因组区 域的合适的引物包括下面的引物对
5'-gatgaaaatggaaaatggtatgtata-3' (SEQ ID NO: 29) 禾口 5'-gttcatcagggttgggagttgtg-3， (SEQ ID NO: 30)。扩增条件通常如下。 反应组分10 mM Tris-HCl， pH 8.3， 50 mM氯化钾，1. 5 mM氯化镁， 0.001%明胶，200 uM dATP， 200 " M dCTP， 200 y M dGTP， 200 uM dTTP， 0.4 yM引物，和100单位/ml Taq聚合酶。程序96。C3分钟， 30个循环的96匸45秒，5(TC60秒，72。C60秒，然后是72。C5分钟。
还可以通过如技术文献中描述的公知的技术合成多核苷酸。见， 例如，Cairuthers等人.，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982)和Adams等人.，J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983)。然后可以通过合成互补链和在合适条件下将链一起退火，或 者使用DNA聚合酶用合适的引物序列加入互补链，可以得到双链DNA 片段。本发明的IND1核酸序列的类别包括使用本发明核酸序列，包括
SEQ IDN0:1、 7、 8、 11和12和本发明的蛋白质序列，包括SEQ IDN0:2、 9和10通过分析鉴定和表征的基因和基因产物。本发明的INDl序列包 括与SEQ ID NO:l、 7、 8、 11、禾B/或12具有基本同一性的核酸序列。 本发明的INDl序列还包括与SEQ ID NO: 2、 9和/或10具有基本同一 性的多肽序列。
III.本发明的核酸的用途
A.用本发明的核酸抑制或阻抑基因表达
本发明提供了通过向植物中导入重组表达盒调节植物中果实开裂 的方法，所述表达盒包含有效连接IND1多核苷酸的调节元件。本发明 还提供了通过抑制编码INDl基因产物的核酸分子的表达延迟植物中种 子散布的方法。在本发明的转基因植物中，编码INDl基因产物的核酸 分子或者其反义构建体可以有效连接外源调节元件。本发明提供了例 如特征是延迟的种子散布的转基因植物，其具有编码INDl基因产物的 核酸分子或者其反义构建体，所述核酸分子或者其反义构建体有效连 接外源组成性调节元件。在一个实施方案中，本发明提供了转基因植 物，其特征是由于编码INDl多肽的核酸分子的抑制而具有延迟的种子 散布和/或受调节的木质化。在一些实施方案中，INDl表达的抑制导致 与开裂区相邻的细胞(例如，瓣膜边缘细胞，见，例如，1999年6月 25日提交的美国临时申请序号09/339， 998)中木质化减少，而异位表 达导致增加的木质化。
本发明的INDl序列可以用于制备用于许多技术中的表达盒，所述 技术包括抑制、阻抑或者增加表达或者异位表达。许多方法可以用于 抑制植物中的基因表达。例如，可以方便地使用反义技术。为了实现 该目的，将来自所希望的基因的核酸片段克隆并有效连接启动子从而 RNA的反义链将转录。然后将表达盒转化到植物中并产生RNA的反义 链。在植物细胞中，已经提示反义RNA通过防止编码目的酶的mRNA的 积累抑制基因表达。见例如，Sheehy等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:8805-8809 (1988); Pnueli等人，The Plant Cell 6:175-186(1994);和Hiatt等人，美国专利号4， 801， 340。
转化到植物中的反义核酸序列将与待抑制的一种或多种内源基因 的至少一部分实质性同一。然而，该序列不必完全同一以抑制表达。 从而，编码仅一部分IND1的反义或者有义核酸分子可以用于产生其中 頂D1表达受到抑制的植物。可以设计本发明的载体从而抑制效应应用 于显示出与靶基因的同源性或者基本同源性的基因家族内的其他蛋白 质。
对于反义抑制，导入的序列也不必相对于初级转录产物或者完全 加工的mRNA是全长的。通常，较高的同源性可以弥补较短序列的使用。 此外，导入的序列不必具有相同的内含子或者外显子模式，并且非编 码区段的同源性可以是同样有效的。通常，将使用约30或40个核苷 酸或者约全长核苷酸的序列，然而优选至少约IOO个核苷酸的序列， 更优选至少约200个核苷酸的序列，特别优选至少约500个核苷酸的 序列。
催化性RNA分子或者核酶还可以用于抑制IND1基因的表达。可以 设计核酶，其与几乎任何靶RNA特异配对并且在特定位置切割磷酸二 酯主链，从而功能性失活靶RNA。在进行该切割中，核酶自身不改变， 从而能够回收和切割其他分子，使得它为真正的酶。在反义RNA内包 括核酶序列赋予它们RNA切割活性，从而增加构建体的活性D
已经鉴定了许多类别的核酶。 一类核酶来自许多小的环状RNA， 其能够自身切割和在植物中复制。RNA单独复制(类病毒RNA)或者与 辅助病毒(卫星RNA) —起复制。实例包括来自鳄梨日斑病类病毒的 RNA和来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、 sola皿m nodifiorum斑点病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。耙 RNA特异性核酶的设计和使用在Haseloff等人.Nature, 334:585-591 (1988)中描述。
另一种抑制方法是有义抑制(也称作共抑制)。将其中核酸关于启 动子以有义方向装配的表达盒导入己经表明是阻断靶基因的转录的有 效手段。关于使用该方法调节内源基因的表达的实例，见Napoli等人, The Plant Cell 2:279-289 (1990); Flavell， Proc. Natl. Acad. Sci，USA 91:3490-3496 (1994); Kooter和Mol， Current Opin. Biol. 4:166-171 (1993);和美国专利号5， 034， 323、 5， 231， 020和 5， 283， 184。
通常，当希望抑制表达时，发生所导入的基因的一定转录。当所 导入的序列不含有编码序列本身，但是在内源序列的初级转录物中仅 存在与序列同源的内含子或者不相关序列时，可以发生所述效应。所 导入的序列一般将与意在抑制的内源序列实质性同一。最小的同一性 将通常大于约65%，但是更高的同一性可以对内源序列的表达发挥更 有效的抑制。优选大于约80%的基本上更大的同一性，尽管约95%到 决定同一性将是最优选的。关于反义调节，该效应将应用于显示出同 源性或者基本同源性的基因的相似家族内的任何其他蛋白质。
对于有义抑制，表达盒中导入的序列(需要小于决定同一性)也 不必相对于初级转录产物或者完全加工的mRNA是全长的。这可以优选 通常同时产生作为过表达者的一些植物。短于全长序列中的较高同一 性弥补较长的、同一性较低的序列。此外，导入的序列不必具有相同 的内含子或者外显子模式，非编码区段的同一性将同样有效。通常， 使用上面关于反义调节提到的大小范围的序列。
还可以通过RNA干扰(RNAi)抑制内源基因表达，RNAi使用具有 与耙基因的序列相同或相似的序列的双链RNA。 RNAi是这样的现象， 其中当具有与耙基因相同或相似的序列的双链RNA导入细胞时，所插 入的外源基因和耙标内源基因的表达都受到抑制。双链RNA可以从两 个分开的互补冊A形成或者可以是具有形成双链RNA的内部互补的单 个RNA。尽管RNAi的机理的细节仍然未知，但是认为所导入的双链RNA 最初被切割长小片段，其然后以某种方式作为靶基因的指标，从而降 解靶基因。已知RNAi在植物中也是有效的(见，例如，Chuang， C. F. & Meyerowitz， E. M. ， Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 4985 (2000); Waterhouse等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:13959-13964 (1998); Tabara等人.Science 282:430-431 (1998))。例如，为了用RNAi实 现编码蛋白质的DNA表达的抑制，将目的植物中导入双链RNA，其具有 编码该蛋白质的DNA的序列或者其基本相似的序列(包括不是为了翻译该蛋白质而工程化的序列)。然后可以对所得植物筛选与靶蛋白相关 的表型和/或通过监视稳态RNA水平筛选编码该蛋白质的转录物。尽管
用于RNAi的基因不必与靶基因完全相同，但是它们与靶基因序列具有 至少70%、 80%、 90%、 95%或者更高的同一性。见例如，美国专利 公布号2004/0029283。编码具有与靶基因无关并且与目的基因特异的 序列相距甚远的的茎环结构的RNA分子的构建体可以用于抑制靶基因 表达。见例如，美国专利公布号2003/0221211。
RNAi多核苷酸可以包括全长靶RNA或者可以对应于靶RNA的片段。 在一些情况中，片段将具有对应于靶序列的少于100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900或1， 000个核苷酸。此外，在一些实施方案 中，这些片段长为至少例如50、 100、 150、 200或者更多核苷酸。在 一些情况中，用于腦Ai的片段将与靶蛋白的在生物中其他蛋白质中不 发生的区域至少基本上相似或者可以选择使得与其他生物转录物的相 似性尽可能小，例如，通过在分析公众可利用的序列数据库中与序列 比较来选择。从而，可以根据与本发明的IND1或者BIND1序列的N末 端区域的相似性或者同一性(即，那些序列与数据库中的序列缺少显 著同源性)或者可以根据与bHLH结构域的编码序列或者至少将IND1 bHLH结构域与其他bHLH结构域蛋白质区别的同一性或者相似性来选 择RNAi片段。
在瞬时和稳定转染的宿主中连续表达siRNA的表达载体己经经工 程化而表达小发夹RNA，其在体内加工成能够进行基因特异沉默的 siRNA分子(Brummelkamp等人，Science 296:550-553 (2002),和 Paddison，等人，Genes & Dev. 16:948-958 (2002))。通过双链RNA 进行转录后基因沉默由Hammond等人，Nature Rev Gen 2: 110-119 (2001)， Fire等人，Nature 391: 806-811 (1998)和Ti腿ons和 Fire Nature 395: 854 (1998)中进一步详细描述。
本领域技术人员将认识到使用基于特异核苷酸序列的技术(例如， 反义或者有义抑制技术)，可以用单个有义或者反义转录物抑制同源基 因家族。例如，如果设计有义或者反义转录物以具有在基因家族中保 守的序列，那么可以抑制基因家族的多个成员。相反地，如果目的仅是抑制同源基因家族的一个成员，那么有义或者反义转录将靶定在家 族成员间具有最大差异的序列。
抑制植物中IND1功能的另一种方法是通过产生显性失活突变，在 该方法中，向植物中导入无功能的突变IND1多肽，其保留与野生型亚 基相互作用的能力。显性失活构建体还可以用于抑制植物中的IND1表 达。用于本发明的显性失活构建体通常含有完整IND1编码的一部分， 其足够例如用于DNA结合或者蛋白质一蛋白质相互作用，如同源二聚 体或者异源二聚体蛋白质一蛋白质相互作用，但是缺少野生型蛋白质 的转录活性。例如，AGAM0US的羧基末端缺失突变体用作显性失活构建 体以抑制MADS盒基因AGAM0US的表达(Mizukami等人，Plant Cell 8:831-844 (1996))。本领域技术人员理解，显性失活IND1构建体类 似地可以用于抑制植物中IND1表达。
B. 本发明的核酸用于增强基因表达
本文描述制备的分离的序列还可以用于制备增强或者增加内源 IND1基因表达的表达盒。当希望基因过表达时，来自不同物种的所希 望的基因可以用于降低潜在的有义抑制效果。IND1多核苷酸的增强的 表达可用于例如产生具有小果实的植物。
本领域公知的多种方法的任一种可以用于增加植物中IND1活性。 可以靶定任何器官，如枝条营养器官/结构(例如，叶、茎干和块茎)、 根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药 和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实。备选地，可以组成性 表达一种或几种IND1基因(例如，使用CaMV 35S启动子)。
本领域技术人员将认识到询其他蛋白质一样，本发明的基因编码 的多肽具有不同的结构域，其进行不同的功能。从而，基因序列不必 是全长，只要表达蛋白质的所希望的功能结构域。如上面解释，IND1 多肽携带bHLH结构域，其能够结合DNA。从而，不被任何具体理论或 者机理束缚，頂D1可能作为转录调节基因。
C. 内源頂D1基因的修饰用于向植物基因导入遗传突变和选择具有所希望的性状的植物的 方法是公知的。例如，种子或者其他植物材料可以根据标准技术用诱 变性化学物质处理。此类化学物质包括但不限于下面的硫酸二乙酯、 亚乙基亚胺、甲磺酸乙酯和N-亚硝基一N-乙基脲。备选地，可以使用 来自诸如X射线或者Y射线的来源的电离辐射。
还可以利用本领域技术人员公知并且例如在Sambrook等人，上文 中描述的多种重组DNA技术容易地设计经修饰的蛋白质链。羟胺也可 以用于向基因的编码区导入单个碱基突变(Sikorski，等人，(1991). Meth. Enzymol. 194: 302-318)。例如，链可以在一级结构水平上通 过氨基酸替代、添加、缺失等等从天然发生的序列改变。这些修饰可 以用于许多组合中以产生最终修饰的蛋白质链。
备选地，同源重组可以通过在体内靶定頂D1基因用于诱导耙基因 修饰(一般见Grewal和Klar， Genetics 146: 1221-1238 (1997) and Xu等人，Genes Dev. 10: 2411-2422 (1996))。已经在植物中阐明的 同源重组(Puchta等人，Experientia 50: 277-284 (1994)， Swoboda等 人，EMBOJ. 13: 484-489 (1994); 0ffringa等人，Proc. Natl. Acad. Sd. USA 90: 7346-7350 (1993);和Kemp in等人，Nature 389:802-803 (1997))。
在将同源重组技术应用于本发明的基因中，在体外在如本文描述 的IND1基因序列的所选部分(包括5'上游、3'下游和基因内区域) 中产生突变，然后使用标准技术将所述突变引入所希望的植物中。因 为已知同源重组的效率依赖于所用的载体，所以如Mountford等人， Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 : 4303- 4307 (1994);和Vaulont等 人，，Transgenic Res. 4: 247-255 (1995)描述的dicistronic基因 靶定载体方便地用于增加在转基因植物中选择改变的INDl基因表达的 效率。突变的基因将与靶标野生型基因以这样的方式相互作用使得在 转基因植物细胞中将发生同源重组和野生型基因的定向置换，导致 INDl活性的抑制。
备选地，可以使用由双链体构象中RNA和DNA残基的连续一段序 列组成的寡核苷酸，其在末端具有双发夹帽。设计RNA/DNA序列与靶标IND1基因的序列比对以含有所希望的核苷酸改变。在染色体外
T-DNA质粒上导入嵌合寡核苷酸导致通过少数所转化的植物细胞中的 嵌合分子指导的有效和特异的IND1基因转变。该方法描述于 Cole-Strauss等人，Science 273:1386-1389 (1996)和Yoon等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2071-2076 (1996)。
在其他实施方案中，来自本发明的IND1基因的启动子可以用于以 瓣膜边缘特异的方式驱动异源基因的表达。可以用于该目的的合适的 结构基因包括编码如下讨论的细胞毒性蛋白质的基因。
通常，通过分析对应于这里描述的TND1基因的基因组克隆的5' 序列鉴定所希望的启动子。启动子序列特征性序列可以用于鉴定启动 子。已经广泛研究了控制真核基因表达的序列。例如，启动子序列元 件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常是转录起始位点上游的20 到30个碱基对。在多数情况中，TATA盒是准确转录起始所需的。在植 物中，TATA盒进一步上游一80到一10位处，通常具有启动子元件，其 具有围绕三核苷酸G(或者T)NG的一系列腺嘌呤。J. Messing等人， GENETIC ENGINEERING IN PLANTS, 221-227页(Kosage， Meredith和 Hollaender， eds. (1983))。
本领域技术人员己知许多方法可以用于鉴定和表征植物基因组 DNA中的启动子区(见，例如，Jordano，等人，Plant Cell, 1 : 855-866 (1989); Bustos，等人，Plant Cell, 1 :839—854 (1989); Green，等 人，EMBO J. 7, 4035-4044 (1988) ; Meier，等人，Plant Cell, 3， 309-316 (1991);和Zhang,等人，Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996))。
IV.重组载体的制备
为了使用上面技术中分离的序列，制备适于转化植物细胞的重组 DNA载体D适于转化多种高等植物物种的技术是公知的并且描述于技术 和科学文献中。见，例如，Weising等人Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988)。编码所希望的多肽的DNA序列，例如，编码全长蛋白质的cDNA 序列将优选与转录和翻译起始调节序列组合，所述调节序列在所转化的植物的预期的组织中指导所述序列从基因的转录。
例如，为了过表达，可以使用植物启动子片段，其将在再生的植 物的所有组织中指导基因的表达。此类启动子在本文中称作"组成型" 启动子并且在多数环境条件和发育或者细胞分化状态下是有活性的。
组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S转录起始区、来 自根癌农杆菌(^ro6scz^rj'咖t"鹏/scj'e/7s)的T-DNA的1'-或者T 一启动子，和来自技术人员己知的多种植物基因的其他转录起始区。
备选地，植物启动子可以指导特定组织中本发明多核苷酸的表达 (组织特异性启动子)或者可以处于更精确的环境控制下(诱导型启 动子)。处于发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅在一些组 织，如果实、种子或者花中启动转录的启动子。如上面提到的，来自 本文描述的IND1基因的启动子尤其可用于指导基因表达，从而所希望 的基因产物位于果实的瓣膜边缘。其他合适的启动子包括来自诸如 SHP1或者SHP2的基因的启动子(Savidge， B. ， Rounsley， S. D.，和 Yanofsky， M. F. (1995) Plant Cell 7: 721-733)。可以影响诱导型 启动子的转录的环境条件的实例包括无氧条件、升高的温度，或者光 的存在。
如果希望合适的多肽表达，将包括编码区3'末端的多腺苷酸化 区域。多腺苷酸化区域可以来自天然基因、来自多种其他植物基因， 或者来自T-DNA。
包含来自本发明的基因的序列(例如，启动子或者编码区)的载
体将通常包含标记基因，其赋予植物细胞可选择的表型。例如，标记 可以编码杀生物剂抗性，尤其抗生素抗性，如对卡那霉素、G418、博 来霉素、潮霉素的抗性，或者除草剂抗性，如对chlorosluforon或者 Basta的抗性。
本发明的IND1核酸序列在植物细胞中重组表达以增强和增加内 源IND1多肽的水平。备选地，反义或者其他IND1构建体(上述)用 于抑制IND1表达水平。可以制备适于转化植物的多种不同的表达构建 体，如表达盒和载体。用于转化多种高等植物物种的技术是公知的并 且在技术和科学文献中描述。见，例如，Weising等人Ann. Rev. Genet.22:421-477 (1988)。编码IND1多肽的DNA序列，例如，编码全长蛋 白质的cDNA序列，可以与顺式作用(启动子)和反式作用(增强子) 转录调节序列组合以指导所转化的植物的预期的组织中转录的定时、 组织类型和水平。还可以使用翻译控制元件。
本发明提供了与启动子有效连接的IND1核酸，在优选实施方案 中，所述启动子能够驱动植物中IND1编码序列的转录。启动子可以例 如，来自植物或者病毒来源。启动子可以例如，是组成性活性的、可 诱导的或者组织特异的。在本发明的重组表达盒、载体和转基因的构 建中，可以选择不同的启动子并用于差别地指导例如，在植物或动物 的一些或者所有组织中的基因表达。通常，如上述，通过分析对应于 本文描述的IND1基因的基因组克隆的5'序列鉴定所希望的启动子。
A.组成型启动子
可以使用启动子片段，其将指导所有转化的细胞或组织，如再生 的植物的细胞或组织中IND1核酸的表达。术语"组成型调节元件"指 一种调节元件，其对有效连接的核酸分子赋予的表达水平相对独立于 该组成型调节元件在其中表达的细胞或者组织类型。在植物中表达的 组成型调节元件通常在许多细胞和组织类型中广泛表达。驱动在生理 条件下连续表达的启动子称作"组成型"启动子并且在环境条件和发 育或者细胞分化状态下具有活性。
用于转基因植物中异位表达的多种组成型调节元件是本领域公知 的。例如，花椰菜花叶病毒35S (CaMV 35S)启动子是良好表征的组成 型调节元件，其在所有植物组织中产生高水平的表达(Odell等人， Nature 313:810-812 (1985))。 CaMV 35S启动子由于其在多种不同的 植物物种中的活性而尤其有用(Benfey和Chua， Science 250:959-966 (1990); Futterer等人，Physiol. Plant 79:154 (1990); Odell等 人，上文，1985)。串联35S启动子(其中内在的启动子元件已经复制) 与未修饰的35S启动子相比赋予较高的表达水平(Kay等人，Science 236:1299 (1987))。其他有用的组成型调节元件包括例如，花椰菜花 叶病毒19S启动子；玄参花叶病毒启动子；和胭脂氨酸合酶(nos)基因启动子(Singer等人，Plant Mol Biol 14:433 (1990); An, Plant Physiol. 81:86 (1986))。
额外的组成型调节元件，包括用于在单子叶植物中有效表达的组 成型调节元件是本领域已知的，例如，pEmu启动子和基于稻肌动蛋白 —15，区的启动子(Last等人，Theor. Appl. Genet. 81:581 (1991); Mcelroy等人，Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991); Mcelroy等人， Plant Cell 2:163 (1990))。组合来自不同基因的元件的嵌合型调节 元件也可以用于异位表达编码頂Dl多核苷酸的核酸分子(Comai等人， Plant Mol Biol 15:373 (1990))。
组成型启动子的其他实例包括来自根癌农杆菌的T-DNA的1' -或 者2，-启动子(见，例如，Mengiste (1997)上文；0， Grady (1995) Plant Mol. Biol. 29:99-108);肌动蛋白启动子，如拟南芥肌动蛋白 基因启动子(见，例如，Huang (1997) Plant Mol. Biol. 1997 33:125-139);醇脱氢酶(Adh)基因启动子(见，例如，Millar (1996) Plant Mol. Biol. 31:897-904);来自拟南芥的ACTll (Huang等人Plant Mol. Biol. 33:125-139 (1996))，来自拟南芥的Cat3 (GenBank No. U43147, Zhong等人，Mol. Gen. Genet. 251:196-203 (1996))，编码 欧洲油菜的硬脂酰一酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank No. X74782, Solocombe等人Plant Physiol. 104:1167-1176 (1994))，来 自玉米的GPcl (GenBank No. X15596, Martinez等人J. Mol Biol 208:551-565 (1989))，来自玉米的Gpc2 (GenBank No. U45855, Manjunath等人，Plant Mol Biol. 33:97-112 (1997))，本领域技术 人员己知的来自多种植物基因的其他转录启动区。还参见Holtorf Plant Mol Biol. 29:637—646 (1995)。
B.诱导型启动子
备选地，在改变的环境条件或者发育条件下，植物启动子可以指 导本发明的INDl核酸的表达。可以影响诱导型启动子转录的环境条件 的实例包括无氧条件、升高的温度、干旱或者光的存在。此类启动子 在本文中称作"诱导型"启动子。例如，本发明并入玉米的干旱诱导型启动子(Busk (1997)上文)；和来自马铃薯的寒冷、干旱和高盐诱 导型启动子(Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909)。
任选地，当暴露于植物激素(如生长素)时可诱导的植物启动子 用于表达本发明的核酸。例如，本发明可以使用大豆(Glycine max L.) 中的生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407);生长素应答性拟南芥GST6启动子(也应答 水杨酸和过氧化氢)(Chen (1996) Plant J. 10: 955-966);来自烟草 的生长素诱导型parC启动子(Sakai (1996) 37:906-913);植物生物素 应答元件(Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); 和应答胁迫激素脱落酸的启动子(Sheen (1996) Science 274:1900-1902)。
当暴露于可以应用于植物的化学试剂如除草剂或者抗生素时可诱 导的植物启动子也可以用于表达本发明的核酸。例如，可以使用玉米 In2-2启动子，其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活(De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577);应用不同的除草剂安全剂诱导不 同的基因表达模式，包括在根、排水器和枝条顶端分生组织中表达。 IND1编码序列也可以处于例如四环素可诱导的启动子的控制下，如用 含有燕麦(Avena sativa L.)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草所描述 的(Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473);或者处于水杨酸应答元 件的控制下(Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324; Uknes等人， Plant Cell 5:159-169 (1993) ; Bi等人，Plant J, 8:235-245 (1995))。
尤其有用的诱导型调节元件包括铜诱导型调节元件(Mett等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4567-4571 (1993); Furst等人，Cell 55:705-717 (1988));四环素和氯代四环素诱导型调节元件(Gatz等 人，Plant J. 2:397-404 (1992); R5der等人，Mol. Gen. Genet. 243:32-38 (1994); Gatz， Meth. Cell Biol. 50:411-424 (1995)); 蜕皮激素诱导型调节元件(Christopherson等人，Proc. Natl. Acad. Sci， USA 89:6314—6318 (1992); Kreutzweiser等人，Ecotoxicol. Environ. Safety 28:14-24 (1994));热休克诱导型调节元件 (Takahashi等人，Plant Physiol. 99:383-390 (1992); Yabe等人，Plant Cell Physiol. 35:1207- 1219 (1994); Ueda等人，Mol. Gen-Genet. 250:533-539 (1996));和lac操纵子元件，其与组成型表达的 lac抑制子组合赋予例如IPTG诱导型表达(Wilde等人，EMBO J. 11:125卜1259 (1992))。用于本发明的转基因植物中的诱导型调节元 件还可以是例如来自菠菜亚硝酸盐还原酶基因的硝酸盐诱导型启动子 (Back等人，Plant Mol. Biol. 17:9 (1991))或者光诱导型启动子， 如与RuBP羧化酶的小亚基结合的启动子或者LHCP基因家族(Feinbaum 等人，Mol. Gen. Genet. 226:449 (1991); Lam and Chua， Science 248:471 (1990))。
C.组织特异性启动子
备选地，植物启动子可以指导特定组织中本发明的多核苷酸的表 达(组织特异性启动子)。组织特异性启动子是在植物发育期间仅在特 定时间在特定细胞或者组织，如在营养组织或繁殖组织中有活性的转 录控制元件。来自本发明的IND1基因的启动子尤其可用于基因表达的 组织特异性指导从而仅仅或者优先在如下述的胚或者种子中产生所希 望的基因产物。
处于发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅在(或者主要 在)某些组织中启动转录的启动子，所述组织为诸如营养组织，如根 或者叶，或者繁殖组织，如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊、花，或 者任何胚组织。繁殖组织特异性启动子可以是例如，胚珠特异的、胚 特异的、胚乳特异的、珠被特异的、种子和种皮特异的、花粉特异的、 花瓣特异的、萼片特异的，或者其一些组合。
本发明提供了转基因植物，其特征是延迟的种子散布，这是由于 有效连接开裂区选择性调节元件的编码IND1基因产物的核酸分子，或 者其反义构建体的表达。开裂区选择性调节元件可以是例如，SHPl调 节元件或者SHP2调节元件。SHPl调节元件可以来自如本文公开为SEQ ID NO: 5的拟南芥SHP1基因组序列并且可以是例如，5'调节序列或 者内含子调节元件。类似地，SHP2调节元件可以来自如本文公开为SEQ ID NO: 6的拟南芥SHP2基因组序列并且可以是例如，5'调节序列或者内含子调节元件。
开裂区选择性调节元件可以来自为拟南芥IND1的直向同源物的 基因并且在种子植物的瓣膜边缘或者开裂区中选择性表达。开裂区选
择性调节元件可以例如来自十字花科的IND1直向同源物，如欧洲油菜
(Bmssica napus)、 Brassica oleracea、 Bmssica campestris、 Brassica juncea、 Brassica nigra或Brassica carinata INDl直向 同源物。开裂区选择性调节元件可以例如来自INDl芸苔直向同源物。 开裂区选择性调节元件还可以来自例如豆科INDl直向同源物，如大豆、 豌豆、鹰嘴豆、moth bean、蚕豆、菜豆、利马豆、小扁豆、豇豆、干 豆(dry bean)、花生、苜蓿、紫花苜蓿、birdsfoot trefoil、三叶 草、铅笔花、lotononis bainessii或者驴食草INDl直向同源物。
开裂区选择性调节元件还可以来自在种子植物的瓣膜边缘或者开 裂区中选择性表达的多种其他基因。例如，油菜基因RDPG1在开裂区 中选择性表达(Petersen等人，Plant Mol. Biol. 31:517-527 (1996))。从而，PDPGl启动子或者其活性片段可以是如本文定义的开 裂区选择性调节元件。额外的基因，如油菜基因SAC51也己知在开裂 区中选择性表达；SAC51启动子或者其活性片段是本发明的开裂区选择 性调节元件(Coupe等人，Plant Mol. Biol. 23:1223-1232 (1993))。 技术人员理解在瓣膜边缘或者开裂区的细胞中选择性表达的任何此类 基因的调节元件可以是如本文定义的开裂区选择性调节元件。
可以使用常规方法鉴定和分离额外的开裂区选择性调节元件。使 用例如从开裂区制备的認A和从相邻的豆荚材料制备的RNA，差别筛选 策略可以用于分离在开裂区的细胞中选择性表达的cDNA(Coupe等人， 上文，1993);随后，用所述cDNA序列作为探针分离对应的基因。
增强子陷阱或者基因陷阱策略也可以用于鉴定和分离本发明的开 裂区选择性调节元件(Sundaresan等人，上文，1995; Koncz等人， Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:8467-8471 (1989); Kertbundit等 人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:5212-5216 (1991); Topping等 人，Development 112:1009- 1019 (1991))。增强子陷阱元件包括报 告基因(如GUS)，其具有弱的或者最小的启动子，而基因陷阱元件缺少启动子元件，依赖从侧翼的染色体基因转录用于报告基因表达。构 建体中包括的转座元件介导与内源基因座的融合；在瓣膜边缘或者开
裂区中选择性表达的构建体通过它们的表达模式鉴定。以插入的元件
作为标记，使用例如，反向聚合酶链式反应方法(见，例如，Aarts等 人，Nature 363:715-717 (1993);还参见Ochman等人，"Amplification of Flanking Sequences by Inverse PCR， 〃 in Innis等人，上文，1990) 克隆侧翼开裂区选择性调节元件。Sundaresan等人，Genes. Devel. 9:1797-1810 (1995)的Ac/D转座系统尤其可用于鉴定和分离本发明的 开裂区选择性调节元件。
通过在无启动子的报告基因的前面插入随机基因组DNA片段的文 库并对用文库转化的转基因植物筛选开裂区选择性报告基因表达，也 可以分离开裂区选择性调节元件。无启动子的载体pR0A97可以用于此 类筛选，所述载体含有都处于最小35S启动子控制下的npt基因和GUS 基因。基因组文库可以是例如拟南芥基因组DNA或者来自例如另一目 的十字花科植物的基因组DNA的Sau3A片段(0tt等人，Mol. Gen-Genet. 223:169-179 (1990); Claes等人，The Plant Journal 1:15-26 (1991))。
通过常规技术，例如，使用报告基因和原位表达分析，可以阐明 或者证明本发明的调节元件的开裂区选择性表达。GUS和萤火虫萤光素 酶报告基因尤其可用于植物基因表达的原位定位(Jefferson等人， EMB0 J. 6:3901 (1987); Ow等人，Science 334:856 (1986))，并且 含有GUS表达盒的无启动子的载体可通过商业途径得到，例如，从 Clontech (Palo Alto， CA)得到。为了鉴定目的开裂区选择性调节元 件，如IND1调节元件，用基于酶或者PCR的方法可以产生INDl基因 的一个或多个核苷酸部分(Glick和Thompson,上文，1993; Innis等 人，上文，1990);所得片段融合到报告基因如GUS，并如上述进行分 析。
其他组织特异性启动子包括种子启动子。合适的种子特异性启动 子来自下面的基因来自玉米的MACl (Sheridan (1996) Genetics 142:1009-1020);来自玉米的Cat3(GenBankNo. L05934, Abler (1993)Plant Mol. Biol. 22:10131-1038);来自拟南芥的 vivparous—l(Genbank No. U93215);来自拟南芥的atmycl (Urao (1996) Plant Mol. Biol. 32:571-57; Conceicao (1994) Plant 5:493-505); 来自欧洲油菜的napA(GenBank No. J02798, Josef sson (1987) JBL 26:12196-1301);和来自欧洲油菜的napin基因(Sjodahl (1995) Planta 197:264-271)。
在营养组织(如叶、茎干、根和块茎)中特别有活性的多种启动 子也可以用于表达本发明的IND1核酸。例如，可以使用控制patatin (马铃薯块茎的主要贮藏蛋白)的启动子，见，例如，Kim (1994) Plant Mol. Biol. 26:603—615; Martin (1997) Plant丄11 :53—62。还可 以使用来自毛根农杆菌(^roZ scz^ri鹏r力j'^^e/7")的0RF13启动 子，其在根中显示出高活性(Hansen (1997) Mol. Gen. Genet. 254:337-343)。其他有用的营养组织特异性启动子包括编码来自主 要芋头(Colocasia esculenta L. Schott)球茎蛋白质家族的球蛋白 tarin的基因的tarin启动子(Bezerra (1995) Plant Mol. Biol. 28:137-144);在芋头球茎发育中有活性的仙茅甜蛋白启动子(de Castro (1992) Plant Cell 4:1549-1559)和来自烟草根特异的基因 TobRB7的启动子，其表达定位于根分生组织和未成熟的中心柱区域 (Yamamoto (1991) Plant Cell 3:371-382)。
还可以使用叶特异的启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)。例 如，番茄RBCS1、 RBCS2和RBCS3A基因在叶子和光线下生长的幼苗中 表达，仅仅RBCS1和RBCS2在正发育的番茄果实中表达(Meier (1997) FEBS Lett. 415:9卜95)。可以使用几乎仅在叶片和叶鞘中叶肉细胞中 以高水平表达的核酮糖二磷酸羧化酶启动子，其由Matsuoka (1994) Plant J. 6:311-319描述。另一种叶特异的启动子是光收获叶绿素a/b 结合蛋白基因启动子，见，例如，Shiina (1997) Plant Physiol. 115:477-483; Casal (1998) Plant Physiol. 116:1533—1538。 Li (1996) FEBS Lett. 379:117-121描述的拟南芥myb相关的基因启动子(Atmyb5) 是叶特异的。Atmyb5启动子在正发育的叶细胞毛状体、托叶和幼莲座 叶丛和茎生叶的边缘上的表皮细胞，和在未成熟的种子中表达。Atmyb5mRNA在受精和胚发育的16细胞期之间出现并且坚持过心期。还可以使 用由Busk (1997) Plant J I 1 : 1285-1295在玉米中鉴定的叶启动 子。
另一类有用的营养组织特异的启动子是分生组织(根尖和苗端) 启动子。例如，可以使用Di Laurenzio (1996) Cell 86:423- 433;和 Long (1996) Nature 379:66-69描述的〃SH00TMERISTEMLESS〃和 〃SCARECROW〃启动子，它们在正发育的枝条和根顶端分生组织中有活 性。另一种有用的启动子是控制3 —羟基一3—甲基戊二酰辅酶A还原 酶HMG2基因的表达的启动子，所述基因的表达局限于分生组织和花组 织(柱头分泌区、成熟花粉粒、雌蕊维管组织和受精的胚珠)(见，例 如，Enjuto (1995) Plant Cell. 7:517-527)。还可以使用来自玉米 和显示出分生组织特异性表达的knl —相关的基因，见，例如，Granger (1996) Plant Mol. Biol. 31:373-378; Kerstetter (1994) Plant Cell 6:1877-1887; Hake (1995) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350:45-51。例如，拟南芥KNAT1启动子。在苗端，KNATl转录物 主要位于枝条顶端分生组织；枝条分生组织中KNATl的表达在花转变 期间减小并且局限于花序茎干的外皮中(见，例如，Lincoln (1994) Plant Cell 6:1859-1876)。
技术人员将认识到组织特异性启动子可以驱动除了靶组织的组织 中有效连接的序列的表达。从而，如本文所用的，组织特异性启动子 是驱动优先在靶组织中表达的启动子，但是还可以在其他组织中导致 一定的表达。
在另一实施方案中，IND1核酸通过转座元件表达。这允许组成性 活性多肽的组成型地、然而周期性和不频繁地表达。本发明还提供了 来自病毒的组织特异性启动子的应用，所述启动子可以包括例如，烟 草花叶病毒亚基因组启动子(Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 92:1679-1683);稻东格鲁杆状病毒(RTBV)，其仅在受感染的稻植 物中韧皮部细胞中复制，它的启动子驱动强烈的韧皮部特异性报告基 因表达；木薯叶脉花叶病毒(CVMV)启动子，其在维管成分、叶子的 叶肉细胞和根尖中具有最高活性(Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol.31:1129-1139)。
V.转基因植物的产生
本发明的DNA构建体可以通过多种常规技术导入所希望的植物宿 主的基因组中。例如，可以用诸如电穿孔或者植物细胞原生质体的微 注射等技术向植物细胞的基因组DNA中直接导入DNA构建体，或者用 生物射弹方法，如DNA微粒轰击，向植物组织中直接导入DNA构建体。 备选地，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区组合并导入常规的根癌 农杆菌宿主载体。当细胞受到根癌农杆菌感染时，根癌农杆菌宿主的 毒性功能将指导载体和相邻标记插入植物细胞DNA中。
微注射技术是本领域公知和科学和专利文献中详细描述的。用聚 乙二醇沉淀导入DNA构建体在Paszkowski等人EMB0 J. 3:2717-2722 (1984)中描述。电穿孔技术在Fromm等人Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:5824 (1985)中描述。生物射弹转化技术在Klein等人Nature 327:70-73 (1987)中描述。
根癌农杆菌介导的转化技术，包括disarming和双元载体的使用， 在科学文献中详细描述。见例如，Horsch等人Science 233:496-498 (1984)，和Fraley等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983)。
通过任一种上述转化技术得到的转化的植物细胞可以经培养而再 生完整植物，其具有所转化的表型从而具有所希望的表型，如无种子。 此类再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，通 常依赖于与所希望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂(biocide)和/ 或除草剂标记。从培养的原生质体再生植物描述于Evans等人， Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176， MacMillilan Publishing Company, New York, 1983;禾口 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73， CRC Press, Boca Raton, 1985。再生还可以从植物愈伤组织、 外植体、器官或者其部分得到。此类再生技术一般描述于Klee等人Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987)。
本发明的核酸可以用于对基本上任何植物赋予所希望的性状。从而，本发明可用于宽范围的植物，包括来自天门冬属(Asparagus)、 颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑桔属 (Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(C即sic咖)、黄瓜属 (Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、草莓属 (Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、 向日葵属 (Helianthus)、 (Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、莨菪属 (Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属 (Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属 (Manihot)、 (Majorana)、首菅属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、 稻属(0ryza)、 (Panieum)、 (Pannesetum)、鍔梨属(Persea)、 (Pisum)、 梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、 千里光属(Senecio)、芥属(Si卿is)、茄属(Solanum)、蜀黍属 (Sorghum)、胡戸巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、葡萄属 (Vitis)、 (Vigna)、和玉蜀黍属(Zea)的物种。本发明的有用的植 物可以是开裂种子植物，本发明的尤其有用的植物可以是十字花科植 物成员，如油菜，或者豆科植物成员，如大豆、豌豆、小扁豆或者豆 植物。
在一个实施方案中，本发明提供了特征是延迟的种子散布的开裂 的种子植物，这是由于在开裂的种子植物中编码頂D1基因产物的核酸 分子的受抑制的表达。本文所用的术语"开裂的种子植物"指产生干 燥的开裂果实的植物，所述果实的果实壁打开而允许释放其中含有的 种子。开裂的果实通常含有一些种子并且包括已知为例如豆荚、朔果 和长角果的果实。
在一个实施方案中，本发明提供了由于编码IND1基因产物的核酸 分子(例如，与SEQIDN0s:2、 9或10基本上同一)的受抑制的表达 而特征为延迟的种子散布的植物，其中所述植物是芸苔属
(^^sWcaceae)的成员。芸苔属(通常称作芸苔)是一组多样的作 物植物，它们在世界上具有巨大的经济价值(见，例如，Williams和 Hill, Science 232:1385-1389 (1986)，将其引入作为参考)。芸苔属 产生种子油用于人造黄油、色拉油、烹饪油、塑料和工业应用；调味品芥菜；多叶、贮藏的、经加工的和腌制的蔬菜；用于土壤恢复的动 物饲料和绿肥。本发明的尤其有用的非天然发生的芸苔植物是油籽植 物芸苔。
有六类主要的具有经济上的重要性的芸苔种类，每一类含有一系 列植物形式。欧洲油菜包括诸如油菜和芜菁甘蓝的植物。甘蓝为油菜
作物，如巻心菜、花椰菜、羽衣甘蓝、大头菜和抱子甘蓝。芸苔(Brassica
campestris)(芜菁(Brassica rapa))包括诸如大白菜、芜菁(turnip) 禾口 pak choi的植物。Brassica juncea包括多禾中芥菜。Brassica juncea 是黑芥；并且Brassica caxinata是Ethiopian mustard。技术人员理
解可以如本文公开的修饰芸苔属的任何成员以产生特征是延迟的种子 散布的非天然发生的芸苔植物。
在另一实施方案中，本发明提供了特征是由于编码IND1基因产物 的核酸的受抑制的表达而具有延迟的种子散布的植物，其中该植物是 豆科的成员。豆科通常已知为豆科的成员，是产生已知为豆荚的特征 性干燥开裂果实的植物。豆荚来自单个心皮并且沿着心皮边缘的缝和 沿着中脉开裂。豆科包括谷类豆类和饲料豆类。谷类豆类包括例如， 大豆(glycine)、豌豆、鹰嘴豆、moth bean、蚕豆、菜豆、禾!j马豆、 小扁豆、豇豆、dry bean和花生。饲料豆类苜蓿、紫花苜蓿、birdsfoot trefoil、三叶草、铅笔花、lotononis bainessii和驴食草。技术人 员将认识到可以如本文公开的修饰豆科的任意成员以产生特征是延迟 的种子的本发明的天然发生的植物。
特征是延迟的种子散布的本发明的非天然发生的植物也可以是 Cuphea属(千屈菜科)的成员。Cuphea植物尤其有价值，因为Cuphea
种子含有工业上和营养上重要的中等链脂肪酸，特别是月桂酸，其当 前仅由椰子油和棕榈仁油提供。
本发明的非天然发生的植物还可以是例如，单子叶禾本科植物之 一，其产生世界上许多有价值的小谷粒谷物作物。如上述IND1表达的 抑制可以用于产生特征是延迟的种子散布的非天然发生的小谷粒谷物 作物，如大麦、小麦、燕麦、黑麦、果园草、几内亚草、高粱或者草 地草植物。VI.调节种子散布的额外修饰
将认识到含有外源IND1多核苷酸的本发明的植物还可以含有一 种或多种额外的修饰，包括天然的和非天然发生的修饰，其可以调节 种子散布的延迟。例如，植物激素乙烯促进果实开裂，并且本发明的 植物中可以包括乙烯应答的正或负调节子的经修饰的表达或活性(一
般见，Meakin和Roberts, J. Exp. Botany 41: 1003-1011 (1990); Ecker， Science 268:667-675 (1995); Chao等人，Cell 89: 1133-1144 (1997))。
乙烯应答的正调节基因的突变显示对用外源乙烯处理的应答性的 减小或缺失。拟南芥的乙烯应答的正调节基因中的突变包括etr的突 变，其失活组氨酸激酶乙烯受体(Bleeker等人，Science 241: 1086-1089 (1988); Schaller和Bleeker， Science 270:1809-1811 (1995)); ers (Hua等人，Science 269:1712- 1714 (1995)); ein2 (Guzman禾口 Ecker， Plant Cell 2:513 (1990)); ein3 (Rothenberg 禾卩Ecker， Sem. Dev. Biol. Plant Dev. Genet. 4:3-13 (1993); Kieber 禾口 Ecker， Trends Genet. 9:356-362 (1993)); ainl (van der Straeten 等人，Plant Physiol 102:401-408 (1993)); eti (Harpham等人，An. Bot. 68:55 (1991))和ein4、 ein5、 ein6禾卩ein7 (Roman等人' Genetics 139: 1393-1409 (1995))。在其他植物物种中发现类似的基 因功能；例如，永不成熟突变对应于etr并且赋予番茄中的乙烯不敏 感性(Lanahan等人，The Plant Cell 6:521-530 (1994); Wilkinson 等人，Science 270:1807- 1809 (1995))。本发明的植物可以包括修 饰，其导致乙烯应答的任何此类正调节基因的改变的表达或活性。正 调节基因中的突变例如可以包括在本发明的植物中并且可以例如，通 过进一步推迟种子散布的延迟而改变此类植物中种子散布的延迟。
乙烯应答的负调节基因中的突变在不存在外源乙烯时显示出乙烯 应答性。此类突变包括涉及乙烯过量产生的突变，例如，etol、 eto2 和eto3突变体，和涉及乙烯信号途径的组成型活性的突变，如CTRl 中的突变，CTRl是与Raf家族的蛋白激酶具有序列相似性的负调节基因(Kieber等人，Cell 72:427-441 (1993)，将其引入作为参考)。本 发明的植物可以包括导致乙烯应答的任何此类负调节基因的改变的表 达或活性的修饰。例如，在外源乙烯不存在时导致乙烯应答的突变可 以包括在本发明的非天然发生的植物中并且可以修饰，例如减小种子 散布的延迟。
果实形态突变也可以包括在本发明的植物中。此类突变包括在心 皮身份基因如AGAM0US中的突变(Bo丽an等人，上文，1989; Yanof sky 等人，上文，1990)和在正常的果实发育所需的基因，如ETTIN、 CRABS CLAW、 SPATULA、 AGL8和TOUSLED中的突变(Sessions等人， Development 121:1519-1532 (1995); Alvarez禾口 Smyth， Flowering Newsletter 23:12-17 (1997);和Roe等人，Cell 75:939-950 (1993))。从而，理解本发明的植物可以包括一种或多种额外的基因修 饰，其可以减小或者增强种子散布的延迟。
实施例
提供下面的实例阐明但是不限定要求保护的发明。 实施例1:
GT140瓣膜边缘标记(Sundaresan， V.，等人Genes Dev. 9， 1797-1810 (1995))仅在受精前(阶段13)在正发育的雌蕊的瓣膜边缘表达 并且该模式在成熟果实(阶段17)中持续存在。由于该标记很大程度 上不存在于shpl shp2不裂果实的瓣膜边缘(Liljegren， SJ.，等人 Nature, 404(6779) :766-70 (2000))，所以预期对应于该标记的基因
也可以参与瓣膜边缘发育并且是果实开裂所需的。
为了从GT140标记插入位点分离侧翼基因组序列，如以前描述的 进行TAIL/PCR(Tsugeki， R.，等人Plant J. 10， 479-489 (1996))。 所分离的PCR产物的随后测序表明它们对应于来自4号染色体的完全 测序的BAC，其可以在公共数据库中作为拟南芥基因组起始
(Arabidopsis Genome Initiative)的部分得到。GT140插入位于两 个基因之间， 一个基因编码预测的碱性螺旋一环一螺旋(bHLH)转录因子，另一个代表新的基因。
通过几次随后的研究，证实bHLH转录因子(本文中称作如下提到
的工ND1)是相关基因(SEQ ID N0:1)D将IND1基因的启动子/增强 子GUS融合导入野生型植物并发现与GT140标记株系以相同的模式 表达GUS。有趣的是，约25X的转基因植物不能表达显著的GUS活性 并且显示出不裂表型。这些结果的最可能的解释是IND1:GUS融合，以 及内源IND1基因被共抑制。随后的RNA印迹证实这些株系中IND1基 因的下调，并且进一步的RNA印迹如所预期的表明在shpl shp2果实 中IND1基因表达减小。
与上述GT140瓣膜边缘标记的研究平行，还进行了对产生不裂果 实的拟南芥突变株的筛选。除了通过shp2-l和shpl-l种子原种的EMS 诱变得到SHP1和SHP2的额外的等位基因之外，还得到分别与SHP1或 SHP2不等位的不裂突变体。因为GT140研究提示这些不裂突变体的一 种或多种可能对应于IND1基因，所以从这些突变体的一些克隆并测序 了 IND1。四种等位基因代表IND1的独立的突变等位基因。最强的等位 基因indl-2含有密码子55内的单个核苷酸缺失，导致移码和产生64 个而不是198个氨基酸的截短的蛋白质。Indl-1和indl-3等位基因含 有在密码子141和128的核苷酸替代，其分别将亮氨酸改变成苯丙氨 酸和将精氨酸改变成组氨酸。这些受影响的氨基酸都在bHLH结构域的 保守位置。Indl-4含有密码子92上的核苷酸替代，其将谷氨酰胺改变 成终止密码子，导致产生91个氨基酸的截短的蛋白质。因为该bHLH 转录因子的失活防止果实开裂，所以该基因称作INDEHISCENT1 (IND1) 并且突变体称作indl。迄今，indl代表拟南芥中特异阻止果实开裂的 唯一报导的基因突变。
为了确定木质化的边缘细胞是否也受到IND中突变的影响，我们 检查了与野生型相比，indl果实的木质化模式。尽管维管束和内瓣层 的木质化似乎在ind果实中不受影响，但是我们在ind-2果实的边缘 到处都没有观察到木质化的细胞。由于边缘木质化在shp果实中仅部 分受到影响，并且在ale果实中不受影响(Liljegren， S. J.，等人 Nature, 404 (6779) : 766—70 (2000), Rajani， S.，禾卩Sundaresan， V.Curr. Biol. 11:1914- 1922 (2001))，所以这些结果表明IND主要负 责控制边缘细胞的木质化。有趣的是，像ale果实一样，ind-l果实的 边缘被木质化，提示IND在分离区指定中的角色在遗传上不同于它在 边缘收縮和木质化中的角色。
IND调节YJ80边缘标记的表达
为了进一步监视IND中的突变对边缘处细胞分化的影响，检査了 与野生型相比，在ind果实中来自增强子捕获筛选(Eshed， Y.，等人. Cell 99， 199-209 (1999))的分子标记的表达。我们发现一种标记YJ80 的表达模式受到工ND中突变的显著影响。在野生型果实中，YJ80在边 缘的条纹、在整个瓣中散布的保卫细胞中和在种子脱落区中表达。 IND中的突变完全破坏了该标记在边缘各处的表达，而其他果实表达区 域不受影响。
因为我们可以检测ind和shpl shp2果实的边缘缺陷之间的差异， 并且ale果实的表型与ind和shpl shp2的明显不同，所以我们预期 这三种突变体的表型可以与边缘标记进一步区分。实际上，对shpl shp2和ale果实中YJ80标记的检査揭示该标记仍然存在于两种突变体 的顶端果实边缘，尽管在shpl shp2果实的基部边缘和在ale果实的 中央边缘该标记的表达受到破坏。这些结果符合我们的如下观察顶 端边缘发育在ind果实比在shpl shp2果实中受到更严重的影响，并 且进一步提示IND可以是对应于YJ80的基因的关键调节基因。
頂D编码GT140 bHLH转录因子
通过我们以前的研究，我们鉴定了边缘特异的标记GT140，其很 大程度上不存在于shpl shp2和35S: :FUL不裂果实的边缘(Sundaresan， Genes Dev. 9:1797-1810 (1995)， Liljegren等人，上文，Ferrandiz， 等人Science 289， 436-438 (2000))。因为这些结果提示对应于GT 140 的基因可以参与边缘发育，所以我们使用TAIL/PCR(Tsugeki， Plant J. 10, 479-489 (1996))分离了 Ds转座子侧翼的基因组序列。发现插入 位点在4号染色体上两个预测的0RF: At4g00120和At4g00130之间。对At4g00120的随后分析表明含有来自启动子区的2.6kb的基因组片 段指导e —葡糖醛酸糖苷酶以与GT140相同的边缘特异性模式表达。 此外，约25%的转基因株系不能显示出显著的GUS活性并且产生不裂 果实，提示At4g00120在这些株系中被共抑制并且是果实开裂所需的。
At4g00120是没有内含子的可读框，编码具有碱性螺旋一环一螺 旋(bHLH)结构域的蛋白质。为了研究该基因是否可以受到ind基因座 上突变的影响，我们对我们的突变体等位基因的每一个中的编码区测 序。我们发现所有5个都在编码区内含有单个核苷酸改变，并且三个 (包括ind-2)将导致产生没有bHLH结构域的截短的蛋白质。用跨越 At4g00120的3. 4kb基因组片段互补挽救了 ind突变表型，进一步证明 IND是GT 140 bHLH因子。
对来自5，和3， RACE-PCR的IND cDNA克隆的分析提示IND转 录物是751个核苷酸(nt)，具有510nt可读框，和分别为40和201nt 的5'和3'非翻译区。
IND代表独特类别的真核bHLH蛋白质
具有bHLH结构域的转录调节物通过碱性区域中的残基结合DNA，
而螺旋-环-螺旋结构域促进二聚化，使得家族成员形成异源或同源二 聚体(Murre， C，等人Cell 56， 777-783 (1989))。 二聚体的两个碱性 区域一起通常识别具有共有序列CANNTG的特异回文DNA六聚体，从而 每种bHLH蛋白质结合一半位点。已经将真核bHLH蛋白质根据它们的 DNA结合特异性、额外特征结构域的存在，和系统发育分析分成六大类 (Ledent， V.，禾口 Vervoort， M. ， Genome Res. 11， 754—770 (2001))。 所有以前表征的酵母和植物bHLH蛋白质已经分配到祖先B类，其结合 CACGTG E盒(也称作植物G-盒)。
IND的bHLH结构域与其他真核家族成员的bHLH结构域的比较己 经表明碱性(basic)区是非典型的。所有A-和B-类bHLH蛋白质都含 有碱性区内9位上的关键谷氨酸残基(E)。已经表明该特定残基接触E 盒的外部CA核苷酸并且是DNA结合所需的(Fisher, F.，和Goding， CR. (1992). EMBO J. 11, 4103-4109)。在IND的碱性区和一些其他密切相关的植物序列中，丙氨酸残基(A)存在于9位代替谷氨酸。尽管一
些C类bHLH-PAS蛋白质如Single-minded (Sim)和Trachealess (Trh) 也具有非典型的碱性区(在该位置具有丙氨酸)，但是IND不与该类的 成员密切相关，也不含有所预测的PAS结构域(Nambu (1991) Cell 67:1157—1167; Wilk， R. (1996) Genes Dev. 10:93-102)。
IND与至少27种其他预测的具有非典型碱性区域的植物bHLH蛋 白质在bHLH结构域内具有60X以上的序列同一性。然而，在IND和5 种最近的拟南芥近亲蛋白质的序列保守性主要局限于bHLH结构域。例 如，对相关的序列At5g09750与IND在bHLH结构域内具有82%同一性， 而在别处具有35%同一性。
ALC也是果实开裂所需的，与IND在bHLH结构域中具有仅42%同 一性，并且像多数拟南芥bHLH家族成员一样，显示了B类碱性结构域 的特征(Rajani，上文；Buck, MJ.，和Atchley， W. R. J. Mol. Evol. 56, 742-750 (2003))。 ale-1、 ale-2和ind-1突变体表型之间的相似 性是吸引人的，因为预测alc-l是无效等位基因(Rajani，上文)，但 是ind-1不是无效等位基因。分子分析已经揭示ind-1突变将导致苯 丙氨酸替代bHLH结构域的第一个螺旋内的亮氨酸。该特定残基在〉98% 的所有已知的真核bHLH蛋白质中观察到，并且已经从Max同源二聚体 的结构研究表明与第二个螺旋中的其他保守的疏水氨基酸堆叠在一起 并且稳定四螺旋束的分子内相互作用(Ferre-DAmare，等人Nature 363:38-45 (1993); Atchley, W. R.，等人J. Mol. Evol. 48:501-516 (1999); Atchley,等人Mol. Biol. Evol. 17:164-178 (2000))。在 该位置另一疏水残基的替代尽管是保守的，但是似乎显著减小ind-1 蛋白质的活性。
与ind-1相比，在ind-3等位基因的碱性区中用组氨酸替换精氨 酸导致与Ind-2等位基因的不可区分的表型。由于该精氨酸是已知在 DNA共有序列内产生特异磷酸接触的几个残基之一 (Ferre-D' Amare，等 人Nature 363:38-45 (1993); Ma，等人Cell 77:451-459 (1993))， 这些结果提示DNA结合的破坏足够完全废除IND功能。IND的表达在ful果实的瓣膜各处扩大
为了确定野生型和突变果实中IND表达模式，我们用IND特异探 针进行反义原位杂交。受精后，IND在正发育的野生型果实的边缘上约 4个细胞宽的条纹中表达。我们还检测了唯一的瓣膜层中的IND表达， 所述瓣膜层在果实发育晚期变得木质化，以及胎座框的维管束中的IND 表达。像SHP1和SHP2—样(Ferr6ndiz，等人Science 289:436-438 (1999))， IND的表达在ful突变果实的瓣膜各处扩大，表明需要FUL 来限制在瓣膜的边缘的頂D表达。
在ful果实中扩大的IND活性抑制生长和导致异位木质化 FUL中的突变导致果实生长中的严重缺陷，主要是由于雌蕊受精 后缺少瓣膜细胞扩大(Gu， Q.，等人Development 725:1509-1517 (1998))。以前，我们已经发现在ful果实中SHPl和SHP2的异位表达 不造成它们的降低的生长，因为shpl shp2 ful果实不显著长于ful 果实(Ferr6ndiz，等人，Science 289:436-438 (1999))。为了确定异 位IND活性是否可以主要负责ful果实的扩大缺陷，我们构建了 ind ful双突变体。值得注意的是，我们发现与ful果实相比，在ind ful 中果实生长得到很大恢复。而成熟的ful果实(2.5+Z-0.2 mm)为野生 型果实的长度(10. 1+/-0. 7)的25% ， ind ful果实(6. 8+/-0. 4)明显更 长——为ful果实长度的2倍以上和野生型长度的67。/。。与野生型相比， ful和ind ful果实的扫描电子显微照片表明由于IND活性的损失，瓣 膜表皮细胞扩大的恢复。此外，在ind ful果实中看到一些表皮细胞 分化成保卫细胞，并且在ful果实中从没有观察到所述分化。
除了生长缺陷，ful果实还显示出一些瓣膜细胞层的异位木质化 (Ferrandiz,等人，Science 289:436-438 (1999))。在野生型果实发 育中，认为单个内部瓣膜细胞层的木质化促进果实开裂。在ful果实 中，发生三个额外的瓣膜层的木质化。因为我们发现IND是野生型果 实边缘的木质化所需的，所以我们预期扩大的IND活性可以导致ful 果实的异位木质化。实际上，由于仅在ind ful果实中观察到仅内瓣 层的木质化，所以扩大的IND活性不仅很大程度上造成瓣膜扩大的缺失，而且还导致ful果实的异位瓣膜木质化。
因为SHP1、 SHP2和IND每种都在野生型果实的边缘表达，所以我
们将它们在ful果实的瓣膜各处表达解释为表明边缘一致性的扩大
(Ferrandiz，等人Science 289:436-438 (1999);本工作)。通过IND 活性的丧失传递的ful果实表型的显著抑制提供了该假说的实验证实， 并且进一步支持IND在促进果实生长期间边缘的减小的细胞扩大中的 作用和它在指导一部分边缘细胞的以后木质化之间的关联。此外，ind ful和shpl shp2 ind ful果实之间的表型差异构成了令人注目的遗传 证据证明IND表达和/或表型不是简单地受到SHPl和SHP2的调节。
在寻找抑制边缘细胞扩大或者促进它们的随后木质化的额外的因 子中跟踪的有趣线索是YJ80。像IND—样，YJ80标记在边缘的表达扩 大到ful果实瓣膜的各处，并且，除了少数保卫细胞之外，完全不存 在于ind ful果实的瓣膜中。如从shpl shp2和alc果实的分析预期 的，YJ80的表达在shpl shp2ful和ale ful果实的瓣膜的的各处持续 存在，强烈暗示对应于该标记的该基因受到IND的特异调节。
具有异位IND表达的植物产生ful样果实
为了进一步研究异位IND活性的发育效果，我们产生了转基因植 物，它们在组成型花椰菜花叶病毒35S启动子或者FUL启动子的控制 下表达IND，所述启动子指导花序分生组织、茎生叶和雌蕊的正发育的 瓣的各处中的表达。表型分析揭示101株35S: :IND中的17株和135 株FUL: :IND中的48株Tl植物具有严重生长缺陷的ful样果实。此外， 许多35S: :IND和FUL: :IND Tl植物显示出较弱的ful样果实表型，很 像组成型表达SHPl和SHP2的植物产生的果实。这些结果与我们的如 下发现非常对应IND中的突变显著抑制ful果实表型，并且说明异位 IND活性足够抑制果实生长。
IND、 SHP和ALC活性的丧失很大程度上抑制ful果实表型 因为IND中的突变不仅对边缘发育具有最严重的影响，而且比在 ALC、或者SHPl和SHP2中的突变更显著地抑制ful表型，我们想知道这些转录因子是否独立于IND调节边缘发育的任一方面。为了解决该
问题，我们已经进行了系统遗传分析来发现IND、 SHP1、 SHP2和ALC 对边缘发育的相对贡献和确定它们的异位活性对ful果实表型的影响 程度。
通过比较ind shpl shp2、 ind alc和ind果实，我们观察到与 ind果实相比，在ind shpl shp2果实中顶端边缘定界的增强的损失， 但是没有检测到ind alc和ind果实之间的任何形态差异。在我们对 shpl shp2 alc果实的检査中，与shpl shp2果实相比，边缘定界的较 小、但是相似的损失是明显的。这些结果提示SHP1和SHP2的确独立 于IND和ALC调节边缘发育的一些方面，并且ALC活性主要被工ND包 含。
当将ind shpl shp2 ful与ind ful果实比较时，SHP1和SHP2 的IND独立的活性更明显。ind shpl shp2 ful果实的果实长度 (8.5+/-0.8 mm)很大程度上恢复(84%)到野生型，并且果实的总体 外观，尽管是皱褶的，但是由于增加的侧面瓣膜细胞扩大而更像野生 型。此外，indshpl shp2ful果实的扫描电子显微照片与野生型、ful 和ind ful果实相比表明由于丧失异位頂D、 SHP1和SHP2活性，导致 保卫细胞分化的广泛恢复。在shpl shp2 alc ful与alc ful果实的 比较中，对于SHP1和SHP2的ALC独立的活性的支持也是明显的。尽 管与野生型相比，shpl shp2 alc ful果实的全长(5. 1+/-0.4 mm)仅部 分恢复(51%)，它比alc &1果实(4.0+/-0.3腿)明显更长。总之， 这些结果清楚地表明SHP1和SHP2独立于IND和ALC调节参与边缘发 育和细胞扩大的因子。
尽管我们对ind alc果实的最初观察表明ALC可能不独立于IND 在边缘发育中起作用，但是对ind alc ful和ind alc shpl shp2 ful 果实的分析已经揭示ALC具有独立于IND和SHP的作用。ind alc ful 突变体产生的果实比ind ful(6.8+/-0.4 mm)明显更长(8. 2+/-0. 6 mm)。此外，尽管不是显著的，但是在ind shpl shp2ful (8. 5+/-0. 8 mm) 与ind alc shpl shp2 ful (9. 0. 9 mm)果实的比较中观察到长度 的稍微增加。IND、 SHP、 ALC和FUL活性贡献于木质化的瓣膜的分化 除了发现SHP和ALC在边缘发育中具有独立于IND的作用外，我 们还发现与IND和FUL —起，这些因子还参与指定木质化的瓣膜层的 木质化。对ind alc shpl shp2果实与野生型比较进行的检查揭示与 每个瓣膜边缘相邻的木质化瓣膜层中的一些细胞没能木质化。在ind shpl shp2果实中也观察到来自胎座框的木质化的瓣膜层细胞的收縮。 这些非木质化的细胞外观和大小与在邻近叶肉细胞中发现的细胞非常 相似。
在野生型果实中，FUL在瓣膜各处表达(Gu等人，1998)。我们以 前发现FUL的表达从shpl shp2突变果实的瓣膜边缘稍微收縮 (Ferr6ndiz等人，2000b)。在ind突变体中，我们还观察到FUL从边 缘的稍微收縮。FUL从边缘的收缩在ind alc shpl shp2四倍突变果实 中更显著，并且与木质化的瓣膜层中边缘附近不存在木质化的细胞相 关。当在ind alc shpl shp2 ful五倍突变体中除去FUL活性时，除
了果实基部的一些细胞，完全不存在木质化的瓣膜层中的木质化。在 ind shpl shp2 ful四倍突变果实中观察到该层的木质化减少但是没有 消除(数据未显示)，表明ALC在指定该细胞类型中也起作用。因为仅 当所有5种转录因子-IND、 ALC、 SHP1、 SHP2和FUL都失活时，木质化 的瓣膜层完全消失，显然每种因子都贡献于该层的木质化。
实验步骤 植物
如以前描述的(Liljegren， Nature 404:766-770 (2000))，通过 甲磺酸乙酯诱变得到IND和ALC的突变等位基因。ind-2等位基因含有 密码子26内的单核苷酸缺失，其导致移码和产生35个氨基酸的截短 的蛋白质。Ind-1和ind — 3等位基因含有密码子112和99内的核苷酸 替代，它们分别将亮氨酸改变成苯丙氨酸并且将精氨酸改变成组氨酸。 Ind-4和ind-5等位基因含有密码子63和13内的核苷酸替代，他们分 别将谷氨酰胺和色氨酸改变成终止密码子，导致分别为62和12个氨基酸的截短的蛋白质。Alc-2突变含有在第三个内含子的拼接供体位点 上的核苷酸替代，其将破坏编码bHLH结构域的第二个螺旋的转录区的 剪接。Ind-2和ale-2等位基因回交三次成Ler并且与shpl-1、 shp2-1 和ful-5等位基因一起用于随后的遗传分析。
基于ind-2突变消除的Alul位点和通过alc-2突变导入的Asel 位点，用CAPS(切割的扩增的多态性序列)标记检测ind-2和/或alc-2 等位基因纯合的植物。如以前描述的检测shpl-l和shp2-l突变。
cDNA分析
为了检测在IND基因座产生的转录物，如生产商描述的分别使用 总RNA或polyARNA作为模板进行3， RACE-PCR (Roche)。对于5， RACE， 在逆转录酶反应中使用5'-GAGTTGTGGT AAT AAC AAAGGT AAG-3'，并 且额外的嵌套Oligos 5， - GGCTTCGTCGAGCATGGAAGC-3'禾P 5， -GAGC AACC ACCGTCTGAGGATCG-3，用于PCR的随后轮中。对于3' RACE，在逆转录 酶反应中使用寡聚dT，并在PCR的随后轮使用嵌套引物 5' -CCCTGCCACGGTCCCTAAGC-3'。将所得片段克隆到pCR2. 1 (Irwitrogen)中并测序。对来自5，和3， RACE-PCR的工ND cDNA克隆 的分析表明頂D转录物是751个核苷酸(nt)，具有510nt阅读框，和 分别为40和201nt的5'和3'非翻译区。对于指定的阅读框的进一 步支持由IND EST (AF488578)提供。
标记分析
为了从GT 140标记(Sundaresan，等人(1995) Genes Dev. 9: 1797-1810)分离侧翼序列，使用对左和右转座子边界特异的嵌套寡核 苷酸和如以前描述的简并引物(Tsugeki，等人(1996) Plant J. 10:479-489)进行TAIL (Thermal Asymmetric Interlaced)/PCR。在 At4g00120的所预测的ATG的5' 2782个核苷酸检测到转座子插入，并 产生了插入位点侧翼的8bp (GTATTTGC)副本。
用质粒pOCA-28-15-991通过农杆菌介导的转化产生YJ80增强子 捕获株系。含有YJ80、 GT140、 YJ36或FUL标记的转基因植物杂交成突变植物。对于P —葡糖醛酸糖苷酶表达分析，将来自野生型和突变 植物的果实固定、切片并染色，其方法具有小的改动。
产生转基因植物
使用来自GT140插入株系的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增 2. 9 kb区，其从预测的At4g00120翻译起始位点上游的180个核苷酸 跨越并延伸到Ds插入元件。将该片段克隆到pCR2. 1 (Invitrogen)， 然后作为SalI/BamHI片段切除并克隆到植物转化载体pBI101. 3。 38 个转基因Tl株系的17株产生不开裂的果实。
使用Col咖bia DNA作为模板，通过PCR扩增頂D的3. 4bk基因组 区，其延伸编码区5，的2740个碱基和3' 480个碱基。将该片段克隆 到pCR2. 1，然后作为Xbal片段切除并克隆到pEL112转化载体中。显 示出互补表型的Basta抗性转基因植物通过PCR分析证明它们对于 ind-2基因座是纯合的。
用寡核苷酸(5' -CGTCGACGATGAAAATGGAAAATGGTATGTATA-3，和 5， _ CGGATCCGTTCATCAGGGTTGGGAGTTGTG-3，)，用Columbia DNA作为模 板通过PCR扩增全长IND cDNA。将该产物克隆到pCR2. 1后，将含有 IND cDNA的SalI/BamHI片段克隆到pBIN- JIT载体中。所得构建体将 IND置于35S启动子的串联重复的控制下。
显微术和组织学
如前面描述的将野生型(Landsbergerecta生态型)、突变体和转 基因果实和花固定、制备并通过扫描电子显微术分析。如所述的 (Lil jegren等人，2000)进行组织固定和来自晚期17果实的paraplast 切片(8或者10um)的间苯三酚染色。如所述的(Roeder等人，2003) 对野生型和突变花序上的10期17果实用JB4树脂(Electron Microscopy Sciences)制备塑料切片(3um)。
原位杂交
将野生型和突变体切片与如所示的反义或有义RNA杂交。用T7RNA聚合酶从Sall —消化的pINDAS模板合成頂D探针以产生328个核苷酸 的反义转录物，其包含通过bHLH结构域的第一个螺旋部分的5'区。 将从Colombia DNA PCR扩增的頂D产物与5' -GAGCAACCACCGTCTGAGGATCG-3，和5'-
CGTCGACGATGAAAATGGAAAATGGTATGTATA-3，连接到pCR2. 1载体产生 pINDAS。
实施例2:
从欧洲油菜植物分离两个IND1直向同源物。因为欧洲油菜具有异 源四倍体基因组，所以并不惊奇的是在基因组种存在两种不同的IND1 直向同源物。将两种序列称作Bn IND1和Bn IND2。 Bn IND1和Bn IND2 的氨基酸序列与SEQ IDN0: 2的比对在
图1中描绘。Bn IND1和Bn頂D2 的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1的比对在图2中描绘。如用BLAST并且 不用低复杂性过滤器测量的，Bn INDl的氨基酸序列与本发明的SEQ ID NO: 2具有约63X同一性。Bn IND2的氨基酸序列与本发明的SEQ ID NO: 2具有约67%同一性。像拟南芥IND1序列一样，芸苔IND序列包括在 碱性区域的9位的丙氨酸残基(A)而不是谷氨酸(例如，SEQIDN0:9 的140位，SEQ ID N0:10的112位)。
将Bn頂D1或Bn IND2转化到indl突变拟南芥植物导致突变表型 的互补。这些结果表明Bn INDl和Bn IND2执行与INDl相同的基本功
实施例3
为了检查IND1的异位表达对木质化的影响，我们向拟南芥植物 导入35S::IND1构建体并测定木质化。当萌发时，拟南芥植物在土壤 表面产生叶子的莲座叶丛。由于叶子之间缺少节间延长，这些叶子距 离很近。当过渡到拟南芥中的再生性发育时，主要茎干通常称作花序 茎干，因为它负责在其侧翼产生花。该茎干极大地延长，得到具有其 特征性高度的植物。通过茎干切片的木质素特异的间苯三酚染色确定 野生型植物的花序茎干中木质化模式的检查，该检查揭示在导管成分中正常的茎干木质化模式。来自35S::IND1植物的类似茎干切片看起 来揭示了异位木质化。35S::IND1植物比野生型植物更广泛地木质化， 表明茎干中IND1的异位表达足够促进茎干细胞的异位木质化。
应该理解本文描述的实施例和实施方案仅用于阐明目的并且其多 种修改或改变将暗示给本领域技术人员并且将包括在本申请的精神和 范围内和所述权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专 利申请都为了所有目的完整引入本文作为参考。序列表
SEQIDNO:l IND1染色体组的 序列范围1-3856
SO
CTCTAGACCA TCTACTATCC GGTTGTTGAC CCTTAAAGCT TTTGAAGACT ACTAGAATAA
120
TGCAAATACC ATATGTCCAT ATCCATCCTT TTCTTTTGTT TGAACTGAAC ATTCTAATTT
180
TGTAAAAGAA AAAACCTTAT GTTAATATCA CCGTAGGCAA AAAAAATATC TCATCATATT
240
AAATTTTTAT TATAAGATTA TACATTCTCT CGTTGTAAGA GTTACTCCAA TTGCAAGTOT
300
TGTATTAACT AATAAAAAGG ACGAAAGTAG GAAGCTTATA ATTAATTGAT GTTGCATAGT
360
ACTGGTATAT TGTTGATGAA TATAACAAGT ATGAACATTA ATGCATGAAA CGGGCTATTT
420
TGTCTTGAAC TCATTAAAGG CAATGTGAAA AGAAGATGTG AGGTCTCATT TTGAAAATTT
480
ATCTTCTAGC TTTGTCGATT TTAAATCTAT GAAATGAACG CAACATATAG AAATTTCATG
540
TGGACAACGA CATTTAGACG GTATCTTAAT TAGACCGATT AATTAGTAAT ATACTTATAT
ATATAATTAG TGGTGATTAT AAGTTTACTT ATCCACTTGA GAATTTAAAC AATGGGCAAT
ACCTTAATGT CGAAAGAAGC CGTCCCCACT TCGTGTAATG AGTTATGGGG GAGAGATCCT
720
G丁TAAATCGT CAAATAAAAC AACTTAAGAA CTAGAAATTG ACACCAAAAA TCATAAAGAG
AACGTTGAAG AAGTCATTTA TCGTATCCAG CTCATATTTC CTAGCTAAGA TCAAATCAAG
840
GCCGTTGAAA GGGCTTGTAA GAAAATG丁CG AAGAAACCGT GGGGTTTAGA AGAAAGACAA
900
GAAATAGAAG AACAATGATG TTAAATTGCC TATTTTGGTG TATAGGAGTT GTCAAAAGAG
GAGAGAGAGA AGAAAATTAG GTCAAAATAA TGAGCACTAA AAATGGAGAC ATGTGTTGAG
1020
TAACTATTAC AAGAGCGACT TATGCTTCCT TATGGCAATG ATATCCAAAC CAAAGTGCAA
1080
CGCTCCTTTT TTGCCCTAAT TTCGTAAAGT CTCTCTCCTT CTTCGTCCTT AGGAAAAACC
1140
CTAGAAATTT AATCCCTTGT TCTTGATCTT GCTTTTTGAG TAACCATGAT TTTGACCACA
1200
CACTATTTCT TOTATCTTTT GTGGTCTATA GGATTTTGCT TTATATGTGT TTCTTGTATT
1260
GCTCCGTACG TACGTATACG AATTTAAATG GTTATAACAA GGTTTATATA AACTAGCACA1320
AATGAGTCCA TGAAATTTGT TAGCGAAAAA GGTAGAAATA TATTGAGTCT TTAAACGGCA
1380
ATATATATAA TTTTGCTGCA AAACTTAGCT TTAATCATGA TCTAATGATA TTTTCTTTAA
1440
TTTCCTTTGC CAAATTAATC ACATGCACGG ATTTTTGGCA AGTTATGTGT CGAATTCTTC
1500
CATTCACACA ACACTAAACT TAATTAGAAC TCTAGGAAAT ATTTTAAAAT GACAACTTTA
1560
TCGAAAAAAA TTTAGTTATG AAAACAATTC CAGAATTAAA CATGAGCTAT ATAATTTAAG
ATAAAATGAA GTAATATTGA TATGTATGTA ATAACATATC TGATTGCGGT AAAAAAAAAC
1S80
ATATCTGATT AAATTGTTCA TGCAGGCCCA TGTCACTATG ATGT二ATCAC GTTTTTATTT
1740
TCACAATAAC TAATATATAT TCAAAAAAAT AGTTTTGTCA GATTAAATTT TTTTTGGTGG
1800
TCAGCTTTCT CCAACCTACT AAACTAGTTT GGAATGTTCT CTTCTTTATT TTTCTTTTTC
1860
TTGATTTCTT ATGTTTTTTA TTTATGGAAT TTTAAGACGG ATTGTTTAGG TCGTTTCTCT
1920
CTTTTCTTGT TTTCTAAAGT TACTTTTGTA AACTCATCTC CTCCCAATTA GACAGTCAAT
1980
CATATAGTTA TCTTTTAATA TATGTCTAGT TGATAAAAAA AATGAAAAAA TACTGGTGGT
2040
AGTTCTACTA ATGTTTGTGT AAAAAATCTG ATATTATGAA TCTAATCAAT TTCTTTGATC
2100
GTATAATGTG GGTTAAATTT AGTAATTTTT TACATAAATA AGAACTGTAA TGTTGATGTA
2160
TATTGGGGAA TCAGTATATT AGCTTGGGTA ACTATACTTC TGGAAATACT TGAAGATTTA
2220
ACTATTTGCA AAATTATAAT TTAGTCCCGA AAAATACAGA CGACGGGACA CGACAACATA
2280
TAAGCAGGTT TGAATCTTGG AAAATTTTGT ATACATAACC TATATAAATA CTAATGTTCT
2340
GGTTGGGTTC AAAAGCCTTT TCAAAAGTTC CATTTTTTAA ATTCAAGGAC ATTTTACATA
2400
GGAAATAAGT TGAGTCATAA AAAATAATGG TTATTTTGTA AGGTTTTTTT TTTGATTAAA
2460
ACGCACATAT TAAGAAGTTA GTTTTTTTTC ACTACCAAAT ATCAATTAAT TTAAAACCAT
2S20
GCAACCATTC ATAAAACAAT ACTATTAAAG AATATAAATA ATCACAAAAT ATTAAATACA
CTTAAAATTT ACATATAAAT TTACAAAACA TCTAATTAAT TGAAACAGAA AGGAAAAGGT
2640AAAATATATC ATAAAATGAG ACATATATCC
ATAATAAGAG ACATGCATGT AAGCATTCGG
TAAATACATA TGTGTATATT TCTGGAAAAA
GAAAATGGAA AATGGTATGT ATAAAAAGAA ME NGM YKKK
AAGCAGATCC AACCACAGCC CCAAAAGAAG SRS NHS PKRS
CATGGATTGG AACAAAGCTA ATGATCTTCT MD.W NKA NDIiL
TCCTCACCAT CTCATGTTAG ATCCACCTCC PHH IjMIj DPPP
AGAGTACGAT GAAGACATGG ATGCGATGAA EYD EDM DAMK
GCCCGTAGAC ATCGACCCTG CCACGGTCCC PVD IDP ATVP
CGACGATCCT CAGACGGTGG TTGCTCGTCG DDP QTV VARR
AATTCTCAAG AGGATCGTGC CTGGTGGTGC ILK R工V PGGA
AGCCATACGT TACACCAAGT TCTTGAAACG A工R YTK FIjKR
GATTGGAGCT CCTATGGCTA ACCCCTCTTA IGA PMA NPSY
ATGAACTACA CAGAAGCTCG CTAGCTAGAC
GTTGATATAT TATATATAGA TGCATAAAGA
ATTATTATTC TAAGATATAT GATGTACAAT
TATGCATAAA TAATTGGTGA ATAAAAAGAA
ATTGATTGTT AATTAGGGTT TGATCATTCT
TCGATATATA TATATATATA TGGAGAATAT
TTTGTATCAA TTATCTGAAT CTGATGAGTG
TATAAAAAAA AAATGAGGCA TATGAAGTAA
2700
TTAATTAATC GAGTCAAAGA TATATATCAG
27G0
GAATATATAT ATTGAGAAAT AAGAAAAGAT
2820
AGGAGTGTGC GACTCTTGTG TCTCGTCCAA GVC DSC VSSK>
2880
CATGATGGAG CCTCAGCCTC ACCATCTCCT MME PQP HHL>:L>
2940
CACACAAGAA CACGCAGCTT TTCTCAATGA TGE HAA FIjIJD>
3000
CGAAACCCTA ATTCACTTGG ACGAAGACGA ETL IHL DEDE>
3060
GGAGATGCAG TACATGATCG CCGTCATGCA EMQ YM工 AVMQ>
3120
TAAGCCGAAC CGCCGTAACG TAAGGATAAG KPN RRN VRIS>
3180
GCGTCGGGAA AGGATCAGCG AGAAGATCCG RRE RIS EKIR>
3240
GAAGATGGAC ACAGCTTCCA TGCTCGACGA KMD TAS MIjDE>
3300
GCAGGTGAGG ATTCTTCAGC CTCACTCTCA QVR IIjQ PHSQ>
33S0
CCTTTGTTAT TACCACAACT CCCAACCCTG LCY YHN.SQP*>
3420
ATTTGGTGTC ATCCTCTCAA CCTTTTTCAT
3480
TTCGATCCAA GATTGTATGG GTGTTTTAAT
3540
TGTGTACCAA GTTTCTTTAT CTTGATATCA
3SO0
GATATTGATT GTAAACAAAA AAAAGAAGAT
3S60
GTATGAAAGC TTTGGCCTGC AAATTAATTT
3720
ATATCAAATA CTTTTTTAAT TTGACTATAA
3780
TAGGfTATAT ATGGA丁TAGC AAAAAAGAAA<formula>formula see original document page 55</formula>
SEQ ID NO:2 IND1蛋白质
<formula>formula see original document page 55</formula><formula>formula see original document page 56</formula>TATTGGGGAA TCAGTATATT AGCTTGGGTA ACTATACTTC TGGAAATACT TGAAGATTTA
2220
ACTATTTGCA AAATTATAAT TTAGTCCCGA AAAATACAGA CGACGGGACA CGAC7ACATA
2280
TAAGCAGGTT TGAATCTTGG AAAATTTTGT ATACATAACC TATATAAATA CTAATGTTCT
2340
GGTTGGGTTC AAAAGCCTTT TCAAAAGTTC CATTTTTTAA ATTCAAGGAC ATTTTACATA
2400
GGAAATAAGT TGAGTCATAA AAAATAATGG TTATTTTGTA AGCTTTTTTT TTTGATTAAA
2460
ACGCACATAT TAAGAAGTTA GTTTTTTTTC ACTACCAAAT ATCAATTAAT TTAAAACCAT
2520 GCAACCATTC ATAAAACAAT ACTATTAAAG AATATAAATA ATCACAAAAT ATTAAATACA
2580
CTTAAAATTT ACATATAAAT TTACAAAACA TCTAATTAAT TGAAACAGAA AGGAAAAGGT
2640
AAAATATATC ATAMATGAG ACATATATCC TATAAAAAAA AAATGAGGCA TATGAAGTAA
2700
ATAATAAGAG ACATGCATGT AAGCATTCGG TTAATTAATC GAGTCAAAGA TATATATCAG
2760
TAAATACATA TGTGTATATT TCTGGAAAAA GAATATATAT ATTGAGAAAT AAGAAAAGAT GAAAA
SEQ ED NO:4 INDl 3'未翻译的序列
3420
ATGAACTACA CAGAAGCTCG CTAGCTAGAC ATTTGGTGTC A丁CCTCTCAA CCTTTTTCAT
3480
GTTGATATAT TATATATAGA TGCATAAAGA TTCGATCCAA GATTGTATGG GTGTTTTAAT
3540
ATTATTATTC TAAGATATAT GATGTACAAT TGTGTACCAA GTTTCTTTAT CTTGATATCA
3600
TATGCATAAA TAATTGGTGA ATAAAAAGAA GATATTGATT GTAAACAAAA AAAAGAAGAT
3S60
ATTGATTGTT AATTAGGGTT TGATCATTCT GTATGAAAGC TTTGGCCTGC AAATTAATTT
3720
TCGATATATA TATATATATA TGGAGAATAT ATATCAAATA CTTTTTTAAT TTGACTATAA
3780
TTTGTATCAA TTATCTGAAT CTGATGAGTG TAGGTTATAT ATGGATTAGC AAAAAAGAAA
3840
ACAACCATTA TTACGCACCT ACATTAAAAA TCATCCACCA AAGAAGAAAC CATCCTCAAG AGGGTTCCCT CTAGAG
SEQ ID NO:5 SHPl染色体组的
AGMCTGCAA CAGTGAAAAG AGAAAACAAA ATGGACTTGA AGAGGTTTTG ACAATGCCAG
120AGATAATGCT TATTCCCTAA TATGTTGCCA GCCAAGTGTC AAATTGGCTT TTTAAATATG
1B0
GATTTCTGTA TCAGTGGTCA TATTTGTGGA TCCAACGTAT TCATCATCAA GTTCTCAAGT
240
TTGCTTTCAG TGCAATTCTA ATTCACACGT TTAACTTTAA CATGCATGTC ATTATAATTA
300
CTTCTTCACT AAGACACAAT ACGGCAAACC TTTCAGATTA TATTAATCTC CATAAATGAA
ATAATTAACC TCATAATCAA GATTCAATGT TTCTAAATAT ATATGGACAA AATTTACACG
420
GAAGATTAGA TACGTATATT AGTAGATTTA GTCTTTCGTT TGTGCGATAA GATTAACCAC
480
CTCATAGATA GTAATATCAT TGTCAAATTC CTCTCGGTTT AGTCGCTAAA TTGTATCTTT
540
TTTAAGCCTA AAAGTAGTGT ATTCGCATAT GACTTATCGT CCTAACTTTT TTTTTAATTA
ACAAAAAAAT CGAAAAGAAA ATAATCTGTT AAATATTTTT TAAGTACTCC ATTAAGTTTA
GTTTCTATTT AAAAAATGCT TGAAATTTGA CAGTTATGTT CAACAATTTT GAATCATGAG
720
CGATGTCTAG ATACTCAGAA TTTAATCAAG ATGTCTTATC AAATTTGTTG TCACTCGAGG
780
ACCCACGCAA AAGAAAAGAC TAATATGATT TTTATTTGGT CTGGATATTT TTGTAGAGGA
840
TGAAACTAAG AGAGTGAAAG ATTCGAAATC CACAATGTTC AAGAGAGCTC AAAGCAAAAA
900
GAAAAATQAA GATGAAGGAC TAAAGAACAA TAAGCAACTA CTTATACCCT ATTTCCATAA
AGGATTCAGG TACTAGGAGA AGTTGAGGCA AGTTMNWNNN NATTGATTCA AATTTTCATT
1020
TATTTTTACA ATTTAATTCA CCTAAGTTAT TATGCATTTC TCATCATTGG TACATTTTCT
1080
GTATAGCGTA TTTACATATA TGAAATAAAT TAAATATGTC CTCACGTTGC AAGTAGTTAA
1140
TGAATGTCCC CACGCAAAAA AAAATCCCTC CAAATATGTC CACCTTTTCT TTTCTTTTTA
1200
ATTCCAAAAT TACCATAAAC TTTTGGTTTA CAAAAGATTT CTAGAAATTG AGGAAGATAT
1260
CCTAAATGAT TCATGAATCC TTCAATAATC TGAAGTTTGC GATATTTTCG ATTTTCTTCA
1320
AGAGTTGCGA TATTTGTAAT TTGGTGACCT TAAACTTTTT TTGATAAAGA GTAAACGTTT
1380
TTTCTTAAAA GTAAAACTTG ATTTTATGTT TTAGGGTTCT AGCTCAACTT TGTATTATAT
1440
TTCTTGCAAA AAGAGTTCGT TAACTGCATT CTTCAACACT ATAAAGTGAT TATCAAAAACATCTTCATGA ACATTAAGAA AAACAATATT CTTGATTCAC ATACCCATTC TAGACTTTGG TGGTAATGCA GAAGGGTAAA AAAAGGAAGA AGGAGTTTCA AAAGATGGTT CTGATGAGAA CCATGAAAGA AATCGGATGG TCCTCCTTCA TTTTTTCTTT CTTATTATTA ACCATTTAAT CTGTAAAAAG AAAATACACA TCTCACTTAT AGAGAATAAA AAAGTGTGAG TTTCTAGGTA AGATGATCTG TCCATTTTTT TCTTTTTTCT AAAACTAATA ACCTTCTGTT TTCAGCAACT TTCAATTGAA AACCCATAAA .CCAAAATAGA GAACAACATA ATTAGAAAAG CAGAAGCAGC TTTCTCTTCA AGAACAGTTT CTCATTACCC CTTGAGAACT CAGGTAAGGT TGTGAATATT GATTTAAAAT AAATGTTTCT TCTTTCTCTG ATGTTTCTTG GTTATTGCTT ATCAACAAAG CTCTTAAACA CACAAAGTTT CTTTATTTTT TGGATTTGAT CTATTTCTTG GTTATGTATC ATTAGCCTTC TCTCTCTCTC TCTAGATATC ATTTGGTGAT GTCATATATG GATCAATGGA TAGCAAGAAA CTAGGGAGAG GGAAAATAGA TCAAGTTACT TTCTGCAAAC GACGCAATGG CTTGTGTGAT GCCGAAGTTG CCCTCGTCAT
1500
TGGTTTCGGT TAGAGCTTGG TTTTGCTTGG
15S0
CATAAATTTG ATACGATAGA GAGTATCTAA
1S20
GAGAAAAGGT GAGAAAGATT ACCAAAAATA
1680
ACAGAGCCCA TCCCTCTCCT TTTCCCCTTC
1740
ATGTCCTCCA CCTACTCTTC TCTTCTTTCT
1800
TAATTTCCCC TTCAATTTCA GTTTCTAGTT
18S0
AGATATCCAT ATCTATTTAT ATGCATGTAT
1920
TGTTGAGTAT GTGCTGTTTG GACAATTGTT
1980
TCTGTGTATA AATATATTTG AGCACAAAGA
2CK0
AGGGTCTTAT AACCTTCAAA GAAATMTC'C
2100
TATTACAAAA GGAAAGAGAG ATATTTTCAA
2160
AGTTAAGTGG TACTGAGATA AATGATATAG
2220
ACCTTCTCCT TTTTGCTGAT CTATCGTAAT
2280
ATGCACCATT CATTAACCCT AAAAATAAGA
2340
ATTCTTGTGT AACCAATTCA TGGGTTTGAT
2400
AGATTTGATC ATTATAAAGT AGATTAATAA
2460
TAGTTACATC CCTAATTCTA GACCAGAACA
2520
TTGATCAGGA AAAGGC^ATTT GATCATCAAG
2580
TTTCTTGAAT TTAGAAATCT TTATTTAATT
2640
GGAAGGTGGG AGTAGTCACG ACGCAGAGAG
2700
GATAAAGAGG ATAGAGAACA CAACAAATG'3
2750
TCTTCTCAAG AAAGCTTATG AATTCTCTGT CTTCTCCACT CGTGGCCGTC TCTATGAGTACGCCAACAAC AGGTACGCTT CTCCTACTCn TAAACAAGAT CCTAGTTCAA ATGATAACAA GGTTAATTTA GAAAACCAGA TTTCACTTGT TAGTACTCTC TCCTCTATAT ATGTGTGGGT GCAAGAAGAA GAAGAAAAAG TTATCTTGTC TTTCACTCTT TTTTCTGCAA ATCATTTGAA TTTAATTTTG ACGGCCCATC AAATTTCCTA TTGACACGAT TTAGCATGTA TATATAAAAA GTCTGGTGAA ACTAGGGACA AAGTCTACTG TTTAATCCCA ACAAAAATGA AACAAAATTT CTCTTTTTTA AATAACTTTA TATTATGTAG AAGTCCTAAA AATCAATAAA CACACGGATG TGTAAAATTG TACAAATAAT GAAATTAAAG GTGTATATAT ATATATATAT GTATATTTGT CTCAGAGAAG TGTCGGAAAT TAAAATGGTA CTTCATTTGT TTGTTATTAG AAAAAAAAAA ACATTGAATC ATGTAATATA CACGATACAT AATTTCGAAA CCATAATATT TACTAGTATG GTTTATAATA CCTTGTGAAT TAAGAAAAAA TGTGTTAGAA TAAATTTATA AATTTTCTCC AAAGCCTTCC CTTTTCAGGA AAAAAAACAT TCCTACAATG TATACATCTA ATGTTTTTTC
2B80
ATTTCTTGAT CTTGTTTTCT TAATTTTAAC
2940
AGTGGGGATT GAGAGCCAAG ATTAGGGTTT
3000
TGATACATTT AATATCTCTC TAGCTAGATT
3060
GTGTGTGTAA GTGTGTATAT GTATGCAAAT
3120
TTCTCAAATT CTGATCAGCT TTGACCTTAG
3180
CCTGATGCAT GTCAGTTTCT ACAATACACT
3240
GGGTTTACTT CAGTGAACAA AATTGGGTTC
3300
TAGGGGATGA TCAAGACTTA TGTAACCTCT
3360
ATGAGTTGTC ACTAGGGATC CATTTGATCA
3420
TGAGAATTTA TATGCTGAAG TTTTTCAACC
3480
ATTTGTATTT AGGGTAATTT GTCCAACTAG
3540
ACTTTGTCTA ACA1TGTATC AGTCATCAAA
3600
ATTTAGTCTC TTTTATTTTT TTTGTTTAGG
36S0
TGCATTGMA TATCAATGAG AGGGAGAGAA
3720
CGAGCCAATT GGAATCTCTG GCATTCTGAG
37B0
AAAAAATCCT TTAAAGATAC CTTCATGATG
3840
GGTCTAATTC CTCCTCAAAC CCTAATTACC
3900
TTTATATATC CTTACTTTAA GACATTGTTT
AAAAAAAAAC TTGTGGATCT ATTCAAGCCA
4020
TCGTACTGGT CAGATATTGG TCCAAACTCC
4080
TTCGAAATTA ACTCTAATTA ATCAAGAATT
4140
CGCGATCTTA CTTATTAGTG TGAGGGGTAC
4200AATTGAAAGG TACAAGAAAG CTTGTTCCGA TAATACTCAG GTACCAATTT ATATTGTTTG TATATATATG ATCAACAAAA AATATAACCT GAAACGGTTT CGTTATGGTG TTTGAATACA CTCTAAGCTT CGGAGGCAGA TTCGAGATAT TTCATGAACT CTTCGATTTG GTATTAGGTC TTGTAGTTTT CTTTAGAAGT TGTTTTGTTT TGTTGGGGAA TCACTTGGTT CCTTGAACTT TGAAAAAGGA ATCAGCCGTG TCCGCTCCAA TGTCTCTGTC TCTCTCTCTA TATATAGTCC GAGAATTTTG CAGAATGAGC TGTTAGTGGC AACGTTTCTC CCATTCCAAG TAATTAGATC CCCATAAATC ATGTGTAGGA AATGGAGTTG GTTAGCCACG TTCTGTTCCA AA丁CTTAATC CTAAGATAAC GTGAATAACA AGAAAACTTT GCCAGATTGA ATCCGGACCA GCAGGAATCG TCCGGTGTAT CTTCTCATGA CCAGTCGCAG CTTCTTGAAC CGAATCAGCA ATTCTCCGGC CTCAAAACAT GATAACTTGT TTCTTCCCCT CTVTTTTATAT TTATAACGCG ACTGTGTATT AAAACTGTTG TTTCTTTGCT TAATTACATC CGAGATCCAA AGTTTGTCAT ACAAGATTAG GTGCCTTTTA ATATTTACAT ATAGTTGCAG
TGCCGTCAAC CCTCCTTCCG TCACCGAAGC
4260
ATTCTCTTTG TTTTATCTTC TTCTTTTCAT
4320
ACAAAAAGAG AGAGTTCAAG GAAATGCATT
4380
TGGATTTTTG AAGTACTATC AGCAAGAAGC
4440
TCAGAATTCA AATAGGTAAT TCATTAACTT
4500
ACTTAATTTG GTGTCGGTCC AAAAGTCCGC
4560
AATGTTCATG TTTACAAATT GAAGGCATAT
CAAGGAACTC AAAAACCTAG AAGGACGTCT
4680
AAAGGTAAAA TCTACGTTGC TCTCTCTCTG
4740
CTTAGTTTAT ATAGTTCATC ACCCTTTTGT
4B00
AGAGATAGAG TATATGCAGA AGAGGGTAAG
48S0
TTTCTTCGTC TTTGTGAGGG TTTGAGTTTT
4920
CAACACAATA ACATGTACCT GCGAGCAAAG
49B0
TCAATATCTA CTCTTTTCTT CATTGTATAA
5040
TGTTTTTGGG TTTAATAGAT AGCCGAAGGC
5100
AGTGTGATAC AAGGGACGAC AGTTTACGAA
5160
CMTATAATC GGAACTATAT TCCGGTGAAC
5220
CAAGACCAAC CTCCTCTTCA ACTTGTGTAA
5280
CATAACGATT AAGAGAGAGA CGAGAGAGTT
5340
CATAGTTTAG GTTCTAATAA TGATAATAAC
5400
AACATTTAAA TCCAAAGTTC TAAAACACGT
54S0
ACGCATACAC GATCAGTTAA TAGATTTTAA
5S20
CTTCGATTAG ATCATGTCCA CCAAACACTC<formula>formula see original document page 62</formula>CTCTCATCAA GTTCTTTCTT GAAATGMTT TGAATGTGAA AATGTGTGTT GCTCGT'TAAG GAGGAATGGG CAAAACACAA AAGAGTTTCC TGAGAAAGGG TTCATGGATA ATGACTACAC GCTTTCATTT ACTTTATTAG TTTCATCTTC TTCTTTTGTC TAAATTACGT AATATGATGT CCGTTGGACT AACCTAATGT CCAAGATTAA AACCAGTTAT AATATATACT CTTAAATTGC TACTATTTAC AGTTTTTTTT AATTGGCAAG GGTAGTTGAC AAGTTATAAC ACTCATATTC CACTCATATA AACCACCCAA ATTCTTAGCA ATTTTTTTTA TATATAAAAT GCCAGGTAAA GGGCAATAAA AAGAAAAGGA GAATAAAAAG GTGATTCTGA TGAGAAACAG AGCCCATACC ATTGGATGGT CCTCCTTCAA TGCTCTCTCC CTTTCTTTTT TCTTCTTTCT AATTTGATAT ATTTCAATCT AAATGTATGC ATATAGAATT AGAAAATGTT AGAAGTAATG GTCCATGTTC GTTTGAAAAA AAACTACCAA ACCTTCTGTT AGAAATATTC CTCTAAAAGA AATTATAAAC TTGAAGCAGC AGTTAAGTGG TACTGAGATA AATTAACTCT CTCATAATTC ATCTTCCCAT ATCTTGCTAA GCCAGGTATG GTTATTGATG
12"
TGCAGAMTT CCAACTTAAT TAATTCGACA
1320
AAAATTGAAT AGAAGTACAA TGAAAATGAT
1380
TTTCGTAACT ACAATTAATT AATGCAAATC
1440
ACATGATTAG TCATTCCCCG TGGGCTCTCT
1500
TCTAATTATA TTGTCGCATA TATGATGCAG
1560
AATTAATTAT CAAAATAAAT ATTCAAATTG
1620
GACTTGAACA TAAGAATTTT GGAAAAACTA
1680
CATTTCTGAA CACAACCAAA TAATAATATA
1740
AACACTGAAA TCTTATTCAT TGTCTCGCTT
1BO0
ATATAACCCC ATTCTAACGT TGACGACGAA
1860
TATTAGCTAA ATATTGGTTT AATTGGAAAT
1920
TATTAACGAC ATGCAATGTA TATAGGAGTA
1980
GGATTACCAA AAAAGGAAAG TTTCCAAAAG
2040
TCTCTTTTTT CCTCTAAACA TGAAAGAAAA
2100
CCACCCAATC CAAACCCAAC TGTCTTCTTT
2160
TTTCTACCAC TTAATTCCAA TCAATTTCAA
2220
TAATTAAAAG AATTAGG丁GT GTGATATTTG
2280
TTTCTTTCTT TTTCCTTCTA TAACACTTCA
2340
TTCTGCAAAT GGGTTTTTAA ATACTTCCAA
2400
CAAAACAGAA ACCAAAAACA AAAAATAAAG
24S0
ATAAGAATAG TATCTTTAGG CCAATGAAC'A
2520
CCTCACTTCT CTTTCTTTCT GATATA iT'IA
2580
ATTTACACTT TTTTTTAAAA GTTTCTTCCT2640
TTTCTCCAAT CAAATTCTTC AGTTAATCCT TATAAACCAT TTCTTTAATC CAAGGTGTTT
2700
GAGTGCAAAA GGATTTGATC TATTTCTCTT GTGTTTATAC TTCAGCTAGG GCTTATAGAA
2760
ATOGAGGGTG GTCCGAGTAA TOAAGTAGCA GAGAGCAGCA AGAAGATAGG GAGAGGGAAG
2820
ATAGAGATAA AGAGGATAGA GAACACTACG AATCGTCAAG TCACTTTCTG CAAACGACGC
2880
AATGGTTTAC TCAAGAAAGC TTATGAGCTC TCTGTCTTGT GTGACGCTGA GGTTGCTCTT
2940
GTCATCTTCT CCACTCGAGG CCGTCTCTAC GAGTACGCCA ACAACAGGTA CACATCTTTT
3000
AGCTAGATCT TGATTTTGTT GAATTTTTTT TCTAGAATAA AGTTTCGACT CTTCTGGTGG
3060
GTTTTTCAAT CTTTATGGTC TCTTTATAGT TTTTTTCCTT AGTTTCTCTG AAGCTCAAAT
3120
CTCTTTAAAA ATCCCCAAAA TTAGGGTTTG TTTAAAACTA GGGAACCCTA CTTTAACTTC
3180
TTTCTCTTAG TAAAAAAGCA GTGAGGGTCT TCTCTGATCA TTAATTAGCA TCCCCCATAC
3240
CTTGTTCCAG TCACTTTTTC TCCACAAATC CTTATAACAG TATCTATATA TGTATCTATT
3300
TATGTCAGTT TGTACAAGAC ACTTCGATCA ATTTGATGAC CCATCAAGTT TTATTTCTGC
3360
AGATTGATCA TTAGGTTTCC ATCATAGTAA TGAAAAAGTA GGGTTCTTGA TAAAATTATA
3420
ATAATATATA TTATTTGGCT ATATAAAAAA GCTATGTAGA TTCCTTAAAA ATTGATTCAC
3480
TAGGGAGAGA CTAGTAGGTG TTTGTCTTCT GACACTTCTC TAATCTTTTG GTGAATCCTT
3540
TTGTTAAATC AAGAAAATGA ATCAGGGACA AAGCTTATTG TTGAGTCACT TAATTAATCA
3600
TCCGATCCAT CAATCAAGAA AAATAACGAA ACAGAAAATT TTGATTTTTG ATTGTTATTT
3660
TCTCCACTTC AAGTTGGGGA CTTGTCATTT CCGTTTTTCT ATACGTTTCC AGCTATTAAC
3720
AGCTCATGTT CATTTCACCA TTTTGATTAT TTGTCTGCTT TTTAAAGATA AATGTTTTCA
3780
AAAATATTGT TTTTATTTGC TTGGCTAGTT AATACTATAA TTGAGGTTGA TGTATGACTA
3840
TAATCTATAA GTCAAGTCTC ATATCATGGA TCTAAGTTAA AACTAGTAAA TTTGTAGTTT
3900
CAATGTGAAC TTTCACAACG ACTAAAGAAC TGATCTGAAG TTTATAATGG ACATGACTAA
3960TTTGATTAAC AAAAGAGGAA TGCATTATGT ATGTAGAAAC ATGTGATATA TATATGTTTC
4020
TATTATCAAA AGTGTAGTTA ACTTTCTTAT TTCAAACACC CTCATGCTTT AGTAGTATCT
備O
TACTTTTGAC ATTTCTCAAC TTCAGCTTTC CATTATACAA CAGCACAATG TAAATTACTT
4140
GTATATGAAT ATGAAAGCAT AACGTTATGC AAAGATTTCT AGCTTTTCTT TTTCTGTTTT
420C
GCAAAAGATT TACAAATATC ATGTTCTTGG TAAAAACATA CTTGCCTCAG CCACATATGC
ATGTAAATGT AATGTTCAAA TATTAATTCA GGAAAAACAA AGAAGAAGCA AAATTAGCTT
4320
CTAGAGTAGG GAATCTATTG ACTTGACCTG AAAATCACTT CTTTTTCTTA AAGCCTAGTA
4380
GTGAATTTTT TAATCTAATT AGGCCAAAAT ATATACTAGC CTAAAATATA ATTTGGATTT
444D
TGTGTCGTAC ATAAATTGGG ACCAATTCCA ATTAACTAAG AGCATATGCA ATTCAAATTC
450D
TTTTTATTTT CTTCTCCGAT TTGCTACTTC TTTCTTTTGT ATGTTTTCAA ATTAGGATTA
4560
CACTTTTTTG GGGAAGTACA CATTAGGGTC TTCTCGAACT T丁GATTATAC ATATATATAT
4620
ATATATATAT ATATAACTTT GTGAGATGTC ACTGTTAATA GATAATAGGC AATAACAATA
4S80
ATATCCAAAA AAGAAGGCGC AAACAAATCA TATACTATAT GGTACTGGTC CATTCACTAT
TTTGTCGGTT GAATTTAAGG TTTGGCGTAC AAACTTTGTT TCAAACCTTT ATTATTCCGT
4800
CTTTCTGTGT GTTTTGTATA TCCAGAAGAT AAAAATATCA ATTTCTTTAA CGACTTCATA
TATATATATA TATATATATA TATATATATT TTTCTCTTCT GGTTTTAGTG TTTGAATCCA
4920
ACAGTTATAG TTTCGTGTGT CTTTGTTTTA CTTGTGGTGG TTTAAGTTTG AGATTTTCAC
4980
CGATTGCATC TATTTACATA TATAGCTACC ACAAAAAAGA TTGCATTTTA AAATCTTTTC
5040
CTTTGTGTGA ATGTTGATGA AGTGTGAGAG GAACAATAGA AAGGTACAAG AAAGCTTGCT
5100
CCGACGCCGT TAACCCTCCG ACCATCACCG AAGCTAATAC TCAGGTTAGC TTTTAATTAA
5160
TACACCTAGC TAGCTAGTTC GTTAATTACT TAATTTCTTC TTCTTTTAGT TATCTC，ACCT
522 0
TTTTTTCACC TCTTGTAACA ATGATGGGAT CGAAATTGAT GAAGTACTAT CAGCAAGAGJG
5280
CGTCTAAACT CCGGAGACAG ATTCGGGACA TTCAGAATTT GAACAGACAC ATTCTT(—,'GTG
655340
AATCTCTTGG TTCCTTGAAC ITTAAGGAAC TCAAGAACCT TGAAAGTAGG CTTGAGAAAG
5400
GAATCAGTCG TGTCCGATCC AAGAAGGTAC ATCACTAACT CTCCATCAAT CTCCTTATCA
5460
TTGAATATAT ATCCATCTGA TTCTTGCCCG TTATATTTGG TTTTTCTCTC CAGCACGAGA
5520
TGTTAGTTGC AGAGATTGAA TACATGCAAA AAAGGGTAAA AGTAAAACCT ATCTTCCTTC
5580
ACAATGAACT ACCCCTACTT TATTAGCAAC TTCTCTTTCT GATGATCATC TTTTTTATTT
5S40
TCTGT丁GTCG CTTGCATTGT AGGAAATCGA GCTGCAAAAC GATAACATGT ATCTCCGCTC
. 5700 CAAGGTTTTA TACATAACTC TTTTTGGCAT TTTTGATCAT CATTTTTTTC CGGTAGACAA
57S0
TCTCTTGATG TCCAAATTCT AAATATCTCT GCAGATTACT GAAAGAACAG GTCTACAGCA
5820
ACAAGAATCG AGTGTGATAC ATCAAGGGAC AGTTTACGAG TCGGOTGTTA CTTCTTCTCA
5880
CCAGTCGGGG CAGTATAACC GGAATTATAT TGCGGTTAAC CTTCTTGAAC CGAATCAGAA
5940
TTCCTCCAAC CAAGACCAAC CACCTCTGCA ACTTOTTTGA TTCAGTCTAA CATAAGCTTC
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TTTCCTCAGC CTGAGATCGA TCTATAGTG丁 CACCTAAATG CGGCCGCGTC CCTCAACATC
TAGTCGCAAG CTGAGGGGAA CCACTAGTGT CATACGAACC TCCAAGAGAC GGTTACACAA
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ACGGGTACAT TGTTGATGTC ATGTATGACA ATCGCCCAAG TAAGTATCCA GCTGTGTTCA GAACGTACGT CCGAATTC
SEQIDNO:7 BnINDl推定cDNA序列
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SEqiDNO:lO Bn IND2氨基酸序列
MMEHHHLLMNWNKPIDLITEENSFNHNPHFIVDPPSETLSHFQPPPTrFSDHGGGEEA EEEEEEEGEEEMDPMKKMQYAIAAMQPVDLDPATVPKPNRRNVRVSDDPQTWAR RRRERISEKmiLKRMVPGGAKMDTASMLDEAJRYTKFLKRQVRLASSASHSAWSSY
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SEGIDNO:ll Bn膨l SK377
TATCACCACAAACCCTAGACAGGCGAGCCGAG . 、CCACTGATATCCTCCTCTTGT ACGTCCTCGCCGTTGTCGGAGAGTTTCATCATC^rCCGAGATCTCATCCGCGATG
SEQ ID NO:S BnlND2推定cDNA序列
TGTCTGACCCTTCTTGCCTTTGTTATTACCACAACTCGGATACCTAA<formula>formula see original document page 68</formula>SEQIDNO:12 Bn励2 SK378
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权利要求
1. 一种分离的核酸，其包含编码与SEQ ID NO9或SEQ ID NO10具有至少90％同一性的多肽的多核苷酸。
2. 权利要求l的分离的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID N0:9。
3. 权利要求l的分离的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 10。
4. 权利要求1的分离的核酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDN0:7。
5. 权利要求1的分离的核酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDN0:8。
6. 权利要求1的分离的核酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:ll。
7. 权利要求1的分离的核酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID N0:12。
8. —种表达盒，其包含与多核苷酸或者其互补体有效连接的启动 子，其中所述的多核苷酸与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8的至 少200个连续核苷酸具有至少90%同一性。
9. 权利要求8的表达盒，其中所述序列包含SEQ ID N0:9。
10. 权利要求8的表达盒，其中所述序列包含SEQ ID N0:10。
11. 权利要求8的表达盒，其中所述多核苷酸与编码SEQ ID N0:9 的核苷酸序列有至少90%同一性。
12. 权利要求8的表达盒，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID N0:9 的核苷酸序列。
13. 权利要求8的表达盒，其中所述多核苷酸与编码SEQ ID N0:10 的核苷酸序列有至少90%同一性。
14. 权利要求8的表达盒，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列。
15. 权利要求8的表达盒，其中所述启动子是组成型的。
16. 权利要求8的表达盒，其中所述启动子是组织特异的。
17. 权利要求8的表达盒，其中所述启动子是开裂区特异的启动子。
18. 权利要求8的表达盒，其中所述多核苷酸以反义方向有效连接启动子。
19. 权利要求8的表达盒，其中所述多核苷酸以有义方向有效连接 启动子。
20. 包含重组表达盒的植物，该表达盒包含与多核苷酸或者其互补体有效连接的启动子，其中该多核苷酸与编码SEQ ID N0:9或 SEQ ID NO: 10的序列的至少200个连续核苷酸具有至少90°/0同 一性。
21. 权利要求20的植物，其中所述序列包含SEQ ID N0:9。
22. 权利要求20的植物，其中所述序列包含SEQ ID NO: 10。
23. 权利要求20的植物，其中所述多核苷酸与编码SEQ ID N0:9 的核苷酸序列有至少90%同一性。
24. 权利要求20的植物，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID N0:9 的核苷酸序列。
25. 权利要求20的植物，其中所述多核苷酸与编码SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列有至少90%同一性。
26. 权利要求20的植物，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列。
27. 权利要求20的植物，其中所述启动子是组成型的。
28. 权利要求20的植物，其中所述启动子是组织特异的。
29. 权利要求20的植物，其中所述启动子是开裂区特异的启动子。
30. 权利要求20的植物，其中所述多核苷酸以反义方向有效连接 启动子。
31. 权利要求20的植物，其中所述多核苷酸以有义方向有效连接 启动子。
32. 权利要求20的植物，其中在植物的瓣膜边缘细胞中木质化减 少。
33. 权利要求20的植物，其中木质化在所述植物中增强。
34. 权利要求20的植物，其中所述植物是芸苔属物种。
35. 权利要求20的植物，其中所述植物的特征是与不包含所述表 达盒的植物相比具有延迟的种子开裂。
36. 延迟植物中果实开裂的方法，该方法包括-通过向植物中导入重组表达盒抑制植物中IND1核酸的表达，所述重组表达盒包含有效连接多核苷酸或者其互补体的启动子，其中该多核苷酸与编码SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10 的序列的至少200个连续核苷酸具有至少90%同一性；和选择与其中没有导入表达盒的植物相比，具有延迟的果实 开裂的植物。
37. 权利要求36的方法，其中所述序列包含SEQ ID N0:9。
38. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 10。
39. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸与编码SEQ ID N0:9 的核苷酸序列有至少90%同一性。
40. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID N0:9 的核苷酸序列。
41. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸与编码SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列有至少90%同一性。
42. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸包含编码SEQIDN0:10的核苷酸序列。
43. 权利要求36的方法，其中所述启动子是组成型的。
44. 权利要求36的方法，其中所述启动子是组织特异的。
45. 权利要求36的方法，其中所述启动子是开裂区特异的启动子。
46. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸以反义方向有效连接 启动子。
47. 权利要求36的方法，其中所述多核苷酸以有义方向有效连接 启动子。
48. 权利要求36的方法，其中使用农杆菌将重组表达盒导入植物。
49. 权利要求36的方法，其中所述植物是芸苔属物种。
全文摘要
本发明提供了芸苔属INDEHISCENT1(BIND)序列。
文档编号A01H1/00GK101431889SQ200580027817
公开日2009年5月13日 申请日期2005年6月9日 优先权日2004年6月18日
发明者M·F·亚诺夫斯基, S·肯宾 申请人:加利福尼亚大学董事会