克氏原螯虾细胞周期相关的cyclinB基因及其编码蛋白的鉴定的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明设及克氏原馨邮基因，属于水产基因工程领域。具体是一个细胞周期相关 的周期蛋白cyclinB基因及其编码蛋白的克隆与鉴定，其用于克氏原馨邮人工养殖的性腺 同步调控研究。
【背景技术】：
[0002] 克氏原馨邮（Procambarusclarkii)，俗称龙邮、小龙邮，隶属节肢动物口、甲壳 纲、十足目，是具较高经济价值的水产养殖品种之一；同时，克氏原馨邮还具有成本低、易饲 养、体型较大易于人工养殖等优点，因此近几十年来国内有关于小龙邮的人工养殖规模和 养殖技术都发展得很快。但是随着发展的强势推进，诸多问题随之凸显出来，比如：人工养 殖的雌邮卵巢发育不同步，发育成熟度不高，抱卵量低等，造成亲邮培育技术一直是限制小 龙邮规模化人工养殖的瓶颈。如何实现无/弱副作用的人工卵巢发育调控成为克氏原馨邮 养殖W及其它经济邮蟹养殖的重要难题之一。目前人们已摸索出不少促邮蟹卵巢快速成熟 方法，如控溫、控光、强化营养条件、激素处理、手术介入等等。然而，应用实践中会出现无法 避免的副作用，比如控溫控光存在过程不可控；激素处理过程繁琐；手术介入如切除眼柄 后易致亲体蚁皮周期缩短、死亡率上升、卵子质量下降等不良后果。
[0003] 水产养殖的目标是提高经济水产产品的产量和品质。现代基因工程技术从遗传基 因型的角度出发，可W将优良外源基因导入并整合到基因组中，使其辅助获得自身不具备 的新性状，并在其后代中得W遗传和表达。运样可W大大拓宽水产养殖品种的遗传改良的 途径。克氏原馨邮细胞周期相关基因的克隆鉴定，不仅有助于研究掲示克氏原馨邮卵母细 胞周期调控机理，而且可W充分利用自身资源改进人工养殖中存在的卵巢发育同步化的问 题，具有重要的理论意义和巨大的潜在经济价值。
【发明内容】
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[0004] 本发明提供了一种克氏原馨邮细胞周期相关的cyclinB基因及其编码蛋白的鉴 定。 阳0化]本发明是通过W下技术方案实现的：克氏原馨邮巧ClinB基因，是如SEQIDNo. 1 所示的碱基序列；或在SEQIDNo. 1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺 失或/和插入的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有cyclinB编码蛋白 的功能或活性。
[0006] SEQIDNo. 1是从克氏原馨邮卵巢组织中克隆出的基因，命名为cyclinB，开放阅 读框1209bp，编码由402个氨基酸残基组成的蛋白质，其序列如SEQIDNo. 2所示。
[0007] SEQIDNo. 1所示的碱基序列或者在严格条件下与其杂交且编码得到的仍具有 cyclinB编码蛋白的功能或活性的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述SEQIDNo. 1 所示的碱基序列是利用NCBI数据库中的基因序列，查找与克氏原馨邮周期蛋白CDNA同源 的EST片段，根据同源片段设计兼并引物，测序之后再采用RACE方法分别扩增出首尾两端 的序列，将上述片段进行序列拼装，组合成完整ORF的CDNA序列，根据运些序列设计特异性 的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得完整的巧CIinB基因。
[0008] 本发明的目的之二是提供一种克氏原馨邮巧ClinB基因编码蛋白，是如SEQID No. 2所示的蛋白质所示的蛋白，W及将SEQIDNo. 2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸 的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有cyclinB基因功能或活性的蛋白变体。
[0009] 本发明提供的巧clinB基因编码的蛋白包含了 2个巧clinSiipe计amily结构域， 其氨基酸序列与斑节对邮的同源性达约90%。
[0010] 另外，本发明提供了克氏原馨邮cyclinB基因在人工养殖的性腺同步调控研究中 的应用。含有克氏原馨邮cyclinB基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系也属于本发 明的保护范围。
【具体实施方式】：
[0011] 本发明通过W下实施方式作进一步阐述，但不限制本发明的范围。
[0012] 实施例1.克氏原馨邮cyclinB基因CDNA序列及其编码序列的分离鉴定
[0013] 利用NCBI公共数据库中的基因序列，查找与克氏原馨邮周期蛋白CDNA同源的 EST片段，根据同源片段设计兼并引物，测序之后再采用RACE方法分别扩增出首尾两端的 序列，将上述片段进行序列拼装，组合成完整ORF的CDNA序列，根据运些序列设计特异性的 PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得完整的巧ClinB基因。克氏原馨邮巧ClinB基因CDNA 序列如SEQIDNo. 1所示，开放阅读框编码蛋白全长序列如SEQIDNo. 2所示。
[0014] 实施例2.定量RT-PCR分析克氏原馨邮巧ClinB基因的表达
[0015] 提取克氏原馨邮卵巢组织总RNA，采用实时巧光定量RT-PCR技术研究基因表 达。首先，利用反转录酶（M-MLVRNaseH-ReverseI'ranscriptase,Promega)将不同 组织（卵巢，精巢，屯、脏，肌肉，肝，觸，眼，脑，肠和血细胞）的总RNA(2yg/样品）反转 录成CDNA;然后，WCDNA为模板，用基因特异引物（5'-GGATGTGGAGGAAGTGGC-3'和 5，-AATTGCCAGACTGCAATTTATTG-3'）和Real-timePCRMasterMix灯0Y0B0,Japan)进行定 量PCR反应。克氏原馨邮18SrRNA基因（GenBankaccessionno.AF436001)作为反应内 标（引物序列分别为 5' -TGGTGCATGGCCGTTCTTA-3' 和 5' -AATTGCTGGAGATCCGTCGAC-3'）， 目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green巧光检测。每个基因的表达水平相对值按公 式Y二IQaaGxlOO%计算（其中ACt=Ct巧ClinB-CtlSSrRNA)。重复 3 次，统计分 析实验结果。结果显示克氏原馨邮cyclinB基因在卵巢组织和屯、脏中优势高量表达，表明 该基因可能参与卵母细胞周期调控和卵巢发育过程。
【主权项】
1. 克氏原螯奸周期蛋白cyclinB基因，其特征在于：其cDNA序列如下：开放阅读框为第87-1295位碱基，编码402个氨基酸。2. 权利要求1所述的克氏原螯奸cyclinB基因编码的蛋白质序列如下：
【专利摘要】一种克氏原螯虾细胞周期相关的cyclin？B基因及其编码蛋白的鉴定。公开了克氏原螯虾周期蛋白cyclin？B基因全长序列。该基因的cDNA全长为1295bp，5’端非编码区为86bp，开放阅读框为1209bp，编码402个氨基酸残基，编码蛋白平均分子质量为45745.5，pI为8.93。cyclin？B基因编码的蛋白包含有2个cyclin？superfamily结构域。BLAST比对后发现，其氨基酸序列与斑节对虾的同源性达约90％。半定量RT-PCR结果显示，cyclin？B基因在不同组织表达中具有明显的组织特异性，在卵巢和心脏中有较高的表达量。推测该差异性主要与cyclin？B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关，该基因可用于克氏原螯虾人工养殖的性腺发育调控研究。
【IPC分类】C12N15/12, C07K14/435
【公开号】CN105219778
【申请号】CN201510762920
【发明人】水燕, 徐增洪, 沈怀舜, 周鑫
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月10日