一种用于对虾细胞的病毒启动子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学重组表达技术领域，具体设及一种用于对邮细胞的启动 子。
【背景技术】
[0002] 对邮病毒病的频繁爆发一直是困扰对邮养殖业并亟待解决的一个难题，而对邮永 生性细胞系是分离和纯化对邮病毒、研究病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技 术W及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。尽管国内外专家学者在对邮细胞的 体外培养和建系上进行了大量的探索和不懈的努力，但目前对邮的细胞培养仍然处于原代 培养水平，永生性的细胞系一直未能成功建立。
[0003] 对邮细胞建系失败的主要原因是体外培养对邮细胞的有丝分裂相极低，甚至不分 裂。已有人尝试电离福射和化学诱变剂处理，W及将对邮细胞与肿瘤细胞融合，向培养基 中添加各种生长因子，等等，试图诱导对邮细胞永生性转化，但都没有成功。由于在哺乳动 物细胞中，人们可W通过过表达癌基因和细胞周期调控相关基因，成功诱导细胞发生永生 性转化。因此，1995年，Tapay等首次尝试将猿猴病毒40 (SV40)大T抗原基因（SV40T)转 染到南美蓝对邮（Penaeusstylirostris)原代培养类淋己细胞中，虽然观察到细胞变圆， 贴壁不紧，生长速度变快等转化特征，但未能成功得到永生性对邮细胞系。随后，Claydon 和0wens(2008)又尝试将病毒（papillomavirus,HPV)癌基因E6andE7转染到小龙邮 K虹taxqua化icarinatus)血细胞中，也未获成功。化等（2008,2010)又利用逆转录病毒 载体介导SV40T基因在中国对邮原代培养类淋己细胞和卵巢细胞中的基因转染。Shike等 (2000)又检测了 4种哺乳动物来源启动子在驱动巧光素酶报告基因在对邮细胞中表达上 的活性，运4个启动子包括热休克蛋白70化sp70)、杆状病毒早期基因启动子（IE-I)、莫洛 尼鼠白血病病毒（MMLV)和鸟劳氏肉瘤病毒巧SV)长末端重复序列化TR)启动子。
[0004] 遗憾的是，W上研究最后都没有成功实现对邮细胞的永生性转化。失败的主要原 因可能与其采用哺乳动物来源基因和启动子，导致在对邮细胞中不亲和W及表达效率低有 关。体外培养对邮细胞难W被转染，外源基因的整合与表达效率低，是与其细胞分裂不活跃 有关值ean等，2005)。运可能也是导致哺乳动物来源的许多强启动子在对邮细胞中活性低 甚至无活性的主要原因。由此，有必要提供一种有效的适用于对邮细胞的启动子。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于对邮细胞的启动子，用于对邮细胞的转染，从而弥 补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种启动子，该启动子的核巧酸序列为SEQIDN0:2。
[0007] 上述的启动子用于构建真核表达载体，该表达载体可使外源目的基因在对邮细胞 中高效表达。
[000引本发明进一步提供了一种在对邮细胞中表达外源基因的方法，是用上述表达载体 将外源目的基因导入对邮细胞中。
[0009] 因为对邮细胞不分裂，难W转染，故验证所构建表达质粒是否能正确表达存在困 难。应用本发明所设计的启动子的表达载体则可W很好地解决此问题。当此载体的外源基 因是报告基因或含有报告基因的融合蛋白时，该载体可通过在哺乳动物细胞中的报告基因 表达来验证其质粒构建的成功与否，然后将构建成功的质粒用于对邮细胞转染，提高对邮 细胞转染成功率，减少对邮细胞原代培养物的浪费，节约时间和成本，从而弥补现有技术的 不足。
【附图说明】
[0010] 图1 :启动子Piei/2。。。的PCR扩增和3种表达载体的构建。A，PW/2。。。启动子的PCR 扩增结果，经测序验证，结果正确。B，pcDNA-Pc"-eGFP质粒图谱。C，pcDNA-Pc"-Pw/2DDD-eGFP 的质粒图谱。D，pcDNA-APemv-Piel/2000-eGFP(无Pemv启动子）的质粒图谱。
[00川图 2 :3 种表达质粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APc"-Pw/2<Me-eGFP(C和Cl)转染哺乳动物细胞Plat-GP的巧光表达结果。A、B和 C为转染后4她的光镜照片。AUBl和Cl为转染后4她的巧光照片。
[001引图3 :3种表达质粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APe"-Pw/2DDD-eGFP(C和Cl)转染哺乳动物神经瘤细胞化uro2A的巧光表达结果。 A、B和C为转染后4她的光镜照片。AU Bl和Cl为转染后4她的巧光照片。
[001 引 图 4 :3 种表达质粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APc"-Pw/2e<M-eGFP(C和Cl)转染鱼类细胞FG的巧光表达结果。A、B和C为转染 后4她的光镜照片。AUBl和Cl为转染后4她的巧光照片。
[0014]图 5 :表达质粒pcDNA-Pcmv-Piei/2000-eGFP (A和Al)和pcDNA- A Pcmv-Piel/2000-eGFP度 和BI)转染对邮类淋己组织原代培养细胞后，未见明显巧光信号。A和B为转染后4她的光 镜照片。Al和Bl为转染后48h的巧光照片。
[001引图：6 :对邮WSSV病毒iel基因启动子Pw/2。。。的序列及其转录因子结合位点分析， 长度2000bp。
[001引图7康达质粒pcDNA-Pemv-mCherry的图谱。
[0017]图8 :PCR扩增mCher巧基因编码区和突变启动子Piei/519的电泳结果。M，DNAmarker。泳道1为mCherry基因扩增产物，泳道2为启动子Pw/519扩增产物。
[001 引图 9:表达质粒pcDNA-Pemv-Piei/519-mCher巧的图谱。
[001 引 图 10 :表达质粒pcDNA-Pcmv-Piei/sig-mOierry(A和Al)和pcDNA-Pcmv-mOierry度和BI)转染哺乳动物神经瘤细胞，可观察到强红色巧光表达，且前者（Al)巧光比后者度1)弱。 A和B为光镜照片。Al和Bl为巧光照片。
[0020]图11:表达质粒pcDNA-Pcmv-mCher巧(A和Al)和pcDNA-Pcmv-Piei/519-mCher巧度和BI)转染对邮原代培养类淋己细胞后，前者无红色巧光表达，后者有红色巧光表达。A和B 为光镜照片。Al和Bl为巧光照片。
【具体实施方式】
[002。 申请人在研究中发现，对邮WSSV病毒的iel基因启动子片段（核巧酸序列SEQID NO:I)不能驱动外源基因在对邮细胞中有效表达，因此，申请人对该启动子的转录因子结合 位点进行了详尽的分析，并选择性地对其进行了截短。改进后的对邮WSSV病毒iel基因启 动子片段（核巧酸序列S