专利名称：杆状病毒全期启动子盒及含该全期启动子盒的载体系统的制作方法
技术领域：
本发明属于昆虫杆状病毒的基因工程，具体涉及杆状病毒的全期启动子盒及含有该全期启动子盒的杆状病毒载体系统。
杆状病毒载体系统的建立和发展，是80年代真核基因表达研究领域的重大进展之一(Luckow & Summers 1988 Trends in the development of baculovirusexpression vectors Bio/technology 647-55)。与细菌、酵母细胞及哺乳动物细胞表达系统相比，这种无脊椎动物表达载休的最大优点是能高效(100-500mg/L)而广泛地表达外源基因产物。由于具有翻译后修饰加工系统，表达产物在大多数情况下，其抗原性、免疫原性和其它生物学功能都与天然蛋白质非常相似。因此，较高等的真核细胞内的蛋白质修饰、剪接及输送可在该表达系统内进行，这对于重组蛋白质是否具有生物学功能是必须的。此外，杆状病毒对脊椎动物或植物无致病性，使用安全。与哺乳动物表达系统不同，该系统无需用转化细胞或转化因子，操作更简便(O’Reilly，et al.1994 Baculovirus expression vectors A laboratorymanual New York，WH Freeman)。
常规的杆状病毒载体系统是建立在病毒复制最晚期高效表达的多角休(polh)基因可被外源基因取代这一基础上的。自Smith等1983年重组出第一个缺失多角体蛋白基因的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)以来，许多实验室相继构建了各种能取代AcNPV多角体蛋白基因的转移载体质粒。其主要策略是利用多角体(polh)基因的强启动子及其它一些基因元件，经细胞内同源重组，将外源基因片段引入野生型杆状病毒基因组，产生重组病毒，经过一系列的空斑筛选、纯化得到重组病毒。这条路线已相当成熟，且一直沿用至今，而近几年发展起来的几种新策略，极大地提高了重组效率，如线性化杆状病毒基因组(Kitts，et al.1990.Linearzation ofbaculovirus DNA enhances the recovery of recombinant virus expression vectors.NuclAcids Res 185667；Kitts，et al.1993 A method for producing recombinant baculoviruscxpression vectors at high frequency.Biotechniques 14810-817)酿酒酵母中YAC介导的重组(Patel，et al.1992.A new method for the isolation of recombinantbaculovirus.Nucl Acids Res 2097-104)；大肠杆菌内转座子介导的重组(Luckow，et al.1993.Efficient genaration of infections recombinant baculovirus by site-specifictransporson-midiated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated inE.coli.J Virol 674566-4579)，以及体外位点特异重组等。上述各种用于操纵杆状病毒的策略，其共同之处是破坏了杆状病毒polh基因，重组病毒不能形成多角体(OCC)，因而在利用昆虫虫体表达外源基因方面显得极为不便(必须通过注射来感染虫体)。研究结果表明，在保留全部病毒基因的情况下，仅将另一拷贝启动子及与之相连的外源基因片段插入到polh基因或p10基因附近，由此构建的转移载体也能把外源基因重组至杆状病毒基因组中，并获得良好的表达效果(王珣章等，1991，形成多角体的杆状病毒载体系统的建立。病毒学报7253-261；王珣章等，1992，人工合成杆状病毒后期启动子的探讨。中国科学(B辑)139-46龙綮新等，1991，乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫体系中的表达。生物工程学报737-46)。本实验室曾首次探讨了人工合成模拟杆状病毒后期启动子的方法，建立了既保留传统高效表达外源基因的特点、又形成多角体的重组杆状病毒体系(王珣章等，1991，形成多角体的杆状病毒载体系统的建立。病毒学报7253-261王珣章等，1992，人工合成杆状病毒后期启动子的探讨。中国科学(B辑)139-46)。此系统除可用作表达载体(可经口服大规模感染昆虫，免去注射感染虫体的麻烦)外，还因能形成多角体，可用于新型病毒基因工程杀虫剂的研制。
综上所述，目前构建的杆状病毒载体系统是以早期或晚期启动子(如Pie1、Pp10、Ppolh)控制外源基因的表达，其中大多数是选择Ppolh或Pp10等单一的启动子来构建载体。用这些载体重组的杆状病毒，其外源基因只在感染后期得到表达，而且表达水平不够高。
本发明的目的是设计构建出杆状病毒的全期启动子盒，并构建出含有该全期启动子盒的杆状病毒载体系统，以实现对外源基因的全期表达，并达到提高其表达水平的目的。另外，本发明的载体系统由于在插入外源基因的同时保留了全部病毒基因，所得重组病毒可形成多角体，故此系统除可用作表达载体外，还可用于病毒基因工程杀虫剂的研制。
杆状病毒p35基因的启动子活性很强，且兼具早晚期调控元件，其早期启动子元件指导非剪接的α1 RNA的合成，α1在病毒感染宿主细胞后第1小时内出现，4～8小时后达到最高水平，以后逐渐下降。感染后期，p35启动子从晚期调控元件的基序处起始合成α2 RNA，但丰度不及α1 RNA(Dickson & Friesen.1991.Identification of upstream promoter elements mediating early transcription from the35,000molecular-weight protein genes of Autographa californica nuclear polyhedrosisvirus.J Vtrol.654006-4016)。因此，该基因在病毒感染寄主细胞期间始终处于活跃的表达状态，尤以早期的表达水平为高。据此，本发明将p35启动子与已有的晚期和极晚期启动子串联构成了能实现对外源基因全期高效表达的全期启动子盒。
本发明的全期启动子盒由杆状病毒的p35基因的启动子(Pp35)与人工合成的后期启动子(Psyn)和多角体XIV启动子(PXTV)串联构成，其DNA序列如
图1所示。
构成上述全期启动子盒的Pp35可通过PCR方法，以粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)DNA(施先宗，1996，粉纹夜蛾核型多角体病毒p35基因功能的研究，中山大学博士学位论文)为模板，对p35启动子序列进行扩增而得到Psyn和PXTV可从质粒pSXIVVI+X3(王珣章等，1991，形成多角体的杆状病毒载体系统的建立，病毒学报，7253～261)得到。
本发明还构建了含有上述全期启动子盒的杆状病毒载体系统。该载体系统的构建方法可以是将全期启动子盒插入到一般的杆状病毒载体质粒上；也可以是将Pp35插入到含有Psyn和PXTV串联双启动子的杆状病毒载体质粒上，使Pp35与质粒中原有的Psyn和PXIV串联构成全期启动子盒。
本发明杆状病毒全期启动子盒可用于构建能对外源基因实现全期高效表达的杆状病毒载体系统。也就是说，本发明含有全期启动子盒的杆状病毒载体系统能使外源基因在被重组病毒感染的寄主细胞或昆虫体内即时、持续、高效地表达，且具有生物学活性。例如本发明实施例四，用pSX35(含全期启动子盒)和pSXIVVI+X3(含晚期、极晚期双启动子)分别构建表达乙肝表面抗原(HBsAg)基因的重组杆状病毒TnNPV-SX35-HBs(全期表达)和TnNPV-HBs(晚期表达。作为本项目对照)。感染Sf细胞(王珣章等，1991，形成多角体的杆状病毒载体系统的建立，病毒学报，7253～261)，前者4小时(4 hours postinfection，4 hpi)即能检测到HBsAg基因的表达，对照则需12小时；前者24 hpi IIBsAg蛋白的表达量可达159mIU/mL，比对照提高1.8倍。
本发明的载体系统还可应用于高效广谱基因工程病毒杀虫剂的研制，例如，可将昆虫特异性神经麻痹毒素AalT(Androctonus australis toxin)基因(姚斌等，1995，表达昆虫特异性神经麻痹毒素AalT的杀虫杆状病毒的构建，中国科学《C辑》26<1>78-84)插入该系统，构建成全期高效表达AalT毒素基因的重组杆状病毒(TnNPV-SX35-AalT)，被染棉铃虫(Heliothis armigera)的摄食量减少20％对SDS-PAGE电泳条带进行光密度扫描结果显示，24hpi外源蛋白的表达量占细胞中可溶性蛋白的7.37％，96hpi则高达20％，比对照(不含全期启动子盒的TnNPV-AalT)分别提高1.5与1.1倍。因此，全期启动子盒对提高外源基因的表达水平，特别是提高早期表达水平的作用是显而易见的，从而为利用昆虫专性毒素基因来改善杆状病毒杀虫剂的效能提供了一条切实可行的途径。
本发明的含全期启动子盒及HBsAg基因的转移载体质粒pSX35-HBs已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，珞珈山，武汉大学校内)，保藏编号CCTCC M97025，保藏日97年10月27日。
由该质粒pSX35-HBs经ScaI+PstI双酶切，可得到约450bp的片段，即为本发明的全期启动子盒；由pSX35-HBs经PstI+SalI双酶切(去掉HBsAg基因片段)，可得到约6.0kb的片段，即为本发明的含有全期启动子盒的转移载体质粒pSX35。由质粒pSX35-HBs经EcoRI+PstI双酶切，可得到约120bp的片段，即为本发明的TnNPV p35启动子序列片段。
本发明的载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989.Molecularcloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA)方法，按CaCl2法在E.coli DH5α或E.coli Jm101菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养转化细菌，碱法提取质粒。
以下通过实施例和附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明的全期启动子盒的DNA序列。
图2是p35启动子的PCR产物示意图。其中M为λDNA/EcoRI+HindIII，1、2为阴性对照，3为以野生型TnNPV为模板所得PCR产物，4、5、6为以pSX35为模板所得PCR产物。
图3是Pp35与转移载体pSXIVVI+X3的连接示意图。其上部分示pSXIVVI+X3的多克隆位点及其上游的启动子区域，包括多角体基因启动子(Ppolh)、人工合成启动子(Psyn)和XIV启动子(PXIV)下部分(粗线框部分)示Pp35与pSXIVVI+X3连接处的核苷酸序列。
图4是转移载体质粒pSX35的结构及其构建过程示意图。
图5是将pSX35修饰成为pSX35A的过程示意图。
图6是转移载体质粒pSX35-HBs的结构及其构建过程示意图。
图7是转移载体质粒pSX35-HBs的EcoRV酶切鉴定图谱。其中M为λDNA/EcoRI+HindIII，A为pSX35-HBs/EcoRV，B为pSXIVVI+X3/EcoRV。
图8是pSX35-HBs的酶切鉴定图谱，其中M为λDNA/EcoRI+HindIII，1为pSX35-HBs/EcoRI+PstI，2为TnNPV Pp35的PCR产物。
图9是p35启动子和HBsAg基因的部分序列的双脱氧测序胶放射自显影图谱。其中(A)为Pp35，(B)和(C)为HBsAg基因。
图10是AcNPV p35启动子的核苷酸序列。
图11是Sf细胞的光镜照片。其中A为正常细胞，B为感染了重组病毒TnNPV的细胞。
图12是重组毒株的EcoRI酶切图谱。其中M为λDNA/EcoRI+HindIII，A为TnNPV-SX35-HBs，B为TnNPV-HBs，C为野生型TnNPV。
实施例一 含全期启动子盒的载体pSX35的构建1.p35启动子序列的PCR(primer chain reaction)扩增粉纹夜蛾核型多角体病毒(Trichoplusia ni nuclear polyhedrosis vins，TnNPV)与AcNPV的同源性几乎高达100％(施先宗，1996，粉纹夜蛾核型多角体病毒p35基因功能的研究，中山大学博士学位论文)。因此我们利用PCR方法，以TnNPV DNA为模板扩增p35启动子(Pp35)序列。由于Pp35两端没有合适酶切位点，根据计算机软件对Genbank所贮存的AcNPV p35启动子5′及3′端序列(Ayres，IIoward，Kuzio，et al.1994)进行分析，设计并合成一对引物上游引物5′-CCTgaattcTCTGGCAGCGCGATAG-3，下游引物5′-GGTctgcagTTTGCTATGGTAAAGC TC-3′。为方便克隆，分别在上下游引物中加入EcoRI、PstI酶切识别序列(小写字母表示)。PCR反应体系构成如下PCR Reaction Buffer(10×) 10μldNTP(2mmol/L) 4×25μlPrimer(1，2) 2×5μlTemplate(TnNPV)DNA1μl(～10ng)Taq Polymerase1μl(3U)ddH2O 68μltotal volume 100μl除Taq酶外，依次加入上述试剂，混匀后置95℃ 5分钟，移至冰浴2分钟后加Taq酶，短时高速离心，加入20μl矿物油后在Perkin Elmer Cetus公司的PCR循环仪上进行扩增，设置条件为94℃ 25sec，62℃ 35sec，30个循环。采用热启动法，即待循环仪温度升至90℃再将反应管置于循环仪上。循环结束后，取1/10反应液进行琼脂糖凝胶(2％)电泳，紫外灯下观察反应结果。设一个阴性对照，除不加模板DNA外，其余相同。电泳时阴性对照应无相应带出现。
以野生型TnNPV DNA (施先宗，1996，粉纹夜蛾核型多角体病毒p35基因功能的研究，中山大学博士学位论文)为模板，用合成的引物进行PCR，得到一条特异性扩增带(图2)，其大小与预计的相符合，说明p35启动子序列已得到扩增。2.含全期启动子盒的转移载体pSX35的构建首先，含Pp35的PCR产物经EcoRI和PstI酶切后，插入到转移载体质粒pSXIVVI+X3(王珣章等，1991)的EcoRI和PstI酶切窗口(如图3所示)，遂构建成含由p35启动子与Psyn、PXTV串联构成的全期启动子盒的转移载体pSX35。质粒构建过程详见图4。
实施例二 修饰pSX35成为pSX35A对上述所构建的pSX35作进一步修饰先封闭Pp35 5’端EcoRI位点，然后再在Pp35的下游恢复EcoRI和XhoI位点，使之与出发质粒pSXIVVI+X3的多克隆位点一致，修饰后的转移载体为pSX35A。修饰过程详见图5。
实施例三 含全期启动子盒及NBsAg基因的转移载体pSX35-HBs的构建1.pSX35-HBs的构建用BamHI酶从pUC8/HBV质粒(龙綮新等，1991，乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫体系中的表达，生物工程学报737-46)切下HBsAg基因片段，并分别插入pSX35和pSXIVVI+X3质粒的BglII位点，得到pSX35-HBs和pSXIVVI+X3-HBs。二者均含合成启动子(Psyn)和多角体XIV启动子(PXTV)，前者则由于多一个Pp35而构成全期启动子盒。质粒构建过程详见图6。2.pSX35-HBs的酶切鉴定由于BamHI和BglII属同裂酶，二者的粘性未端互补连接后，则原来位点的酶切识别序列被改变，故BamIII及BglII均不能将重组质粒pSX35-IIBs线性化。而合成启动子和XIV启动子交界处以及HBsAg基因近3′端各含1个EcoRV切点，所以EcoRV酶切后，得到一个约1kb的片段(图7)，表明质粒pSX35-HBs含有正确方向的HBsAg基因。
pSX35-HBs质粒经EcoRI+PstI酶切后得到两个片段，大片段为7.2kb，与线性pSXIVVI+X3-HBs大小一致。小片段为120bp，与PCR扩增片段大小相同(图7，8)，说明p35启动子片段已插入载体质粒pS.X35-HBs中。3.pSX35-HBs的序列测定按Promega公司fmol测序盒中测序步骤，用Pp35上、下游引物对pSX35-HBs质粒中p35启动子的5′、3′端的测序结果详见图9，用DNASIS软件对所测序列与Genbank中AcNPV p35启动子(Ayres，et al.1994.The complete DNA sequence ofAutographa californica nuclear polyhedrosis virus.Virol.202586-605)及HBsAg(龙綮新等，1991，乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫体系中的表达，生物工程学报737-46)基因序列进行比较，结果表明所得重组质粒pSX35-HBs及pSXIVVI+X3-HBs无误。
TnNPV与AcNPV的同源性几乎高达100％。DNA测序结果表明，以TnNPV DNA为模板扩增的p35启动子序列，除了-59位处的C碱基缺失外，其余碱基与AcNPV的完全相同。而缺失的C碱基(图9中的小写字母c)既非位于GC基序、亦非位于CGT基序之中，对启动子活性当无实质性影响，而且由于没有参照，不能确定是否属于扩增反应的错误。
实施例四 pSX35-HBs的应用1.含全期启动子盒的TnNPV重组病毒的组建与鉴定经PEG沉淀法纯化的转移载体pSX35-HBs及pSXIVVI+X3-HBs DNA分别与无多角体的含β-半乳糖苷酶基因的重组病毒TnNPV-SVIG(王珣章等，1991)DNA共转染Sf细胞，5天后观察到有形成多角体的重组病毒斑出现(图11)。经空斑技术挑选形成多角体的白色病毒斑并空斑纯化5次后，得含全期启动子盒(p35启动子+人工合成启动子+XIV启动子)和乙肝表面抗原(HBsAg)基因的重组粉纹夜蛾TnNPV-SX35-HBs，及不含p35启动子的TnNPV-HBs。用含X-Gal的半固体培养基作空斑测定，证实无蓝斑形成，即不混有亲本毒株，表明重组毒株已经挑纯。
考虑到在发生细胞内同源重组的过程中，有可能出现外源基因重组错位或丢失，因此有必要对重组毒株TnNPV-SX35-HBs及TnNPV-HBs DNA进行鉴定，以确认外源DNA是否已整合到病毒基因组中正确位点。图12所示为重组毒株TnNPV-SX35-HBs、TnNPV-Hbs及野生毒株AcNPV DNA的EcoRI酶切电泳图谱。野生型多角体基因位于酶切图谱的EcoRI-I片段，通过转移载体pSX35-HBs与亲本毒株的重组，在将外源基因及启动子区域(约1.6Kb)反方向插入多角体基因5′端(使原EcoRI-I片段由7.33Kb变成8.93Kb)的同时，还将载体质粒上的EcoRI酶切位点引入至原EcoRI-I片段，故经EcoRI酶切的重组毒株中的EcoRI-I片段消失，而代之以3.5Kb和5.4Kb的两个小片段，后者与EcoRI-K片段(5.4Kb)重合在一起。证实p35启动子、HBsAg基因已正确插入重组毒株基因组中。2.HBsAg基因在Sf细胞中表达产物的鉴定2.1 ELISA检测分别对野生型毒株和重组毒株感染的细胞表达产物作HBaAg抗原性检测，经自动酶标仪OD450检测，野生型病毒感染细胞的表达产物P/N值均＜2.1，呈HBsAg阴性，重组毒株感染细胞的表达产物P/N值均＞11，呈HBsAg阳性。
2.2 HBsAg基因表达的定量测定分别对野生型毒株，重组毒株TnNPV-SX35-HBs与TnNPV-HBs感染的细胞表达产物进行固相放射免疫定量分析，经γ-计数器测得的cpm值扣去本底(野生型毒株的测定值)后换算成HBsAg含量(mIU/ml)，结果显示(详见表1)含p35启动于的重组毒株(TnNPV-SX35-HBs)表达HBsAg的时间提前，而且产量大幅度提高。病毒感染细胞后4小时(4 hours postinfection，4hpi)即能检测到HBsAg基因的表达，24hpi的表达量达159.5mIU/ml比对照(TnNPV-HBs)的24hpi表达量提高了1.8倍；96hpi的峰值为199.8mIU/ml，比对照提高了0.6倍。
表1 重组毒株感染的Sf细胞中HBsAg的定量测定(mIU/ml)感染后小时 TnNPV-SX35-HBs(A) TnNPV-HBs(B) A/B0 0 0--4 36 0--8 49 0--12 61.522.5 2.724 159.5 56.5 2.848 174 112 1.672 187 120.5 1.696 199.8 128.5 1.6120 181 92.1 1.9
权利要求
1.杆状病毒全期启动子盒，由杆状病毒的p35启动子与人工合成后期启动子(Psyn)、多角体XIV启动子(PXIV)串联构成，其DNA序列如下
GGGCCAAGCT TGGCGTTATT GAATAAGAAT TTAAAAATCA ATCATTTGTA
TACTGTAAAT TACATACTGT TTTATTTAAC AATAGATATC ATGGAGATAATTAAAATGCC AAGCTTGGCG CAAATAAATA AGTATTTTAC TGTTTTCGTA ACAGTTTTGT
AATAAAAAAA CCTATAAATA GATCATCGA ATTCTCTGGC AGCGCGATAG TGGTCGCGAAAATTACACGC GCGTCGTAAC GTGAACGTTT ATATTATAAA TATTCAACGTTGCTTGTATT AAGTGAGCAT TTGAGCTTTA CCATAGCAAA(……多克隆位点)
2.一种杆状病毒载体系统，其特征是该载体包含有权利要求1所述的全期启动子盒。
3.按照权利要求2所述的载体系统，其特征是该载体为质粒pSX35。
4.按照权利要求3所述的载体系统，其特征是作为载体的pSX35质粒经过修饰，成为pSX35A，其Pp35下游的多克隆位点与出发质粒pSXIVVI+X3相一致。
5.按照权利要求3所述的载体系统，其特征是在质粒pSX35的BglII位点插入了HBsAg基因片段，成为pSX35-HBs。
全文摘要
本发明将杆状病毒的p35启动子与人工合成后期启动子(Psyn)、多角体XIV启动子(P
文档编号C12N15/63GK1188805SQ9711431
公开日1998年7月29日 申请日期1997年11月24日 优先权日1997年11月24日
发明者王珣章, 龙綮新, 吴文言, 曲士芮, 庞义 申请人:中山大学