专利名称：癌胚抗原基因启动子dna的克隆方法、序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人癌胚抗原(CEA)基因启动子DNA的克隆方法，及该CEA特异启动子DNA的核苷酸排列顺序、用途。属于医学基因工程技术领域。
使用自杀基因(HSV-TK基因)、抗癌基因、细胞凋亡基因治疗肿瘤是当前肿瘤治疗研究的新进展，虽然在临床上已取得一定的疗效(CulverRW et al:Gene therapy for the treament of malignantbrain tumors with in vivo tumor transduction with the herpessiwplexthymidine kinase gene/gancidovir system.Hunan Genefherapy 1994；5:3431)，但单纯上述基因的应用，缺乏肿瘤的特异性，限制了基因治疗在临床上的应用范围及治疗效果。
癌胚抗原(CEA)是人胚胎时期的一种血清蛋白，主要是由胚胎大肠上皮细胞分泌产生的。在成熟期大肠上皮细胞已经失去了分泌癌胚抗原蛋白的功能，但在部分大肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤患者，癌胚抗原蛋白发生异常表达(Boring C S,et al:Cancer stati-stics.CA-Cancer Journal-for Clinians,42:19-38,1992)。自1965年发现CEA以来(Gold P and Fredman S O:Specific carcino-embryonic antigen of the human digestive systen,J Exp Ked,122:467,1965),CEA已成为世界上研究最为广泛的肿瘤相关抗原，它不仅常规用于临床CEA分泌性肿瘤的诊断、鉴别诊断与疗效和预后的评价，最近资料还显示CEA是人类肿瘤特异性主动免疫治疗中最有希望的靶抗原。目前已经确定癌胚抗原基因的表达受到其上游的启动子的调控，相信在CEA分泌性肿瘤中，与CEA表达有关的一些因子的异常表达重新激活了CEA基因的启动子，故有CEA的异常表达。为开展CEA分泌性肿瘤特异基因治疗，国外从结肠癌细胞克隆出CEA基因启动子DMA，将其与治疗基因连接，使治疗基因特异性地只在肿瘤细胞中定位表达，达到选择性杀伤肿瘤细胞，而正常细胞不受影响的治疗效果。如CEA启动子基因与HSV-TK基因连接，使TK基因只在CEA分泌性肺癌(腺癌)细胞中表达，在非CEA分泌性细胞不表达，使肺癌细胞对药物GCV的敏感性提高了1000倍(Oski T et al:Gene therapy for carcinoembr-yoincantigen-producing human lungcacer cells by cell type-specificexpression of herpes siwplex virus thymidine kinasegene.CancerRes.54,5258,1994)，为肿瘤基因治疗带来新的前景。
本发明的目的是提供一种人胃癌CEA基因启动子DNA克隆方法、胃癌CEA特异启动子DNA的核苷酸排列顺序。其特点是该DNA序列具有癌胚抗原基因启动子活性必须序列，同时与结肠癌CEA基因启动子不同，在+93位是C而不是G碱基(Schreme H et al.Nol Cell Biol,1990；10:2738；Richards CA et al.Hum Gene Ther 1995；6:881-93)；该DNA克隆作为一种大肠杆菌质粒，可在大肠杆菌大量扩增，经简单纯化，使用特意设计并连接在该基因克隆DNA两端的不同酶切位点酶切，即可将其切下，并可定向插入新的基因治疗用载体。在该段DNA调控下，外源基因只能在表达CEA的肿瘤细胞才发生表达，为CEA分泌性胃癌等肿瘤的特异性基因治疗提供一个新的基因元件。
本发明的人胃癌癌胚抗原基因启动子DNA克隆载体pCEAp(寄存于大肠杆菌JN109株，含该质粒的菌种命名为Eschertchia coli JN109/pCEAp，已于1997年9月11日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册号为CCNCC No:0324)见
图1，由以下DNA元件组成1、CEA分泌性肿瘤细胞表达的特异启动子--癌胚抗原基因上游调控序列；
2、大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰氨酶基因)--质粒pGEM-3zf(+)。
本发明用于构建人胃癌癌胚抗原基因启动子DNA克隆的主要细胞株和原始质粒是pGEN-3zf(+)源自华美公司。
人胃癌细胞株GN803细胞，源自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。
前述人胃癌癌胚抗原基因启动子DNA克隆方法如下1．首先设计引物。
利用Priwer软件在计算机中设计出一对合适的引物，为了便于克隆，分别在引物Ⅰ的5′端引入了SacⅠ酶切位点序列(GAGCTC)，在引物Ⅱ的5′端引入了HindⅢ酶切位点序列(AAGCTT)，引物Ⅰ:5′-AATTGAGCTCTCCATCCACCTTGCCGAA引物Ⅱ:5′-GCTCAAGCTTACTCCATGGTCTCTGCTG引物由Sangon上海生物工程公司合成。
2、从人胃癌细胞株GN803常规分离制备DNA模板。
3、PCR扩增以抽提的803细胞DNA为模板，用我们设计合成的引物做PCR扩增，获得单一CEA启动子DNA片段见图2(3)。
4、CEA启动子克隆以pGEN-3zf(+)为克隆载体，将载体用SacⅠHindⅢ双酶切后，电泳回收酶切片断。PCR扩增获得的启动子DNA片段经同样双酶切后，用乙醇沉淀；按DNA片段∶载体=3∶1的比例，在T4连接酶作用下于14℃过夜连接，转染菌JN109宿主菌并铺板；用氨苄青霉素及蓝、白菌落双重筛选，获得纯化的CEA启动子DNA质粒克隆。
5、CEA启动子DNA测序分析由上述克隆方法得到的基因启动子DNA，其序列如下↓-156AAGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG GAAAAAAGAG-116GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA-76GGACACCTGA ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG-36CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC TCAGGGCAGA+5GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG+45ACAAAACGTT CCTGGAACTC AAGCTCTTCT CCACAGAGGA+85GGACAGACCA GACAGCAGAG ACCATGGAGT+115↑+93(箭头后的数字表示箭头所指的碱基在癌胚抗原基因启动子DNA中所处的序列编号，无箭头的数字表示其左侧碱基的序列编号。)本发明的基因启动子DNA的主要用途如下可定向插入新的基因治疗用载体(如病毒或质粒载体)，在该段DNA调控下，外源性治疗基因(如TK等肿瘤自杀基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子、反义核苷酸等)只在表达CEA的肿瘤细胞才发生表达，可用于CEA分泌性肿瘤，特别是胃癌的基因治疗。
本发明提供的pCEAp质粒，寄存在大肠杆菌JN109，含pCEAp质粒的菌株命名为大肠杆菌JM109/pCEAp(Eschertchia coli JN109/pCEApl。该菌种可在含50-100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中(1％ tryptone.0.5％ yeast extract,1％ NaCl)培养扩增。
下面实施例对本发明的人胃癌细胞癌胚抗原基因启动子DAN克隆pCEAp的制备、鉴定和特点做了详细地说明，但不意味着限制本发明的内容。在这些实例中，人胃癌细胞株购自中国科学院生物研究所细胞库。质粒pGEN-3zf(+)购自华美公司。
图1是质粒pCEAp的构建示意图。
图2是酶切电泳图。
图3是测序荧光图普。
实施例1胃癌CEA基因启动子DNA片段的扩增与制备。
利用Primer软件在计算机中设计出一对合适的引物，为了便于克隆，在两条引物5’端分别加入SacⅠ酶切位点，HindⅢ酶切位点。
引物Ⅰ:5′-AATTGAGCTCTCCATCCACCTTGCCGAA引物Ⅱ:5′-GCTCAAGCTTACTCCATGGTCTCTGCTG人胃癌细胞株GN803细胞经含10％小牛血清的1640培养基，在37℃,5％CO2培养箱内培养，按Stafford改良方法(Blin W and O.W.Stafford:Nacleic Acid Res 1996；3:2303)从连续培养生长良好的803细胞(约1.3×107)中分离制备DNA模板，经Hpal酶切，用以上设计合成的引物，采用热启动的PCR扩增法(Sally WE et al.Wature.1989:341:544.及O′Aquila K T et al Nucleic acid Res.1992:20；1717)，按以下条件进行30个循环；94.5℃ 1分钟→60℃ 1分钟→72℃ 2分钟，末次循环72℃延伸5分钟，即得到CEA基因启动子DNA扩增片段。取少许作凝胶电泳，呈现317bp的一个单一条带(图2(3))。
实施例2胃癌CEA基因启动子DNA克隆测序分析。
PCR扩增产物的测序启动子DNA片段纯化后作为模板，按Sanger测序法(Sanger F et al:Proc Natl Acad Sci 1977,74:5463)加入荧光素标记的ddWTP，在引物Ⅰ的引导下进行PCR扩增，取扩增产物加入自动测序仪中测序。在自动读序仪中可检测到A、T、C、G四种色彩不同的荧光素波型，整个图型清晰，易于读取，一次读出除引物外的270个碱基，与国外已报导的从结肠癌细胞克隆出的CEA基因启动子同段(CEA基因启动子-156到+115的序列)序列(Schrewe H et al.Cloningof the complet gene conveying cell typesp specific expression.NolCell Biol,1990；10:2738.及Richards CA et al.Tranwscrip-tionl regulatory seqwences of carcinoeabryonic antigen:Iden-tification and use with cytosine deauinase for tunor-specificgene therapy Hum Gene Ther 1995；6:881)相比，在+93位国外序列为G，本序列为C，同源性为99.63％，其测序荧光图谱见图3，该启动子DNA测序结果如下↓-156AAGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG GAAAAAAGAG-116GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA-76GGACACCTGA ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG-36CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC TCAGGGCAGA+5GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG+45ACAAAACGTT CCTGGAACTC AACCTCTTCT CCACAGAGGA+85GGACAGACCA GACAGCAGAG ACCATGGAGT+115↑+93(箭头后的数字表示箭头所指的碱基在癌胚抗原基因启动子DNA中所处的序列编号，无箭头的数字表示其左侧碱基的序列编号。)实施例3,CEA基因启动子DNA质粒克隆的构建。
以pGEN→3zf(+)为克隆载体，将载体用Sacl,HindⅢ双酶切后，电泳回收酶切片断。PCR扩增获得的启动子DNA片段(见实施例1)经同样双酶切后，用乙醇沉淀。按DNA片段∶载体=3∶1的比例，在T4连接酶作用下于14℃过夜连接，转染JN109宿主菌并铺于含氨苄青霉素和X-Gal LB琼脂糖平板培养过夜，次日挑取白色菌落。用含氨苄青霉素的LB培养基(1％ tryptone,0.5％ yeast extract,1％NaCl),37℃培养扩增，抽提质粒，用SacⅠ,HindⅢ酶双切，切出一近300bp(含部分引物)片段(图2(2))，而对照空载体双酶切后未见此300bp片段(图2(4)！。证实克隆成功(图1)。与现有技术相比较本发明有以下优点和特点1、该克隆具有CEA基因启动子活性必须序列区(-90到+60)，和国外从结肠癌细胞分离的CEA基因启动子(Schrene H et al,Wol CellBiol,1990；10:2738；Richards Ca et al. Hum Gene Ther 1995；6；881-93)相比，在+93位国外序列为G，本序列为C。
2、自行设计的PCR引物具有CEA启动子DNA高度保守和特异的序列，又分别含有SacⅠ,HindⅢ酶切位点序列，便干CEA启动子DNA的扩增、测序与克隆；并且无非特异条带的扩增。
3、该DNA克隆作为一种大肠杆菌质粒，可在大肠杆菌大量扩增、经简单纯化，使用特意设计并连接在该基因克隆DNA两端的不同酶切位点酶切，即可将其切下，并可定向插入新的基因治疗用载体，在该DNA调控下，外源基因只在表达CEA的肿瘤细胞才发生表达。从而达到特异性杀伤CEA分泌性肿瘤的效果。
权利要求
1．一种含人胃癌癌胚抗原基因启动子DNA的克隆载体，其特征在于由下列DNA元件组成(1)、癌胚抗原(CEA)分泌性肿瘤细胞表达的特异启动子--癌胚抗原基因上游调控序列；(2)、大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰氨酶基因)。
2．如权利要求1所述的DNA的克隆方法，其特征在于创建了一对适当的PCR引物，引物Ⅰ:5′-AATTGAGCTCTCCATCCACCTTGCCGAA,引物Ⅱ:5′-GCTCAAGCTTACTCCATGGTCTCTGCTG)，该对引物不仅具有癌胚抗原启动子DNA高度保守而特异的序列，而且分别含有Sacl,HindⅢ酶切位点序列。
3．如权利要求2方法克隆的基因启动子DNA的序列，其特征是具有癌胚抗原基因启动子活性必须序列区(-90到+60)，但与现有技术从结肠癌细胞分离的CEA基因启动子相比，在+93位不是G，而是C:↓-156AAGATTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG GAAAAAAGAG -116GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA -76GGACACCTGA ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG -36CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC TCAGGGCAGA +5GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG +45ACAAAACGTT CCTGGAACTC AAGCTCTTCT CCACAGAGGA +85GGACAGACCA GACAGCAGAG ACCATGGAGT +115↑+93(箭头后的数字表示箭头所指的碱基在癌胚抗原基因启动子DNA中所处的序列编号，无箭头的数字表示其左侧碱基的序列编号。)
4．根据权利要求2方法克隆的具有权利要求3序列的基因启动子的用途，其特征在于作为一种大肠杆菌质粒，可在大肠杆菌大量扩增，经简单纯化，使用特别设计并已连接于在该基因克隆DNA两端的不同酶切位点酶切，即可将其切下，并可定向插入新的基因治疗用载体(如病毒或质粒载体等)，在该段DNA调控下，外源性治疗基因(如TK等肿瘤自杀基因，抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子、反义核苷酸等1只在表达CEA的肿瘤细胞才发生表达，从而可用于CEA分泌性肿瘤，如胃癌、大肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的基因治疗、与预防复发等目的。
全文摘要
本发明涉及人癌胚抗原(CEA)基因启动子DNA的克隆方法、序列及其用途,其特点是:该DNA序列与结肠癌CEA基因启动子不同,在+93位是C而不是G碱基。在CEA分泌性肿瘤基因治疗中,将该基因片段与治疗基因重组,可望取得选择性杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞不受影响的效果。
文档编号C12N15/12GK1216321SQ97114280
公开日1999年5月12日 申请日期1997年10月31日 优先权日1997年10月31日
发明者王晓怀, 谢波, 江悦华 申请人:广州军区广州总医院医务部科训科