双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列及其克隆方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕热休克蛋白70（HSP70）基因序列及其克隆方法。双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列为SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本发明首次从双齿围沙蚕中克隆到一种热休克蛋白70基因，该序列cDNA全长2161bp，其中开放阅读框位于49-2019位核苷酸，编码656个氨基酸残基。双齿围沙蚕热休克蛋白70基因的成功克隆和测序，为进一步分析HSP70影响下生物抗逆能力，为HSP70其它功能的筛选及应用奠定了基础；也为利用HSP70基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
【专利说明】双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列及其克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕热休克蛋白70 (HSP70)基因序列及其克隆方法。
【背景技术】
[0002]热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是指细胞在应激原特别是环境高温诱导下所产生的一组蛋白质。HSP首先是在果蝇体内发现的。1962年，发现将果蝇的培养湿度从25°C提高到30°C (热休克环境温度升高)，30分钟后就可在多丝染色体上看到蓬松现象(或称膨突puff)，提示这些区带基因的转录加强并可能有某些蛋白质的合成增加。1974年，人们从热休克果蝇幼虫的唾液腺等部位分离到了 6种新的蛋白质，即热休克蛋白。除环境高温以外，其他应激原如缺氧、寒冷、感染、饥饿、创伤、中毒等也能诱导细胞生成热休克蛋白。因此，热休克蛋白(HSP)又称应激蛋白(stress protein，SP)，但习惯上仍称为HSP。近年研究表明:热休克蛋白的生成，不仅见于果蝇，而且普遍存在于从细菌至人类的整个生物界(包括植物和动物)。绝大部分生物细胞生成的HSP分子量都在80~110kD、68~74kD和18~30kD之间。作为一个具有多成员的庞大糖蛋白超基因家族，根据其同源程度及相对分子质量大小可分为 HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小 HSP (HSP25、HSP27、HSP28)五大家族。此外，还有一部分HSP是以相关糖蛋白来分类的，如糖相关蛋白94和糖相关蛋白7。不同分子量的热休克蛋白，在细胞内的分布也有所不同，例如，在酵母菌中发现的分子量为89kD的HSP分布于细胞浆中，而分子量为68kD、70kD、110kD的HSP却主要分布于细胞核或核仁区域。
[0003]热休克蛋白70是最为保守和重要的一个热休克蛋白家族，具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能、参与免疫反应、抗细胞凋亡功能、抗氧化功能、提高细胞的应激耐受性、促进细胞增殖、参与细胞骨架的形成和修复等，其广泛的生物学功能使之成为当今生命科学研究的热点，因此，研究这类进化上非常保守的蛋白基因表达调控机制和相关的信号转导是非常重要的。
[0004]双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)属环节动物门多毛纲沙蚕科，作为潮间带地区的常见物种，是各种鱼类、甲壳类和海鸟的重要食饵。由于沙蚕位于水陆生态食物链的底部，能摄食底泥中的沉积物、有机碎屑和微生物等，此外，对重金属和某些工业有机污染物具有一定积累和消化作用，因此被认为是多毛类中耐污染能力较强的底栖生物。多毛类沙蚕可以很好地利用底质中的有机污染物和一些重金属转化为自身的生产力，它们作为海洋食物链中的一个分室既是生产单元，又能够净化底质，使系统内部的废弃物再利用和循环，增加环境生态效益，其体内必然存在某种解毒和防御机制，而在其中HSP家族基因是必不可少的研究对象。因此，研究沙蚕热休克蛋白基因为揭示和利用其解毒防御系统功能具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种双齿围沙蚕热休克蛋白70 (HSP70)基因序列及其克隆方法。
[0006]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0007]—种双齿围沙香热休克蛋白70基因序列,双齿围沙香热休克蛋白70基因序列为SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0008]双齿围沙香热休克蛋白70基因序列编码蛋白，双齿围沙香热休克蛋白70基因序列编码蛋白为SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0009]双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列的克隆方法，首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA ;而后采用下游外侧特异性引物HSP70-0uter-R (5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’)和下游内侧特异性引物 HSP70-1nner-R (5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’)进行 5’-RACE 反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’ -GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’ ；通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0010]本发明具有如下优点:
[0011]1.采用本发明对双齿围沙蚕热休克蛋白70基因的成功克隆和测序，首次确定其全部编码序列和部分非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
[0012]2.双齿围沙蚕热休克蛋白70基因的成功克隆和测序，为进一步分析HSP70影响下生物抗逆能力，为HSP70其它功能的筛选及应用奠定了基础；
[0013]3.利用本发明所得HSP70基因对不同 浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例提供的双齿围沙蚕热休克蛋白70在不同浓度Cu胁迫下的表达效果图。
【具体实施方式】
[0015]本发明通过对双齿围沙蚕差减文库中所获得的表达序列标签(EST)与NCBI上的HSP70的EST序列进行比对分析，利用DNAstar中的SeqMan软件分析所有HSP70的同源性区域设计简并引物；其克隆方法包括:(I)通过分析近源物种热休克蛋白70的EST序列及CDS序列的保守区设计简并引物HSP70-0uter-R、HSP70-1nner-R和反向引物HSP70-F ；(2)从鲜活健康的双齿围沙蚕成体组织中提取总RNA ; (3)利用TaKaRa 5’_Full Race试剂盒及下游外侧特异性引物HSP70-0uter-R和下游内侧特异性引物HSP70_Inner-R进行5’-RACE反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；(4)利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列；另外，该反向引物还可以为序列表中SEQ IDN0.1核苷酸序列片段；(5)通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列 SEQ ID N0.1。
[0016]本发明首次从双齿围沙香中克隆到一种热休克蛋白70基因，该序列cDNA全长2161bp，其中开放阅读框位于49-2019位核苷酸，编码656个氨基酸残基。
[0017]实施例1
[0018]双齿围沙蚕HSP70基因如SEQ ID N0.1所示:
【权利要求】
1.一种双齿围沙香热休克蛋白70基因序列,其特征在于:双齿围沙香热休克蛋白70基因序列为SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—种权利要求1所述的双齿围沙香热休克蛋白70基因序列编码蛋白，其特征在于:双齿围沙香热休克蛋白70基因序列编码蛋白为SEQ ID N0.2中氣基酸序列所不。
3.—种权利要求1所述的双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列的克隆方法，其特征在于:首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA;而后采用下游外侧特异性引物HSP70-0uter-R (5，-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’)和下游内侧特异性引物 HSP70_Inner-R(5，-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’ )进行5’ RACE反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’ -GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’ ；通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID N0. 1。
【文档编号】C12N15/10GK103882025SQ201210563321
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】张倩茹, 魏树和, 张靖宜, 牟文燕, 周启星 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所