一种LKB1mRNA检测方法、试剂盒及基因芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种LKB1mRNA检测方法，包括以下步骤：制备LKB1mRNA原位杂交探针；用量子点标记LKB1mRNA原位杂交探针，得到量子点LKB1mRNA原位杂交探针；用量子点LKB1mRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交；将杂交后的标本置于显微镜下观察。本发明还提供了包含上述量子点LKB1mRNA原位杂交探针的试剂盒及基因芯片。本发明的检测方法使用量子点LKB1mRNA原位杂交探针，量子点比其他荧光染料毒性小，使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；操作简单、灵敏度高。
【专利说明】—种LKBImRNA检测方法、试剂盒及基因芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种LKBlmRNA检测方法、试剂盒及基因芯片。
【背景技术】
[0002]人LKBl (Liver Kinase BI)基因或称 STKll (Serine-Threonine kinasell)基因，定位于人染色体19pl3.3位置，含10个外显子，编码的LKBl蛋白由433个氨基酸组成，分子量约为50kDa，包括激酶区域(44-309)、N端调节域和C端调节域。N端调节域含一个核定位序列，使LKBl蛋白定位于细胞核内。LKBl基因编码一种丝-苏氨酸蛋白激酶，参与多种生物学过程，包括细胞周期阻滞、P53介导的凋亡、细胞极性诱导等，介导TGF-β、G蛋白偶联等信号通路，在细胞生长、分化调控中发挥着重要作用，在人体多种组织中均有表达，以上皮、睾丸生精小管、肝脏、小肠和骨骼肌最多。LKBl基因是肿瘤易患综合症，即PJ综合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)的致病基因,在高达90%的PJS病人中可检测到LKBl基因的胚系突变。LKBl基因的功能异常还与全身多种散发性肿瘤的发生密切相关，如在30-40%的非小细胞肺癌、20%的宫颈癌、19%鳞状细胞癌及13%乳腺侵润性导管癌中均有LKBl基因的失活。另外，LKBl基因在恶性肿瘤发生中起着重要作用，研究证实LKBl能够使细胞周期停滞在Gl期，抑制细胞生长。LKBl基因是一个较为普遍的抑癌基因。LKBl基因表达情况为肿瘤发生和预后影响的一个重要中间指标，对揭示LKBl基因抑制细胞恶性增殖的分子背景有重要的意义，因此，LKBl基因表达情况的检测，即LKBl蛋白水平检测或LKBlmRNA的水平检测是亟待解决的问题。
[0003]目前，现有技术中LKBl基因表达情况的检测主要为LKBl蛋白的检测，一种现有技术利用兔源多克隆抗体作为一抗，然后用标记了化学显色试剂或者荧光基团的二抗对一抗进行标记，一抗与LKBl蛋白结合后再用化学显色试剂的颜色或者荧光基团的荧光信号来判断LKBl蛋白的丰度。这种间接的检测方法步骤繁琐耗时长，并且由于多克隆抗体的特异性不强导致非特异性信号的产生，对检测结果的准确性有很大影响。还有一种现有技术是利用DAB显色的原理，对LKBl鼠源单克隆抗体进行显色标记，然后LKBl抗原免疫组化染色，再用光学显微镜观察，出现棕黄色或棕褐色的为阳性，综合考虑阳性细胞着色深浅和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。这种方法中使用的DAB染色剂有毒性，为疑似致癌物质，不安全，另外，显色剂显色反应受温度影响大，且显色时间受到限制，不能长期保存，实验人员无法将组织切片保存进行重复观察。LKBlmRNA水平检测方法还未见报道。
[0004]量子点具有宽的激发光谱和窄的发射光谱(光谱宽在20_40nm之间)，通过改变量子点的尺寸或者改变量子点内核的组分可以在很大范围内调节量子点的发射光谱。量子点与有机荧光团相比有几个突出的光学特点:窄的发射光谱能减少光谱重叠，能同时区别多个荧光团；宽的激发光谱能在单一波长下激发多种颜色的光谱。此外量子点具有光稳定性和抗降解性，对细胞的毒性小。这些独特的性质使量子点能在体内跟踪多个细胞和制备体外多个分子生物传感器，由于量子点具有可调谐的发光波长，量子点能促进组织深层的细胞成像。
【发明内容】
[0005]本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种LKBlmRNA检测方法，包括以下步骤:
[0006]制备LKBlmRNA原位杂交探针；
[0007]用量子点标记LKBlmRNA原位杂交探针，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针；
[0008]用量子点LKBl mRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交；
[0009]将杂交后的标本置于显微镜下观察，
[0010]其中，所述的LKBlmrNA原位杂交探针为一段与LKBlmRNA特异性结合的单链DNA或单链RNA ;所述的标本为细胞标本或组织标本,所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。
[0011]优选地,所述的用量子点标记LKBlmRNA原位杂交探针包括以下步骤:
[0012]将量子点表面用COOH和OH进行修饰，得到0H/C00H-量子点；
[0013]将LKBlmRNA原位杂交探针用氨基修饰，得到氨基-LKBlmRNA原位杂交探针；
[0014]0H/C00H-量子点与氨基-LKBlmRNA原 位杂交探针反应，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
[0015]优选地，所述的将量子点表面用COOH和OH进行修饰的步骤为:
[0016]在DHLA与巯基乙醇的混合液中加入量子点进行反应，得到第一反应液；
[0017]在第一反应液中加入氯仿，再离心，收集沉淀；
[0018]将所得沉淀用水溶解，得到第二液体；
[0019]将第二液体过滤，得到0H/C00H-量子点。
[0020]优选地，所述的0H/C00H-量子点与氨基-LKBlmRNA原位杂交探针反应步骤为:
[0021]将EDC与sulfo-NHS溶于磷酸缓冲液，再加入0H/C00H-量子点，反应，得到第三反应液；
[0022]在第三反应液中加入氨基-LKBlmRNA原位杂交探针，反应，得到第四反应液；
[0023]将第四反应液进行层析，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
[0024]优选地，所述的LKBlmRNA原位杂交探针为LKBl基因cDNA、LKBl基因cRNA或靶向LKBlmRNA的特异性寡核苷酸序列。
[0025]本发明还提供了一种LKBlmRNA检测试剂盒，包括量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
[0026]优选地，所述的试剂盒还包括缓冲液、打孔液、消化液、洗涤液和预杂交工作液。
[0027]优选地，所述的洗涤液包括第一洗涤液、第二洗涤液和第三洗涤液。
[0028]优选地，所述的试剂盒还包括甘油。
[0029]本发明另提供了一种LKBlmrNA检测基因芯片，通过将量子点LKBlmRNA原位杂交探针固定在固相载体表面形成。
[0030]优选地，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒或塑料片。
[0031]本发明的LKBlmRNA检测方法利用量子点对靶向LKBlmRNA的特异性单链DNA或RNA进行修饰，形成量子点LKBlmRNA原位杂交探针，利用量子点LKBlmRNA原位杂交探针与LKBlmRNA结合，将量子点标记到LKBlmRNA上，利用量子点发出的荧光对LKBlmRNA进行定位、定性及定量研究。细胞样品或组织样本被制成标本后，加入量子点LKBlmRNA原位杂交探针进行原位杂交，将杂交后的标本置于荧光显微镜下观察。LKBlmRNA与量子点LKBlmRNA原位杂交探针特异性的结合后，LKBlmRNA发出荧光，能够发出荧光的细胞为阳性细胞，不能发出荧光的为阴性细胞，还可通过综合考虑阳性细胞荧光强度和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。
[0032]本发明的有益效果在于，本发明的检测方法使用量子点LKBlmRNA原位杂交探针，量子点比其他荧光染料毒性小，使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；本发明的检测方法的有益效果还在于操作简单、灵敏度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1是荧光显微镜下正常乳腺细胞涂片荧光原位杂交结果图。
[0034]图2是荧光显微镜下正常胃细胞涂片荧光原位杂交结果图。
【具体实施方式】
[0035]为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0036]本发明的LKBl蛋白检测方法采用以下技术方案实现:
[0037]制备LKBlmRNA原位杂交探针；
[0038]用量子点标记LKBlmRNA原位杂交探针，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针；
[0039]用量子点LKBlmRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交；
[0040]将反应后的标本置于显微镜下观察，
[0041]其中，所述的LKBlmRNA原位杂交探针为一段与LKBlmRNA特异性结合的单链DNA或单链RNA序列；所述的标本为细胞标本或组织标本,所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。
[0042]LKBlmRNA原位杂交探针可选用LKBl基因cDNA、LKBl基因cRNA或靶向LKBlmRNA的特异性寡核苷酸序列。
[0043]量子点可选用CdSe、CdTe, CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdSe/CdZnS、CdSe:Mn2+、CdTe:Mn2+、CdSe:Zn2+或 CdTe:Zn2+，不限于以上。本实施例中使用的量子点是CdSe/ZnS。
[0044]本实施例中，量子点LKBlmRNA原位杂交探针的制备包括以下步骤:
[0045]将量子点表面用COOH和OH进行修饰，得到0H/C00H-量子点；
[0046]将LKBlmRNA原位杂交探针用氨基修饰，得到氨基-LKBlmRNA原位杂交探针；
[0047]0H/C00H-量子点与氨基-LKBlmRNA原位杂交探针反应，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
[0048]优选地，所述的将量子点表面用COOH和OH进行修饰的步骤为:
[0049]DHLA (Dihydrolipoic Acid, 二氢硫辛酸)分子一端为巯基,另一端为羧基(C00H);疏基乙醇分子的一端为疏基，另一端为羟基(OH), DHLA与疏基乙醇的疏基与量子点通过金硫键结合，形成表面被COOH和OH共同包被的0H/C00H-量子点。
[0050]0H/C00H-量子点与氨基-LKBlmRNA原位杂交探针通过氨基与COOH交联以及氨基与OH交联结合，形成量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
[0051]氨基的交联是按以下方式实现的，EDC (l-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide, 1- (3- 二甲氨基丙基)-3_ 乙基碳二亚胺)、sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide, N-羟基玻拍酸亚胺)与 0H/C00H-量子点混合，0H/C00H-量子点与sulfo-NHS在EDC催化下形成活性中间体0H/C00H-量子点-NHS，再加入氨基-LKBlmRNA原位杂交探针，氨基-LKBlmRNA原位杂交探针的氨基末端与0H/C00H-量子点的C00H和OH连接反应，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
[0052]另外,量子点LKBlmRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交包括以下步骤:
[0053]缓冲液处理标本，使组织细胞恢复水性；
[0054]用孔液中处理标本，改变组织细胞的通透性，用洗涤液洗涤；
[0055]消化液处理标本，用第一洗涤液和第二洗涤液冲洗；
[0056]预杂交处理:预杂交工作液处理标本，盖上原位杂交专用盖玻片，防止预杂交液干掉；
[0057]预杂交处理后用第二洗涤液冲洗；
[0058]量子点LKBlmRNA原位杂交探针杂交工作液混合，量子点LKBlmRNA原位杂交探针变形处理，得到混合液；
[0059]将上述所得混合液处理标本，用第二洗涤液和第三洗涤液冲洗；
[0060]将标本用甘油封片于荧光显微镜下观察杂交结果。
[0061]其中，所述的缓冲液优选为枸橼酸缓冲液；所述的第一洗涤液优选为PBS溶液；所述的第二洗涤液优选为SSC溶液；所述的第三洗涤液优选为TBS溶液；所述的预杂交工作液的配方优选为:4 X SSC, 50% 甲酰胺，IOOng/μ I BSA, I XDehardt solution, 0.3%TritonX-100, 0.5
[0062]mMribonuc leosidevanady I comp I exes andlng/ml 鲑鱼精 DNA。
[0063]本发明还提供了 LKBlmRNA检测试剂盒，包括量子点LKBlmRNA原位杂交探针，还包括缓冲液、打孔液、消化液、洗涤液和预杂交工作液以及甘油，所述的洗涤液包括第一洗涤液、第二洗涤液和第三洗涤液。
[0064]本发明的LKBlmRNA检测试剂盒的使用方法如下:
[0065]将标本用缓冲液浸泡；
[0066]用打孔液处理标本；
[0067]用消化液处理标本；
[0068]用预杂交工作液处理标本；
[0069]量子点LKBlmRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交；
[0070]甘油封片后显微镜下观察。
[0071]本发明另提供了一种LKBlmRNA检测基因芯片，通过将量子点LKBlmRNA原位杂交探针固定在固相载体表面形成，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒或塑料片。
[0072]本发明的LKBlmRNA检测基因芯片的使用方法如下:[0073]待测样品总RNA提取；
[0074]总RNA逆转录生成总cDNA ；
[0075]LKBIcDNA 的扩增；
[0076]LKBIcDNA 的标记；
[0077]将经标记的LKBlcDNA与基因芯片上的量子点LKBlmRNA原位杂交探针进行杂交。
[0078]以下为实施例。
[0079]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0080]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0081]实施例1
[0082]本实施例中选用LKBl的cDNA第一链作为LKBlmRNA原位杂交探针，LKBl的cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0083]LKBlmRNA 检测步骤:
[0084](I)量子点的0H/C00H修饰
[0085]a.0.6ml DHLA和0.9ml巯基乙醇与1.4ml甲醇混匀，随后加入130mgCdSe/ZnS量子点，65°C搅拌过夜，得到0H/C00H-量子点溶液；加入3ml氯仿使其沉淀；14000rpm离心5min收集沉淀；
[0086]b.将步骤a中收集的沉淀溶 于Iml甲醇,再用3ml氯仿沉淀，14000rpm离心5min再次收集沉淀；
[0087]c.将步骤b中所得沉淀溶于1.6ml水，用0.2 μ m滤膜过滤，得到0H/C00H-量子
占.[0088](2) 0H/C00H-量子点与LKBlmRNA原位杂交探针共价结合
[0089]a.将 2.5mg EDC、1.25mgSulfo_NHS 溶于 60 μ I 磷酸缓冲液中；
[0090]b.用步骤a中所得溶液溶解0H/C00H-量子点，0H/C00H-量子点浓度为3 μ mol/L，室温放置15min ；
[0091]C.60 μ 150 μ M氨基_LKBl_cDNA原位杂交探针与步骤b中所得溶液混匀，于30°C下反应30min ；
[0092]d.用NAP5柱层析除去过量的EDC和Sulfo-NHS，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针；
[0093](3)量子点LKBlmRNA原位杂交探针与待测标本进行原位杂交
[0094]a.用0.lmol/L枸橼酸缓冲液浸泡标本，于室温下放置IOmin ；
[0095]b.用打孔液浸泡标本,于室温下放置IOmin,再用I XPBS溶液冲洗三次；
[0096]c.用0.5“8/!111蛋白酶1(处理标本，于421:下放置201^11，再用1\?85溶液冲洗三次，后用0.2 X S SC溶液于室温下冲洗3min ；
[0097]d.用预杂交工作液处理标本，于42°C湿盒孵育4_8h，孵育期间用原位杂交专用盖玻片覆盖标本；
[0098]e.孵育后，用0.2 X SSC溶液于室温下冲洗标本三次，每次冲洗时间5min ；
[0099]f.量子点LKBlmRNA原位杂交探针溶于预杂交工作液中混合加热至70°C变性15min,量子点LKBlmRNA原位杂交探针的浓度为lnmol/L ；
[0100]g.用步骤f所得溶液覆盖标本于42°C湿盒孵育8-12h，孵育期间用原位杂交专用盖玻片覆盖标本；
[0101]h.孵育后，用2XSSC溶液，于37°C冲洗标本三次，每次冲洗时间5min，重复上述冲洗步骤一次，再用0.lmol/L TBS溶液于37°C冲洗3_5次，每次冲洗时间5min ；
[0102]1.甘油封片于荧光显微镜下观察杂交结果。
[0103]其中，CdSe/ZnS量子点的合成过程为:将30mg CdO与600mg月桂酸(dodecanoicacid)混匀后，连同4g99%T0P0和4g90%HDA放入三颈烧瓶中，充入氩气，加热至300°C恒温至CdO溶解；将180mg Se溶于2ml TOP，快速注入反应烧瓶中，再加入IOml甲苯终止反应；退火至150°C恒温30min ;将所得产物用无水甲醇冷却并使CdSe量子点沉淀，将所得沉淀于7g90%T0P0重悬，得到CdSe量子点溶液；将所得CdSe量子点溶液加热至80°C，再加入2.5mlZnS,充入氩气，继续加热至180°C恒温30min，使CdSe量子点外形成ZnS外壳，后退火至120°C恒温2.5h，得到CdSe/Zns量子点；用甲醇使CdSe/Zns量子点沉淀，收集沉淀，并保存于氯仿中备用。
[0104]预杂交工作液配方:4XSSC溶液、50%甲酰胺、IOOng/μ I BSA溶液、I X Dehardt 溶液、0.3%Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5mmol/Lribonucleosidevanadylcomplexes (核糖核苷氧f凡复合物)和 lng/ml 鲑鱼精 DNA。
[0105]LKBlmRNA探针的制备:根据SEQ ID N0.1进行DNA合成获得LKBlcDNA第一链，以此作为LKBlmrNA探针。
[0106]应用例I
[0107]将正常乳腺细胞制成细胞涂片，用实施例1中的LKBlmRNA检测方法对正常乳腺细胞涂片进行观察。图1为荧光显微镜下的观察到的与量子点-LKBlmRNA探针原位杂交的正常乳腺细胞。
[0108]应用例2
[0109]将正常胃细胞制成细胞涂片，用实施例1中的LKBlmRNA检测方法对正常胃细胞涂片进行观察。图2为荧光显微镜下的观察到的与量子点-LKBlmRNA探针原位杂交正常胃细胞。
[0110]实施例2
[0111]按照以下配方制作LKBlmRNA检测试剂盒:
[0112]量子点LKBlmRNA原位杂交探针:按照实施例1步骤(1)-(3)合成量子点LKBlmRNA原位杂交探针；
[0113]缓冲液:0.lmol/L枸橼酸缓冲液；
[0114]打孔液；
[0115]消化液:0.5 μ g/ml蛋白酶K ;
[0116]洗涤液:所述的洗涤液包括第一洗涤液、第二洗涤液和第三洗涤液，
[0117]预杂交工作液:4XSSC溶液、50%甲酰胺、lOOng/μ I BSA溶液、I XDehardt溶液、
0.3%Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5mmol/Lribonuc leosidevanady I comp I exes(核糖核苷氧钒复合物)和lng/ml鲑鱼精DNA ；
[0118]甘油。
[0119]LKBlmRNA检测试剂盒的使用方法按照实施例1步骤(3)。
[0120]实施例3[0121]按照以下配方制作LKBlmRNA检测基因芯片:
[0122]量子点LKBlmRNA原位杂交探针制备:按照实施例1步骤(1)-(3)合成量子点LKBlmRNA原位杂交探针；
[0123]用0.5mol/L NaHCO3溶液稀释量子点LKBlmRNA原位杂交探针，将稀释后的探针加入到微孔板中，加入等体积的点样液，充分混合；
[0124]将BiodyneC尼龙膜裁剪至合适大小；
[0125]用16%w/v EDTA与BiodyneC尼龙膜于室温下孵育5min,后用去离子水漂洗,并用滤纸吸干；
[0126]用点样仪取探针溶液在制备好的BiodyneC尼龙膜上点样，于室温下孵育1Omin ；
[0127]吸除BiodyneC尼龙膜表面液体，将BiodyneC尼龙膜放入0.lmol/L NaOH中浸泡IOmin,后用2*SSPE漂洗5min，再用EDTA溶液清洗；
[0128]将BiodyneC尼龙膜放入洁净塑料袋中，并加入EDTA，密封保存，备用。
[0129]上述制备的固定有量子点LKBlmRNA原位杂交探针的BiodyneC尼龙膜即为LKBlmRNA检测基因芯片。
[0130]利用本实施例的LKBlmRNA检测基因芯片检测胃癌细胞BGC823中LKBlmRNA，步骤如下:
[0131]胃癌细胞BGC823总RNA提取；
[0132]总RNA逆转录生成总cDNA ；
[0133]LKBlcDNA双链制备:根据GenBank中人LKBl基因的cDNA序列，用01igo5.0软件辅助分析，设计引物SEQ ID N0.2与SEQ ID N0.3，以总cDNA为模版进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性Imin，55°C退火Imin，72°C延伸Imin，以上进行35个循环，最后72°C延伸lOmin，所得PCR产物经纯化后，所得纯化产物即为LKBlcDNA双链；
[0134]LKBlcDNA双链标记:将LKBlcDNA用联吡啶钌进行标记，得到联吡啶钌-LKBlcDNA ；
[0135]将联吡啶钌-LKBlcDNA与LKBlmRNA检测基因芯片杂交。
[0136]联吡啶钌存在时，与量子点发生光诱导电子转移，量子点荧光被抑制，检测不到任何信号，联吡啶钌-LKBlcDNA含量越高，被抑制的量子点荧光信号越多，而联吡啶钌-LKBlcDNA的量与LKBlmRNA含量成正比，即LKBl_mRNA含量越高，量子点荧光被抑制越多，信号越弱。
[0137]虽然本发明参照当前的较佳实施方式进行了描述，但本领域的技术人员应能理解，上述较佳实施方式仅用来说明本发明，并非用来限定本发明的保护范围，任何在本发明的精神和原则范围之内，所做的任何修饰、等效替换、改进等，均应包含在本发明的权利保护范围之内。
【权利要求】
1.一种LKBlmRNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 制备LKBlmRNA原位杂交探针； 用量子点标记LKBlmRNA原位杂交探针，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针； 用量子点LKBlmRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交； 将杂交后的标本置于显微镜下观察， 其中，所述的LKBlmRNA原位杂交探针为一段与LKBlmRNA特异性结合的单链DNA或单链RNA ;所述的标本为细胞标本或组织标本,所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的用量子点标记LKBlmRNA原位杂交探针包括以下步骤: 将量子点表面用COOH和OH进行修饰，得到0H/C00H-量子点； 将LKBlmRNA原位杂交探针用氨基修饰，得到氨基-LKBlmRNA原位杂交探针； 0H/C00H-量子点与氨基-LKBlmRNA原位杂交探针反应，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的将量子点表面用COOH和OH进行修饰的步骤为: 在DHLA与巯基乙醇的混合液中加入量子点进行反应，得到第一反应液； 在第一反应液中加入氯仿，再离心，收集沉淀； 将所得沉淀用水溶解，得到第二液体； 将第二液体过滤，得到0H/C00H-量子点。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的0H/C00H-量子点与氨基-LKBlmRNA原位杂交探针反应步骤为: 将EDC与sulfo-NHS溶于磷酸缓冲液，再加入0H/C00H-量子点，反应，得到第三反应液； 在第三反应液中加入氨基-LKBlmRNA原位杂交探针，反应，得到第四反应液； 将第四反应液进行层析，得到量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述的LKBlmRNA原位杂交探针为LKBl基因cDNA、LKBl基因cRNA或靶向LKBlmRNA的特异性寡核苷酸序列。
6.一种LKBlmRNA检测试剂盒，其特征在于，包括量子点LKBlmRNA原位杂交探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、打孔液、消化液、洗涤液和预杂交工作液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液包括第一洗涤液、第二洗涤液和第三洗涤液。
9.一种LKBlmRNA检测基因芯片，其特征在于，通过将量子点LKBlmRNA原位杂交探针固定在固相载体表面形成。
10.根据权利要求9所述的基因芯片，其特征在于，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒或塑料片。
【文档编号】C12Q1/68GK103882099SQ201210562544
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】万晓春, 王伟, 粟武 申请人:深圳先进技术研究院