冠心病相关基因snp检测芯片及使用方法

冠心病相关基因snp检测芯片及使用方法
【专利摘要】本发明提供了一种冠心病相关基因SNP检测芯片及其应用，包含该基因芯片的试剂盒和使用该芯片或试剂盒检测冠心病相关基因SNP的方法。冠心病相关基因SNP检测芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针包含IL-8-251A/T,IL-17A?rs8193037G/A，IL-18-607C/A,MMP-1-519A/G,Connexin37C1019T,在内的17-32个连续核苷酸。所制备的冠心病相关基因SNP检测芯片具有良好的信噪比，所设计的探针有良好的特异性，能准确区分各类型的突变位点，并且所述检测方法步骤简单，5个SNP位点可以一步检测完成。全自动化杂交过程更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。本发明的基因芯片和应用方法可用于检测冠心病的易感基因，为冠心病的早期预防提供必要信息。
【专利说明】冠心病相关基因SNP检测芯片及使用方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因分析检测产品，具体的说是基因检测芯片，更具体的说是适用于 与冠心病有关的基因SNP位点检测的基因芯片及其应用。 技术背景
[0002] 冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary artery disease,CAD,简称冠心病）是遗 传因素和环境因素共同作用所致的一种多基因复杂性疾病，且其发病具有明显的家族聚集 性，是世界范围内死亡和致残的首要原因。根据世界卫生组织预测报告，2030年世界缺血 性心脏病的死亡人数将占总死亡人数的13. 1%。《中国心血管病报告2011》中指出，我国冠 心病死亡率城市为94. 96/10万人，农村为71. 27/10万人，较2006年分别增加了 66. 6% 和111.6%，冠心病的防治形势刻不容缓.近年来国内外研究表明冠心病与多个基因的SNP 位点有关。
[0003] Yaling Han等人于2008年就发现MMP-1基因的-519A/G连锁不平衡-340C/T分 析AT单倍型显著增加ACS风险，同时又发现CX37基因的C1019T C(CC/CT)型携带者是北 方汉族人CAD的独立风险因子。随后Fang Pei等人于2009年发现IL-18基因的-607C/A 位点可能为北方汉族人AMI的基因风险因子。Xiaolin Zhang等人于2010年发现IL-17A 基因中rs8193037位点与CAD风险联系显著，G型（GG/GA)能增加AMI病人中的IL-17A基 因表达。次年Xiaolin Zhang等人又发现IL-8基因-251A/T位点为汉族人ACS独立风险 因子对冠心病有显著影响。而这些SNP位点的突变率在中国人群中分布均比较广，所以对 这些易感基因位点进行基因检测对冠心病的早期预防具有很大的意义。但目前测定这些 SNP位点的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP)，测序，序列 特异性引物PCR，荧光定量PCR等方法，不仅操作繁琐，检测周期长，通量小不能同时检测那 么多SNP位点，波动大，而且影响检测结果的因素多，不易控制，难以满足临床检验的要求， 使临床至今还无法开展有关冠心病易感基因的检测。
[0004] 基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。 它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、CDNA克隆、PCR产物等） 有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙 膜、硝酸纤维素膜）上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物）进行杂交反应，只需一次 实验。就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在 基因表达、基因多态性检测等方面的应用受到广泛重视。用基因芯片检测IL-8, IL-17A， IL-18, MMP-1，ConneXin37等基因SNP位点，发挥基因芯片检测操作简单，通量大，结果准确 等特点，对于临床筛选冠心病高危人群，进行早期预防具有重要的现实意义。


【发明内容】

[0005] 本发明提供了一种用于检测冠心病相关基因SNP位点的基因检测芯片，还提供了 一种该芯片的使用方法。
[0006] 本发明的冠心病相关基因SNP位点的基因检测芯片，包括固相支持物和固定在 所述固相支持物上的寡核苷酸探针；所述寡核苷酸探针包含以下序列中的IL-8-251A/ T、IL-17A rs8193037G/A、IL-18-607C/A、MMP-1-519A/G 和 Connexin37C1019T 在内的 17-32个连续核苷酸，其中SEQ1和SEQ ID2包含IL-8-251A/T、SEQ3和SEQ4包含IL-17A rs8193037G/A，SEQ5 和 SEQ6 包含 IL-18-607C/A, SEQ7 和 SEQ8 包含 MMP-1-519A/G, SEQ9 和 SEQ10 包含 Connexin37C1019T。
[0007] 为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，所述IL-8-251A/T，IL-17A rs8193037G/A，IL-18-607C/A, MMP-1-519A/G, Connexin37C1019T 位于所述探针的中部。
[0008] 优选的，各探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 1?10,下划线的为SNP位点基因型：
[0009] SEQ ID No. 1:AAAGCATACATTTGATAATTCACC (IL-8-251T)
[0010] SEQ ID No. 2:AAAGCATACAATTGATAATTCACC (IL-8-251A)
[0011] SEQ ID No. 3:CTGCGACACGCCACGTAA (IL-17A rs8193037G)
[0012] SEQ ID No. 4:ACTGCGACACACCACGTAAG (IL-17A rs8193037A)
[0013] SEQ ID No. 5:ATCATTAGAATTTTATGTAATAATTTTTACAC (IL-18-607C)
[0014] SEQ ID No. 6:ATCATTAGAATTTTATTTAATAATTTTTACAC (IL-18-607A)
[0015] SEQ ID No. 7:CAATAGGGTACCAGGCAGC (MMP-1-519A)
[0016] SEQ ID No. 8:CAATAGGGTGCCAGGCAG (MMP-1-519G)
[0017] SEQ ID No. 9:GCCAAAAACCCCCAAGT (Connexin37C1019T)
[0018] SEQ ID No. 10:GCCAAAAATCCCCAAGTC (Connexin37C1019T)
[0019] 其中，SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 包含 IL-8-251A/T 位点，SEQ ID No. 3 和 SEQ IDNo·4包含IL-17Ars8193037G/A位点，SEQIDNo·5和SEQIDNo·6包含IL-18-607C/ A 位点，SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 包含 MMP-1-519A/G 位点，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10包含Connexin37C1019T位点。优选的，所述探针还可以在其5'端包含一段氨基修饰 的16?25聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)，优选为16聚的聚脱氧胸苷酸。
[0020] 上述冠心病相关基因SNP检测芯片的使用方法，步骤包括：
[0021] (1)制备待测样品的基因组DNA ;
[0022] (2)用聚合酶链反应方法扩增IL-8基因中包含-251A/T、IL-17A基因中包含 rs8193037G/A、IL-18 基因中包含-607C/A、MMP-1 基因中包含-519A/G 和 Connexin37 基因 中包含C1019T的基因片段；
[0023] (3)将所得扩增产物与杂交缓冲液混合；
[0024] (4)将上述混合液与权利要求1?5任一项所述冠心病相关基因SNP检测芯片杂 交；
[0025] (5)检测芯片的杂交信号。
[0026] 步骤（2)中，针对IL-8SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 11和 SE ID No. Q12,针对IL-17A SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 13和 SEQ ID No. 14,针对IL-18SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16,针对MMP-1SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18,针对Connexin37SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SE ID No. Q19和SEQ ID No. 20 ：
[0027] SEQ ID No.11:TTGGCTGGCTTATCTTCA
[0028] SEQ ID No. 12:GCACCCTCATCTTTTCATT
[0029] SEQ ID No. 13:TTTCTGCCCTTCCCATT
[0030] SEQ ID No. 14:CTTCCCAGGAGTCATCGT
[0031] SEQ ID No. 15:AATCAGTCCTATTGGGGTAA
[0032] SEQ ID No. 16:TTGCCCTCTTACCTGAATT
[0033] SEQ ID No. 17:CCTCCCACCTCAGCCTCT
[0034] SEQ ID No. 18:CCCCAGCACTCACTTTACG
[0035] SEQ ID No. 19:GCCCTCATCCCCACCAT
[0036] SEQ ID No. 20:TCCCCAGCCCAGTCATC
[0037] 所述引物的5'端还可以带有标记基团，所述标记基团包括但不限于：地高辛分 子（DIG)、生物素分子（Bio)、荧光素及其衍生物分子（FITC等)、其他荧光分子(如Cy3, Cy5 等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶（HRP)等。这些标记及其标记方法以及各标记物的检 测方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非 放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，科学出版社，马立人主编 《生物芯片》，化学工业出版社。
[0038] 所述固相支持物可采用各种基因芯片领域的常用材料。例如但不仅限于尼龙膜， 经活性基团(如醛基、氨基、异硫氰酸基等）修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
[0039] 本发明基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相 支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探 针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通 过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其 制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；Derisi，几等于 1997年在《科学》278 (5338):680-686发表的"探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制" (Dersi,JL, Iyer VR, Brown P0. Exploring the metablic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 1997;278(5338):680_686)及马立人等主编。 生物芯片。化学工业出版社。
[0040] 制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法很多，可以从全血中制备，也可以从组织中 制备。具体方法可参阅文献(丁振诺主编《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司）。
[0041] 用PCR方法扩增基因组DNA的特定片段已经是本领域公知技术。其中的关键在于 引物设计，有关引物设计的方法、软件均可以从商业途径获得。
[0042] 步骤（5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根 过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐显色反应或辣根过氧化物 酶催化的四甲基联苯胺显色反应，或荧光检测。
[0043] 取适量扩增产物加入杂交缓冲液中与基因芯片杂交。与基因芯片杂交时，可以先 将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
[0044] 本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域 一般人员依据经验容易较易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及 时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》； J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，科学出版社。
[0045] 然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述 检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲和素或链亲和素或抗地高辛抗 体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝（NBT)和 5_溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐（BCIP)或四甲基联苯胺（TMB)的显色反应。具 体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团 标记，也可参照用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪S Canarray3000等）获取待测信息。
[0046] 本发明还提供一种用于检测冠心病相关基因SNP的试剂盒，该试剂盒包含本发明 所说的基因芯片和使用说明书。
[0047] 本发明的冠心病相关基因SNP检测芯片可用于非诊断目的检测IL-8、IL-17A、 IL-18、MMP-1 和 Connexin37 的基因型。
[0048] 本发明所制备的冠心病相关基因SNP检测芯片具有良好的信噪比，所设计的探针 有良好的特异性，能准确区分各类型的突变位点，并且所述检测方法步骤简单，5个SNP位 点可以一步检测完成。全自动化杂交过程更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的 诸多不确定因素。本发明的芯片及其试剂盒，可用于检测冠心病相关的易感基因，为临床筛 选出冠心病高危人群，为冠心病的早期预防提供必要信息，为提供针对性治疗提供了一种 简便易行的解决方案。

【专利附图】

【附图说明】
[0049] 图1是本发明基因芯片上的一种点样阵列；
[0050] 图2是用本发明基因芯片检测的IL-8-251A/T, IL-17A rs8193037G/A， IL-18-607C/A, MMP-1-519A/G, Connexin37C1019T 五个 SNP 位点基因型所得结果的照片。

【具体实施方式】
[0051] 以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。
[0052] 所用基因序列的来源为NCBI (美国国立生物技术信息中心）：
[0053] IL-8-251A/T (rs4073)
[0054] IL-17A (rs8193037G/A)
[0055] IL-18-607C/A (rsl946518)
[0056] MMP-1-519A/G (rs1144393)
[0057] Connexin37C1019T (rsl764391)
[0058] 实施例1基因芯片的制备
[0059] 醛基修饰的载玻片（产品编号：BSM03011，上海百傲科技有限公司）。人工合成（上 海生工生物工程技术服务有限公司）以下SEQ1?10的探针，用水溶解为100pm 〇l/ul浓度 的溶液，然后用2X点样buffer (产品编号：BST02010,上海百傲科技有限公司）等比混合。 接着，用Affymetrix公司的GSM417点样仪按说明书所述方法点制如图1的阵列（1?10标 号分别为SEQ1?10的探针，0为质控探针)。室温放置过夜。
[0060] 其中各探针的序列为：
[0061] SEQ1 :NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT AAAGCATACATTTGATAATTCACC
[0062] SEQ2: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT AAAGCATACAATTGATAATTCACC
[0063] SEQ3: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CTGCGACACGCCACGTAA
[0064] SEQ4: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT ACTGCGACACACCACGTAAG
[0065] SEQ5 ： nh2-tttttttttttttttt atcattagaattttatgtaataatttttacac
[0066] SEQ6 ： nh2-tttttttttttttttt atcattagaattttatttaataatttttacac
[0067] SEQ7: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CAATAGGGTACCAGGCAGC
[0068] SEQ8: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CAATAGGGTGCCAGGCAG
[0069] SEQ9: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT GCCAAAAACCCCCAAGT
[0070] SEQ10 ： nh2-tttttttttttttttt gccaaaaatccccaagtc
[0071] 即序列表中SEQ ID No. 1?10的核苷酸，在5'端连接氨基修饰的16聚的聚脱氧 腺苷酸。
[0072] 实施例2基因组DNA的制备
[0073] 使用上海百傲科技有限公司血液DNA提取试剂盒按说明书操作如下：
[0074] 吸附柱活化：
[0075] 将吸附柱置于收集管中，加入500 μ L缓冲液BH1，静置2-3min，12, OOOrpm (9, 500Xg)离心30s ;弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入 500 μ L缓冲液BH2,12, OOOrpm (9, 500 Xg)离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放回 收集管中待用。
[0076] 操作程序：
[0077] 1)将20 μ L的蛋白酶K用移液器加入到1.5mL离心管底部。
[0078] 2)将200 μ L的血液样品加入到离心管中。
[0079] 3)加入200 μ L缓冲液BL到离心管中，振荡混匀15s。
[0080] 4)离心管 56°C保温 lOmin。
[0081] 5)短暂离心将离心管盖的液滴离下。
[0082] 6)加入200 μ L无水乙醇，振荡混匀15s。短暂离心将离心管盖的液滴离下。
[0083] 7)取已活化的吸附柱套在2mL收集管中，将上述混合液小心加入吸附柱中，不要 弄湿管口。盖上管盖，12, OOOrpm (9, 500Xg)离心lmin，弃取装废液的收集管，将吸附柱插 入新的收集管中。
[0084] 8)小心打开吸附柱的管盖，加入500 μ L缓冲液BW1,不要弄湿管口。盖上管盖， 12, OOOrpm (9, 500Xg)离心lmin,倒掉废液，将吸附柱插入收集管中。
[0085] 9)小心打开吸附柱的管盖，加入500 μ L缓冲液BW2,不要弄湿管口。盖上管盖， 12, OOOrpm (9, 500Xg)离心lmin,倒掉废液，将吸附柱插入收集管中。
[0086] 10)将吸附柱插入收集管中。12, OOOrpm (9, 500Xg)离心lmin。
[0087] 11)将吸附柱插入干净的1. 5mL无菌离心管，弃去装废液的收集管。小心打开吸附 柱的管盖，加入60 μ L的洗脱液BE或去离子水。室温（15?25°C )放置5min，然后12, OOOrpm (9, 500)离心 lmin。
[0088] 12)抽提好的DNA放置-20°C冰箱保存备用。
[0089] 实施例 3 用 PCR 方法扩增包含 IL-8-251A/T, IL-17A rs8193037G/A，IL-18-607C/ A, MMP-1-519A/G, Connexin37C1019T 等 5 个 SNP 位点的片段
[0090] 合成以下引物：（上海生工生物工程技术服务有限公司）引物下游5'端做生物素 标记
[0091] IL-8 上游 SEQ11:5，-TTGGCTGGCTTATCTTCA-3'
[0092] IL-8 下游 SEQ12:Biotin-5, -GCACCCTCATCTTTTCATT-3'
[0093] IL-17A 上游 SEQ13:5, -TTTCTGCCCTTCCCATT-3'
[0094] IL-17A 下游 SEQ14:Biotin-5, -CTTCCCAGGAGTCATCGT-3，
[0095] IL-18 上游 SEQ15:5，-AATCAGTCCTATTGGGGTAA-3'
[0096] IL-18 上游 SEQ16:Biotin-5，-TTGCCCTCTTACCTGAATT-3'
[0097] MMP-1 上游 SEQ17:5, -CCTCCCACCTCAGCCTCT-3，
[0098] MMP-1 下游 SEQ18:Biotin-5' -CCCCAGCACTCACTTTACG-3'
[0099] Connexin37 上游 SEQ19:5，-GCCCTCATCCCCACCAT-3，
[0100] Connexin37 下游 SEQ20:Biotin-5, -TCCCCAGCCCAGTCATC-3'
[0101] 然后用水或TE溶解并稀释至10pmol/ul。将购置的Taq酶(产品编号ET101，天根 生化科技有限公司)，d NTP (产品编号：D0056,上海生工生物工程技术服务有限公司）、双蒸 水以及实施例2中获得的PCR扩增模板按以下表1的配方配制PCR扩增体系：
[0102] 表 1
[0103]

【权利要求】
1. 一种冠心病相关基因SNP检测芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的 寡核苷酸探针，其特征在于，所述寡核苷酸探针为包含以下序列中的IL-8-251A/T、IL-17A rs8193037G/A、IL-18-607C/A、MMP-1-519A/G 和 Connexin37C1019T 位点在内的含 17-32 个 连续核苷酸的10个核苷酸序列。
2. 权利要求1所述冠心病相关基因SNP检测芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针序 列如 SEQ ID No. 1 ?10 所示，其中 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 包含 IL-8-251A/T，SEQ IDNo·3和SEQIDNo·4包含IL-17Ars8193037G/A，SEQIDNo·5和SEQIDNo·6包含 IL-18-607C/A，SEQIDNo·7和SEQIDNo·8包含MMP-l-519A/G，SEQIDNo·9和SEQID No. 10 包含 Connexin37C1019T ; SEQ ID No. 1:AAAGCATACATTTGATAATTCACC SEQ ID No. 2:AAAGCATACAATTGATAATTCACC SEQ ID No. 3:CTGCGACACGCCACGTAA SEQ ID No. 4:ACTGCGACACACCACGTAAG SEQ ID No. 5:ATCATTAGAATTTTATGTAATAATTTTTACAC SEQ ID No. 6:ATCATTAGAATTTTATTTAATAATTTTTACAC SEQ ID No. 7:CAATAGGGTACCAGGCAGC SEQ ID No. 8:CAATAGGGTGCCAGGCAG SEQ ID No. 9:GCCAAAAACCCCCAAGT SEQ ID No. 10:GCCAAAAATCCCCAAGTC。
3. 权利要求1或2所述冠心病相关基因SNP检测芯片，其特征在于，所述IL-8-251A/ T，IL-17A rs8193037G/A，IL-18-607C/A，MMP-l-519A/G，Connexin37C1019T 位于所述寡核 苷酸探针的中部。
4. 权利要求1或2所述冠心病相关基因SNP检测芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针 的5'端还包含一段氨基修饰的16-25聚的聚脱氧胸苷酸。
5. 权利要求4所述冠心病相关基因SNP检测芯片，其特征在于，所述探针的5'端还包 含氨基修饰的16聚的聚脱氧胸苷酸。
6. 权利要求1?5任一项所述冠心病相关基因SNP检测芯片的使用方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 制备待测样品的基因组DNA ; (2) 用聚合酶链反应方法扩增IL-8基因中包含-251A/T、IL-17A基因中包含 rs8193037G/A、IL-18 基因中包含-607C/A、MMP-1 基因中包含-519A/G 和 Connexin37 基因 中包含C1019T的基因片段； (3) 将所得扩增产物与杂交缓冲液混合； (4) 将上述混合液与权利要求1?5任一项所述冠心病相关基因SNP检测芯片杂交； (5) 检测芯片的杂交信号。
7. 权利要求6所述冠心病相关基因SNP检测芯片的使用方法，其特征在于，步骤（2) 中，所述针对IL-8SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 11和SE ID No.Q12， 针对IL-17A SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14， 针对IL-18SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16,针 对MMP-1SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18,针对 Connexin37SNP位点的上游和下游引物核苷酸序列如SE ID No. Q19和SEQ ID No. 20 : SEQ ID No. 11:TTGGCTGGCTTATCTTCA SEQ ID No. 12:GCACCCTCATCTTTTCATT SEQ ID No. 13:TTTCTGCCCTTCCCATT SEQ ID No. 14:CTTCCCAGGAGTCATCGT SEQ ID No. 15:AATCAGTCCTATTGGGGTAA SEQ ID No. 16:TTGCCCTCTTACCTGAATT SEQ ID No. 17:CCTCCCACCTCAGCCTCT SEQ ID No. 18:CCCCAGCACTCACTTTACG SEQ ID No. 19:GCCCTCATCCCCACCAT SEQ ID No. 20:TCCCCAGCCCAGTCATC。
8. 权利要求6所述冠心病相关基因SNP检测芯片的使用方法，其特征在于，步骤 (2)中，核苷酸序列如SEQ ID No. 11?20所示的用于扩增IL-8、IL-17A、IL-18、MMP-1、 Connexin37基因SNP位点目的序列的引物5'端还用生物素、地高辛、突光素、突光素衍生 物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。
9. 权利要求6所述冠心病相关基因SNP检测芯片的使用方法，其特征在于，步骤（5) 中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应、辣根过氧化物酶催化的 5_溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐显色反应或辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯 胺显色反应，或者荧光检测。
10. -种用于检测冠心病相关基因SNP的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要 求1?5任一项所述的基因芯片。
【文档编号】C40B40/06GK104099403SQ201310116606
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】韩雅玲, 张效林, 闫承慧, 张佳琦, 康健, 黄明方, 邬泽峰, 席素雅 申请人:中国人民解放军沈阳军区总医院