一种褐菖鲉cyp1b1基因全长序列及其克隆方法
【专利摘要】一种褐菖鲉CYP1B1基因全长序列及其克隆方法，涉及海洋生物基因工程领域。所述克隆方法：用褐鲳鲉的肝脏组织提取总RNA，进行反转录扩增，采用RACE获得5’端和3’端未知序列，拼接获得其全长cDNA序列。获得了褐菖鲉中CYP1B亚家族唯一成员CYP1B1基因全长CDS序列，补充了褐鲳鲉P450 CYP1B基因家族的空白，可更准确指示海域污染状况，更深入探究海洋生物在污染海域的蛋白表达等问题。通过对材料的处理与准备、RNA提取，5端和3端cDNA合成、RACE技术等获得了CYP1B1基因，该基因cDNA全长为3056bp，基因开放阅读框1724-2995bp，共编码422个氨基酸。
【专利说明】-种褐菖鈾CYP1B1基因全长序列及其克隆方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋生物基因工程领域，具体是涉及褐鲳鈾（Sebastiscus marmoratus)肝脏中一个新的海洋生物标志物CYP1B1基因的全长及其克隆方法，该基因可 编码细胞色素酶P450,该酶是一类非常敏感的指标。
【背景技术】
[0002] CYP450酶系是自然界中最具有催化活性作用的生物催化剂之一，它在生物体中 具有重要的生理功能。CYP450能对各种内源性物质（如类固醇、脂肪酸等）以及外源 性物质（如除草剂、杀虫剂、致癌物质等）进行生物转化的第I相反应（Omura T. Forty years of cytochrome P450[J]. Biochemical and biophysical research communicatio ns，1999, 266(3) :690-698.)。目前，由于CYP450酶系同工酶活性对外源性物质的高敏感性， 可以使其作为早期评估和检测水生生态环境系统污染的重要指标。近年来，CYP450在环境 毒理学方面受到了越来越多的关注。
[0003] 在水生生态系统中，鱼类与水环境中外源性物质直接相接触，所以利用鱼类 CYP450对环境污染物进行生物监测能更直观的反映环境污染状况。CYP450广泛分布于动 物、植物和微生物等不同生命体中，且在同种生物的不同器官和组织中均有其存在，但分布 具有一定的选择性，对于不同污染物暴污后的表达也有很大差异。Nelson等根据P450分 子氨基酸序列同源性制定了其命名规则：根据P450分子氨基酸序列同源性命名规则：氨基 酸同源性大于40%视为同一家族（如CYP1、CYP2、CYP3、CYP4);氨基酸同源性大于55% 视为同一亚族（如，CYP1A、CYP1B、CYP1C) (Nelson D. R.，Koymans L.，Kamataki T.，et al.P450superfamily:update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature [J]. Pharmacogenetics and Genomics，1996, 6 (1) : 1-42.) 〇 近年来在鱼体 内，关于CYPls亚族研究的最为广泛，其中主要包括CYP1A、CYP1B1、CYP1C1、CYP1C2以及 CYP1D1 基因。（Gao K.，Brandt I.，Goldstone J.V.，et al. Cytochrome P4501A，1B，1C mRNA induction patterns in three-spined stickleback exposed to a transient and a persistent inducer[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology and Pharmacology. 2010, 154(1):42-55.)。但现在拥有的褐娼軸 CYPs 亚组 基因较少，而且没有全长的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种褐菖鈾CYP1B1基因全长序列及其克隆方法。
[0005] 所述褐菖鈾CYP1B1基因全长序列如下：
[0006]
【权利要求】
1. 一种褐菖鈾CYPlBl基因全长序列，其特征在于其序列为： aagcagtggtatcaacgcagagtacatgggtgggtgggtgcttgtgcaacaaaaggaaga 60 acttaaaaaacatcagctttggttttagtgatgttcagccacaagtggagtattccagag 120 gtttctatttttgtaacactgagtaatgacagacgtctaaacagcggtggtgcctaatgt 180 cacattgttggcacatattgtatctggcagtgccaacactagctgagagattctttgaga 240 ctgtgaatgtagttgtagtcagacatgtacaccttaaaggtttattgtaactctaaaggt 300 tgaggtgacaatcaaacaggacacactgaccattgacaattcactttattaatttcatat 360 atagcttattgttccactttataaagccaacacattgataacaaaatatcctctatgagg 420 aatgcttaaacattcaaggcggagaaacacatccctcgggcattgtaacatcaactcctg 480 aatgcagacgcttaaagagagtgcagtgacatccatgtagctttgaaaaagtgactttgt 540 aaacaaacatgattttaagaatgcctcatgagtgaaagatatttgcggcacatgtgggtt 600 tttttttctactggtgagaattgtgtgtttggcacggggtagctgcagtgcttgtacagt 660 aaaactaaaccctgggtgcataaagtttgtgaagcgttcacggttcatggcaatgtctct 720 tcttcatcctttaagccgtgatggatgtctccttgatgaaagacttcctccttcacaaac 780 atgccagcctttttttcctccactttgatcagcattctctgtttaatgtgttcatatgct 840 cggagtacagtagatagtgaaatacattattacatttattgtcatacctgaaatatgaaa 900 ttataaaaaaatattttgtaactgctttttttacgtggcaaaggttaaatatattcttac 960 atattacaaatgagaacaagaagtcatcgagtgactttataacattcacaagcatttcat 1020 gtacagttatattagtttaaattgacatttaagggatgtagctatttcctgcaaacacat 1080 catacatgtacatgcgcaatagtggaccta, aaacaactcagaattatgtacacaatctga 1140 tcaagtatgaagtgtttagtgaagcagaaaatgaataccttttgcactgattccaacagt 1200 ccacaaccttgaattctacctgtagctaatattacatctttgacatcatattctcaatcc 1260 cgcaccaacaataattcaaatacagaccgtgttaagatacccattaaatatcattattaa 1320 ataggaaaatcatacaacagtaggatttagtgcaggtatgttgatactcactgttaaatg 1380 tcattggggggaaaagtgtttgctggcctcgagtcacagtattgggacgtgctgttcatg 1440 ccggggaaactaagccgagcagctttcccctgagcttggcgttcacacagagtcggaggg 1500 gcttcagcgtgagcccgtaggagcagtcaagagtgaggggctcagaggggtcgctctcaa 1560 agctgcactggtgcagcatgaccgctgtgaataaaaacacttccaccttggcgatctggt 1620 cgccgatgcagcgtcttttacctgttgaaaaaatcatcacaccgttggttatgtccttgt 1680 tgagggccccgttttcatcaaggaagcgcgaggggtcaaaaatgtgagggtccttccact 1740 tcaaggggtcatggttgacggaccactggttgatgaagacgaccgtgtctttggggatgt 1800 ggagaccctcgatggtgacatctgaagtcgtggagtgcgggatgggggatggtgacgggg 1860 acgaagctggtgaagcgcatggtctcgtagatgaaggcgtccaggtacgccaggctgctc 1920 ctgtcctcgattgatggcagtctgtcttggcctaccactttgtcgatgagctcctgcagt 1980 ttggcttgcatgtccgggtgtttgaccaggagcatgaggatccactgcatgatggtcgat 2040 accgtgtcttgacctgcgccaatcagatctgtgacggtcgcttcgacgaactctttcgtc 2100 agcccgctgtcctgtctgtgctcgatcacgttgatgatggcgtcgctcatgtcccgggtc 2160 acatcggggttgaaggactttctatgctgtcccactttgtctttcacaaaggcgaaaaac 2220 tcctcgttgaggtttttgaagttttcatagacactgcggactgggtttgggaaggactta 2280 agccagggcatgacatctaccaagctacctgctcctaccgtctccccaaacttgtccagc 2340 ttcttcaacatggtcctgaactccaggtcatcatgtccatatcgcctcccaaagcagaga 2400 gcgcacatgatgttagcagcagctactgtaaattcattagcagggtcaaagtaccgtcca 2460 tcagtgctctggcgcaaaaatacctgcaccagttccatggcctcggccatgatgtgctgc 2520 tcaaaggcttttttggtctcactgttcgcagaggaaaaggctctgaggctagactgggct 2580 attttcctgtgcgccttccactgtttgctgtaattagtaaatgtcatactcctgcctccg 2640 gagatcatctggaaagagacaaagttgggtctgcctgcaaactctttgctgtgctgtatg 2700 agagcctcacgtatcgcactgtctccgttcagaaccacaatgtcgctgcagcccagccgt 2760 atctgatacacgttgccgtatttcttggccagcttggcgaaggtgatgtgaggcatctgg 2820 cccagctgcatggcgttgcccaccactggccaggcgaagggtcctggcagtcttctcttg 2880 agcctgaggttcctgacccacagacaggcttccagacagaagaggaaaacgaaggaggcg 2940 accagagcgggatggacctgtccgctccattccctgatgatgctgctgcccttcacacca 3000 aactctgagtccagtgccattgtgacaaaaaattctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 3056 所获得的全长cDNA全长序列的编码区从第1724个核苷酸到2995个核苷酸。
2.如权利要求1所述一种褐菖鈾CYPlBl基因全长序列，其特征在于所述褐菖鈾CYPlBl基因的氨基酸序列为： MetAlaLeuAspSerGluPheGlyValLysGlySerSerHelieArg 15 10 15 Glu Trp Ser Gly Gln Val His Pro Ala Leu Val Ala Ser Phe Val Phe20 25 30 Leu Phe Cys Leu Glu Ala Cys Leu Trp Val Arg Asn Leu Arg Leu Lys35 40 45 Arg Arg Leu Pro Gly F^ro Phe Ala Trp Pro Val Val Gly Asn Ala Met50 55 60 Gln Leu Gly Gln Met Pro His He Thr Phe Ala Lys Leu Ala Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Gly Asn Val Tyr Gln He Arg Leu Gly Cys Ser Asp He Val Val 85 90 95 Leu Asn Gly Asp Ser Ala He Arg Glu Ala Leu He Gln His Ser Lys100 105 HO Glu Phe Ala Gly Arg Pro Asn Phe Val Ser Phe Gln Met He Ser Gly115 120 125 Gly Arg Ser Met Thr Phe Thr Asn Tyr Ser Lys Gln Trp Lys Ala His130 135 140 Arg Lys Tie Ala Gin Ser Ser Leu Arg Ala Phe Ser Ser Alh Asn Ser145 150 155 160 Glu Thr Lys Lys Ala Phe Glu Gln His He Met Ala Glu Ala Met Glu165 170 175 Leu Val Gln Val Phe Leu Arg Gln Ser Thr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp180 185 190 Pro Ala Asn Glu Phe Thr Val Ala Ala Ala Asn He Met Cys Ala Leu195 200 205 Cys Phe Gly Arg Arg Tyr Gly His Asp Asp Leu Glu Phe Arg Thr Met。10 215 220 Leu Lys Lys Leu Asp Lys Phe Gly Glu Thr Val Gly Ala Gly Ser Leu225 230 235 240 ValAspValMetProTrpLeuLysSerPheProAsnProValArgSer245 250 255 ValTyrGluAsnPheLysAsnLeuAsnGluGluPhePheAlaPheVal260 265 270 LysAspLysValGlyGlnHisArgLysSerPheAsnProAspValThr275 280 285 ArgAspMetSerAspAlaHeHeAsnValHeGluHisArgGlnAsp290 295 300 SerGlyLeuThrLysGluPheValGluAlaThrValThrAspLeuHe305 310 315 320 GlyAlaGlyGlnAspThrValSerThrHeMetGlnTrpHeLeuMet325 330 335 LeuLeuValLysHisProAspMetGlnAlaLysLeuGlnGluLeuHe340 345 350 AspLysValValGlyGlnAspArgLeuProSerlieGluAspArgSer355 360 365 SerLeuAlaTyrLeuAspAlaPheHeTyrGluThrMetArgPheThr370 375 380 SerPheValProValThrHeProHisProAlaLeuHisAspPheArR385 390 395 400 CysHisHisArgGlySerProHisProGlnArgHisGlyArgLeuHis405 410 415 GlnProYalValArgGln420。
3. 如权利要求I所述褐菖鈾CYPlBl基因全长序列的克隆方法，其特征在于其具体步骤 如下： 用褐鲳鈾的肝脏组织提取总RNA，进行反转录扩增，采用RACE技术，获得5'端和3'端 未知序列，拼接获得其全长cDNA序列。
4. 如权利要求3所述褐菖鈾CYPlBl基因全长序列的克隆方法，其特征在于所述扩增的 特异性引物为： Sm-CYPlBl-3'-Fl:5' -CTCTTTCGTCAGCCCGCTGTCCT-3' Sm-CYPlBl-3' -F2 :5' -ACTGCGGACTGGGTTTGGGAAGG-3'Sm-CYPlBl-5'-Fl:5' -CCGGCATGAACAGCACGTCCCAATA-3' Sm-CYPlBl-5'-Fl:5' -CGTCCCAATACTGTGACTCGAGGCC-3'。
【文档编号】C12N15/53GK104450751SQ201410815726
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】陈荣, 李珍珍, 陈晔, 王重刚, 左正宏 申请人:厦门大学