一株具有乙酸丁酯降解能力的烟曲霉菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种乙酸丁酯降解菌——烟曲霉菌（ Aspergillus fumigatus ）HD-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC M:2014175，保藏日期：2014年7月11日。本发明还涉及上述烟曲霉菌在降解乙酸丁酯、氯苯、α-蒎烯、异丙醇或乙酸乙酯中的应用。本发明降解高效、耐受能力强。CCTCC NO：M201417520140503
【专利说明】一株具有乙酸丁酯降解能力的烟曲霉菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus)HD-2,及其在微生物降解乙 酸丁酯等污染物中的应用。
【背景技术】
[0002] 酯是酸（羧酸或无机含氧酸）与醇起反应生成的一类有机化合物。低级的酯是有 香气的挥发性液体，高级的酯是蜡状固体或很稠的液体。几种高级的酯是脂肪的主要成分。 酯难溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，其中低分子量的酯类是无色、易挥发的气体。低分子 量的酯可用作溶剂，分子量较大的酯是良好的增塑剂。如甲基丙烯酸甲酯是制造有机玻璃 (聚甲基丙烯酸甲酯）的单体；聚酯树脂主要用于纤维和油漆工业，也可制成压塑粉；许多 带有支链的醇形成的酯是优良的润滑油。酯还可用于香料、香精、化妆品、肥皂和药品等工 业。小分子酯类经排放挥发进入大气环境后，对眼及呼吸道产生刺激作用，高浓度则会产生 急性中毒。
[0003] 生物净化技术具有去除效率高、处理费用低、二次污染小等特点，逐渐被广泛应用 于有毒污染物的降解和净化。采用生物技术处理苯及苯系物的关键之一便是获得具有高 效降解其能力的菌株。目前，通过国内外研宄获得并分离到对各类挥发性污染物具有降解 能力的真菌有包括分属于原毛平革菌属（Phanerochaete)、拟青霉菌属（Paecilomyces)、 镰刀霉菌属（Fusarium)、曲霉菌属（Aspergillus)、木霉属（Trichoderma)、孢瓶霉属真菌 (Cladosporium)等10个属的菌株的一些菌种。可降解的目标污染物主要是苯、甲苯、乙苯 等苯系化合物、氯苯等氯代烃类、甲基乙基酮等酮类和其他一些有机酸类。也有研宄发现 原毛平革菌属，毛霉属等有一些菌种具有利用酯类化合物为碳源的能力，表明真菌存在降 解酯类污染物的能力。目前，已经有学者提出利用烟曲霉治理污染环境，主要是关于染料脱 色，多酚类化合物以及PAHs (蒽）的生物降解，木质素降解等。
[0004] 2006年3月出版的第22卷第2期《高分子材料科学与工程》中，题为"聚丁二酸 丁二醇酯及聚丁二酸/己二酸-丁二醇酯在微生物作用下的降解行为"一文中提到："堆肥 中对PBSA和PBS降解能力最强的微生物是杂色曲霉菌。"
[0005] 上述现有技术中其一，杂色曲霉菌和烟曲霉菌虽然同属于曲霉属，但它们是两个 完全不同的种。另外就降解目标物来讲，PBSA和PBS属于高分子聚合物，而乙酸丁酯属于 有机物，两种物质结构完全不同，且文献中并未提及PBSA和PBS降解为何种物质。因此现 有技术不能用于乙酸丁酯的生物降解。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种高效、耐受能力 强的具有乙酸丁酯降解能力的烟曲霉菌及其应用。
[0007] 本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：该乙酸丁酯降解菌一一烟曲霉菌 (Aspergillus fumigatus)HD-2,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉 大学，430072,保藏编号：CCTCC Μ: 2014175,保藏日期：2014年5月3日。
[0008] 所述烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus)HD_2菌落特征如下：在30°C恒温培养箱 中接种2d后便开始萌芽，先以白色绒毛样扩散，后变为淡黄色，培养基背面无色，第3d，菌 落中间变成烟绿色，培养基背面为淡黄色，之后菌落明显增大，直径可达1.2cm左右，中间 绿色加深，并且塌陷呈粉末状，菌落具有广铺性，呈放射状生长，不能形成单个菌落，后期菌 落全部呈现深绿色，粉末状，菌丝致密。
[0009] 本发明所述的具有乙酸丁醋降解能力的烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus)HD-2 在降解乙酸丁酯、氯苯、α-蒎烯、异丙醇或乙酸乙酯中的应用。所述的降解在pH值为5. 4， 30°C的条件下进行的。
[0010] 该菌株HD-2在pH值为5. 4, 30°C的条件下，HD-2可在48h内将初始浓度为176mg/ L的乙酸丁酯基本完全降解。该降解菌的发现对废气中乙酸丁酯的高效净化具有重要意义。 该烟曲霉菌HD-2还可降解其他工业常见有机污染物，尤其是氯苯、α -蒎烯、异丙醇、苯及 甲苯等都有不错的降解效果。
[0011] 本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明的烟曲霉菌HD-2取自污水厂污泥， 对于酯类，尤其是乙酸丁酯具有较好地降解效果，可以较为完全地把污染物转化为C02、H2O 等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解苯、氯苯、α-蒎烯等工业常见的污染物，因 而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。
[0012] 本发明所述的烟曲霉能将乙酸丁酯完全降解为无机物（Η20和C02)和细胞生物 质，实现完全矿化，且对于乙酸丁酯的耐受浓度高达350mg/L。因此，该烟曲霉对于工业常见 污染物（如乙酸丁酯等）具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图 1 为 Aspergillus fumigatus HD-2 孢子扫描电镜照片。
[0014] 图 2 为 Aspergillus fumigatus HD-2 的系统发育树图。
[0015] 图3为pH值对Aspergillus fumigatus HD-2降解乙酸丁醋的影响。
[0016] 图4为Aspergillus fumigatus HD-2在24h内对不同乙酸丁醋的降解率。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此。实施例中未特别表述的方法均为现有技术。
[0018] 实施例I :AspergiIlus fumigatus HD-2的分离、纯化及其鉴定。
[0019] I. Aspergillus fumigatus HD-2 的分离及纯化。
[0020] 将七格污水厂的污泥空气曝气三天后，取50ml上清液进行离心，将沉淀下来的污 泥加入到装有50ml的无机盐培养基（经110°C，40分钟灭菌）的盐水瓶中，并且添加链霉 素0· 003g，庆大霉素0· 001g。盖上瓶塞后加入5 μ 1乙酸丁酯（浓度约为88mg/L)。放置在 30°C，160rpm的摇床中培养。隔一段时间观察盐水瓶中菌体生长情况，之后在已降解完全的 盐水瓶中取5ml菌悬液到装有新鲜的50ml的无机盐培养基的瓶中，仍添加链霉素0. 003g， 庆大霉素0. 〇〇lg。盖上瓶塞后加入10 μ 1乙酸丁酯（浓度约为176mg/L)。将培养瓶置于 30°C，160rpm的摇床中培养。培养一定时间后，再取5mL菌悬液到装有新鲜的50ml的无机 盐培养基的瓶中，添加链霉素0. 〇〇3g，庆大霉素0. OOlg。盖上瓶塞后加入15μ1乙酸丁酯 (浓度约为264mg/L)。置于摇床中培养。取2ml混合菌液，涂布于移除碳源的察氏培养基 上，于培养皿盖中央置Icm直径的滤纸片并在其上加入5 μ 1的乙酸丁酯，连续划线分离，最 终获得纯化菌株，接种到PDA斜面培养基中，在4°C的冰箱中保存。
[0021] 2. Aspergillus fumigatus HD-2 的鉴定。
[0022] 利用真菌ITS的通用引物对HD-2基因组DNA进行PCR扩增得到的目的DNA片段。 将该序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。结果表明HD-2菌株的ITS序列 与菌株 Aspergillus fumigatus isolate NRRL164 (EF669932. I) >AspergiIIus fumigatus isolate lla-2a (KF020294. I)>Aspergillus fumigatus strain ATCC 90906 (KC689327. I) 的ITS序列区具有100%的同源性。从结果中选取10株Aspergillus具有代表性的菌 株，以ITS基因序列同源性为基础，结合采用Clustal X2.0和MEGA4. 0(1000次抽样分 析）软件构建系统发育树。通过遗传距离及ITS序列对比，鉴定为烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus)，命名为 HD-2。
[0023] PCR扩增反应体系见表I，PCR扩增的反应条件为95 °C预变性5min，95 °C变性30s， 55°C退火 30s，72°C延伸 40s，循环 32 次；72°C延伸 10min，10°C保存。 表IITS序列PCR扩增反应体系
【权利要求】
1?一种具有乙酸丁醋降解能力的烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus) HD-2,保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M: 2014175。
2. 根据权利要求1所述的具有乙酸丁醋降解能力的烟曲霉菌（Aspergi 11 tts HD-2在降解乙酸丁醋、氯苯、a -薇稀、异丙醇或乙酸乙醋中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的降解在pH值为5. 4, 30°C的条件下 进行的。
【文档编号】C12R1/66GK104480024SQ201410814363
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】成卓韦, 陈建孟, 於建明, 陆李超 申请人:浙江工业大学