一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，属于分子生物学领 域。
【背景技术】
[0002] L印tin蛋白是由肥胖基因（ob)编码，由脂肪细胞分泌的一种蛋白类激素，为非糖 蛋白。它由167个氨基酸组成，进入机体血液循环后，N末端的21个氨基酸的信号肽被去 除，形成含146个氨基酸的成熟瘦素，在血液中游离或参与瘦素结合蛋白结合，到达中枢和 外周与多种受体结合而发挥生物学效应。从而在一定程度上可调节动物的摄食、能量利用、 生长、繁殖和免疫机能。因此，研究Leptin基因对于阐明动物脂肪代谢和肌肉发育过程具 有重要的意义。
[0003] 基因过量表达就是采用加强启动子和增强子等调控元件的功能来增强基因的表 达量，促使其特异地、高效地表达特定基因，为研究相关基因功能提供了一种可行的途径。
[0004] 人类疾病的深入研究治疗也离不开实验动物疾病模型，尤其是在基因药物的开发 方面，动物模型更具有重要的应用价值，而猪在体型大小、生理状况、器官发育以及疾病发 展过程方面都与人类极为相似，价格也便宜，是一种合适可靠的动物疾病模型。
[0005] 本发明以研究L印tin基因的表达量为切入点，通过体外构建L印tin基因的过量 表达载体，利用实验室现有的克隆转基因技术，成功地实现了L印tin基因在猪上的过量表 达，建立了L印tin基因过量表达的动物模型，为人类与L印tin相关基因表达量调控、分子 代谢调控的致病机理以及治疗策略研究提供了重要的参考应用价值。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有动物模型的不足，针对上述问题，本发明提供了一种构建过量表达 L印tin基因的克隆猪的方法，通过构建过量表达L印tin基因的载体，利用体细胞转基因克 隆技术，使L印tin基因在猪体内实现过量表达，最终获得了过量表达L印tin基因的克隆 猪。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：
[0008] -种构建过量表达L印tin基因的克隆猪的方法，主要按照以下步骤进行：
[0009]第一步、构建Leptin基因过量表达载体
[0010]1)用PCR法扩增目的L印tin基因并对胶进行回收，并将L印tin片段连接到pMD18_T载体上，得到重组质粒pMD18_Leptin;
[0011] 2)酶切pIRES2-AcGFPl载体和PMD18-L印tin载体，利用胶回收试剂盒对 所需的片段大小进行回收，将L印tin连接到pIRES2-AcGFPl载体上，得到重组质粒 pLeptin-IRES2-AcGFPl；
[0012] 3)采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对 pL印tin-IRES2-AcGFPl载体进行回收和纯化，-20°C保存备用；
[0013] 第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
[0014] 1)利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
[0015] 2)复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使 细胞全部死亡的最适浓度500ng/ul;
[0016] 3)再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90 %时收集细胞并计数，将细胞用电击 缓冲液重悬，并加入30ug线性化转基因载体pL印tin-IRES2-AcGFPl，移入电击杯中进行转 染；
[0017] 4)电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，48h后收集细胞 进行初步鉴定和极度稀释培养；
[0018] 5)根据步骤2)中得到的最适浓度，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当 浓度G418的含有10 %FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d后能得到 牛津杯大小的单克隆点；
[0019] 6)在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48 孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的DMEM完全培养基（含10%FBS)进行培养， 每天观察细胞生长状况，将长满的细胞详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定 是否是阳性，一份用于扩大培养；
[0020] 7)待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取基因组DNA，PCR鉴 定是否是阳性，对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；
[0021] 第三步、L印tin细胞的核移植及胚胎移植
[0022] 1)受体卵母细胞的培养
[0023]a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
[0024] b、挑选直径为3_6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟 培养液滴中，在5%C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h;
[0025] 2)构建过量表达L印tin基因的重构胚
[0026]a、取转入L印tin基因的成纤维细胞，用含有0· 5%FBS的DMEM培养48h，使体细 胞处于6。或Gi期；
[0027] b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.lmg.mL1透明质酸去除卵母细 胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0. 5-lh，在操作液中 用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转L印tin基因的成纤维体细胞导入 到去核的卵母细胞的卵间隙中；
[0028] 3)电融合和电激活重构胚
[0029] 再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理；完 成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后 进行电激活，重构胚移入含有2. 2ug.mL 的培养液中后放入含有5%C02、5% 02、38. 5°C 的三气培养箱中平衡2h;
[0030] 4)重构胚的体外培养
[0031] 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移 植；
[0032] 5)将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得 转Leptin基因的克隆仔猪；
[0033] 第四步、转L印tin基因克隆仔猪的过量表达验证
[0034] 利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验 证；
[0035] 作为优选，进一步，体外重组Leptin基因通过线性化过量表达质粒载体 pL印tin-IRES2-AcGFPl来特异地增强基因的表达量。
[0036] 作为优选，进一步，在第一步构建Leptin基因过量表达载体中，在重组Leptin基 因过量表达载体pL印tin-IRES2-AcGFPl时，在对pIRES2-AcGFPl载体和pMD18-L印tin载 体进行酶切重组时，采用SalI和EcoRI进行双酶切，其具体步骤为：
[0037] a、PCR扩增体系：
[0038] Lcptin-F (GGC CCC AGA AGC ACA TCC) 2ul Leptin-R (TCA GCA GCC AGG GCT GAG) Taq 酶 25ul Leptin cDNA 模板 lul 双蒸水 20uJL 总体积 50ul
[0039]b、pMD18-Leptin载体的构建按下列体系在16°C的恒温金属浴中连接2h进行：
[0040] Leptin.基.国： 3ul 载体 ltd
[0041] 双蒸水 lul Solution I 5u] 总体积 IQul
[0042] c、SalI和EcoRI双酶切pIRES2-AcGFPl载体和pMD18-L印tin，时间为2h，其反 应条件如下：
[0043] Sal I酶 D:.,如1 EcoR I酶 0, §ul Η) XH Buffer 2ul 质粒DNA Sul 双蒸水 12ul 总体积 2:Qul
[0044]d、将L印tin和pIRES2-EGFPl连接反应体系如下，反应条件为16°C的恒温
[0045] 金属浴中连接2h;
[0046] Leptin 4：ul 载体 pTRES2-KGFP1 lul Solution I 5lal 总体积 lOuU
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