一种表达人类胰淀素的花生、大豆的培育方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达人类胰淀素的花生、大豆的培育方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（DM)是内分泌与代谢失常导致的常见慢性病。2011年，全球约有3. 66亿 DM患者，死亡人数高达460万，经济损失高达4650亿美元；至2030年，人数将升高到5. 52 亿。2007 - 2008年我国全国调查结果显示，DM患病率高达9. 6%，总患者数约为9200万 人。更甚者，DM前期糖耐量减低（IGT)/空腹血糖受损（IFG)的患病率已高达15. 5%，推算 出全国DM前期的患者数约为1. 48亿人。通过与以往的调查数据相比，青中年人群患病的 人数增加得更为明显。在城市中，无论经济水平发达与否，DM患病率均超过10% ;且DM前 期人群无城乡差别。
[0003]目前胰岛素是被广泛用于DM的临床治疗的常规药物。胰岛素由胰腺胰岛β细胞 分泌，是机体内唯一降低血糖的经典激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素 主要用来治疗DM，而DM患者早期使用胰岛素和超强抗氧化剂如注射用硫辛酸、口服虾青素 等。胰岛素因其促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，故而 容易出现低血糖的不良反应；其次，注射胰岛素会产生疼痛感，长期反复在相同相近部位注 射胰岛素刺激皮下脂肪增生而形成脂肪垫；而且，注射胰岛素的部位可出现皮下脂肪萎缩， 形成不易察觉的小凹陷。更令医生和病人担心的是，注射胰岛素一段时间后，不仅会造成胰 岛素抵抗，需要不断加大胰岛素剂量；而且病人体重增加，导致向心性肥胖，增加心脑血管 病风险。胰岛素作用过程涉及水与电解质的平衡（促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细 胞内），所以还容易引起胰岛素性水肿、胰岛素过敏反应等。所以虽然注射胰岛素可以快速 降糖，商品化与临床应用也得到大范围的推广，但其固有缺陷与长期使用后的风险也成为 了医学界关注的焦点。
[0004] 我们通过前瞻性研究观察华人2型DM2906例（其中胰岛素治疗971例），连续 随访7年。横断面资料研究中美国2型DM25964例，英国2型DM84622例。死亡、癌症、 慢性并发症、低血糖与危症是主要临床终点。结果发现胰岛素治疗显著增加2型DM临床终 点事件风险。注射胰岛素虽可快速降糖，胰岛素商品化和胰岛素治疗得到临床推广，然而胰 岛素治疗的系统风险也成为医学界关注的焦点问题。目前DM人群还在迅速扩大，胰岛素使 用者并发癌症、冠心病、脑中风、慢性肾病、低血糖的风险不断攀升。（牟学晶；任欣欣；赵海 潞.胰岛素治疗的系统风险.临床合理用药杂志2014 ;7(7B) :12-14.)
[0005] 人类胰淀素（hlAPP)又称胰淀素（Amylin)，于1987年由瑞典病理学家Westermark P和新西兰学者CooperGJ从人胰岛素瘤和2型DM胰腺组织中发现。[Cooperetal·，1987; Westermarketal.，1987]人胰淀素（HumanIAPP，hIAPP)由37个氨基酸组成，分子中第 二和第七位半胱氨酸残基之间形成二硫键，羟基末端酰胺化，中间第20 - 29位氨基酸组 成具有种属差异性，与致淀粉样变能力密切相关。电镜和免疫组化染色显示，胰淀素与胰 岛素共存于成人胰岛β细胞内。正常人胰腺组织中含有与胰岛素相当数量的hlAPP阳 性细胞，血液中hlAPP含量也与血胰岛素水平密切相关。1型糖尿病病人胰腺组织内和 血液里几乎检测不到hlAPP ;胰岛素抵抗和高胰岛素血症的患者，hlAPP的含量也高；需 要胰岛素控制血糖的2型DM病人胰腺组织内和血液里的hlAPP水平低下。hlAPP是胰 岛淀粉样变的主要组分，胰岛淀粉样变又是人类2型DM的病理特征。加之hlAPP有调节 糖代谢和胰岛素、胰高血糖素等相关激素分泌的作用，因此自hlAPP发现以来，hlAPP与 糖尿病的关系就一直为人关注。自1999年至2010年，我们收集了香港中文大学医学院、 北京协和医院和解放军总医院病理科436例2型DM的人体解剖组织样本以及相应临床 资料，详细观察了胰腺组织改变，系统研究了胰岛淀粉样变的临床病理学特征，结果显示 hlAPP有可能具有重要内分泌调节作用。（参考文献：（l)Zhao HL，Lai FM，Tong PC，et al. Prevalence and cl inicopathological characteristics of islet amyloid in Chinese patients with type 2diabetes. Diabetes. Nov 2003 ；52 (11):2759-2766. (2) Zhao HL, Sui Y，Guan J，et al. Higher islet amyloid load in men than in women with type 2diabetes mellitus. Pancreas. Oct 2008 ；37 (3) : e68-73. (3) Zhao HL, Guan J, Sui Y，He L，Lai FF. Islet amyloidosis and beta-cell neogenesis in chronic calcifying pancreatitis with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Pancreas. Apr 2009； 38(3):342-344. (4) Zhao HL，Sui Y，Guan J，et al. Amyloid oligomers in diabetic and nondiabetic human pancreas. Transl Res. Jan 2009；153(1) :24-32. (5) Zhao H，Guan J，Lee HM，et al. Up-regulated pancreatic tissue microRNA-375associates with human type 2diabetes through beta-cell deficit and islet amyloid deposition. Pancreas. Aug2010 ;39 (6) :843-846.)在体内外研究hlAPP的生物学功能和药理疗效过程 中，我们发现hlAPP不仅可以调节炎症反应和免疫因子分泌，具有重要的免疫调节作用，而 且对体内糖稳态的调节起重要作用。（赵海潞，张均智，牟学晶.一种人类多肽在制备免 疫调节剂中的应用.公开号CN 102441159B.)
[0006] 人类的饮食养生，以"五谷为养，五果为助，五畜为益，五菜为充"为原则。油料作物 是人类生存长期所依赖的食物，在食物链中属于一级能量的来源，其来源广泛，营养丰富， 具有普遍适应性。萌芦科、豆科、以及茄科植物是世界上最重要的食用植物科属，其重要性 仅次于禾本科的五谷粮食。
[0007]油料农作物中，"花生悦脾和胃润肺化痰、滋养补气、清咽止痒"。花生作为人们喜 爱的传统食品之一，自古以来就有"长生果"的美誉。花生与大豆是典型的油料作物代表。 它们的共同特征是：人类可以直接生吃或者稍加工即可食用。但这类油料作物本身不含 hlAPP，不具备hlAPP的作用。
[0008]目前尚未见有利用人类日常生活所依赖的此类富含植物蛋白的豆科植物、油料作 物为天然'工厂（Plant)'，生产具有调控糖代谢作用的重要蛋白-人类胰淀素，即表达人 类胰淀素的油料作物培育方法的文献和专利报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种表达人类胰淀素的花生、大豆的培育方法。
[0010] 实现本发明目的的技术方案是：
[0011] -种表达人类胰淀素的花生、大豆的培育方法，包括如下步骤：
[0012] (1)提取一种含有人类胰淀素基因编码序列的质粒DNA ;所述的基因包含37个氨 基酸，分子中第二和第七位半胱氨酸残基之间形成二硫键，羟基末端酰胺化，中间第20-29 位氨基酸组成具有种属差异性；氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSN TY；
[0013] (2)构建质粒表达载体，该表达载体包含胰淀素（hlAPP)基因的 CAMV35S-hIAPP-N0S表达框，具体是指抗卡那霉素选择标记的植物表达载体
[0014]--pcambia-CAMV35S-hIAPP-N0S-1301；
[0015] (3)采用花粉管导入转化人类胰淀素基因，培育表达人类胰淀素的花生、大豆；
[0016] (4)检测上述油料作物在F1代苗中hlAPP的表达。
[0017]步骤（1)所述人类胰淀素质粒DNA的提取，其方法是：
[0018] 在超净工作台上挑取保存的菌体接种在LB固体培养基上培养，菌板置于恒温培 养箱，37°C培养12h，至单菌落产生；挑取单菌落接种于LB液体培养基，在恒温摇床上37°C、 285r/min过夜培养（13h左右至对数生长后期），待0D600值为0. 5-0. 8时可用于质粒DNA 的提取；采用裂解法提取质粒DNA，将DNA提取液稀释100倍，用THERMO超微量分光光度计 测定其在波长260纳米和280纳米波长下的吸收值，0D260/0D280