用于土壤次生盐渍化监测的绿色荧光蛋白的表达及应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种用于土壤次生盐渍化监测 的绿色荧光蛋白（GFP)的表达及应用方法。
【背景技术】
[0002] 设施栽培土壤由于缺少雨水淋洗且长期处于高集约化、高复种指数和高施肥量的 生产状态，因此盐渍化面积迅速扩大，且盐渍化程度逐渐加剧。设施栽培中氮肥的使用远远 超过了作物需求量，作物对氮肥的利用率较低，大部分氮肥被累积与土壤中或渗入地下水 或以其他形式流失。设施土壤中N03_是引起次生盐渍化的主要盐分离子之一，N03_的累积 量约为阴离子总量的60%。硝酸盐的积累不仅成为设施土壤次生盐渍化的主要特征之一， 也会阻碍作物生长、导致产量下降以及硝酸盐在作物内的累积。
[0003] 针对次生盐渍化的发生，目前采取的措施主要有物理修复、化学修复及生物修复 法。其中生物修复法中的微生物修复因具有环境风险小、成本低及效率高等优势成为近年 来修复土壤次生盐渍化的热点。修复菌株在土壤中的扩散和生存竞争能力是评价修复效果 的重要指标，对提高和稳定菌剂的修复效果、制定科学的施用技术具有重要意义。但是长期 以来，缺乏直观有效的技术手段对其进行深入研究，传统的抗生素标记及放射性同位素标 记等技术手段难以直观、准确地区分土著微生物和人工接种微生物。发光标记系统等现代 基因标记技术的兴起为探明修复菌株在土壤中的动态变化提供了有效的研究手段。绿色 荧光蛋白因具有结构稳定、作用持久、方便直接检测等优点，成为目前应用最广泛的标记分 子。
[0004] 芽孢杆菌属为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，因此与革兰氏阴性菌相比，较难转化。 已有的对芽孢杆菌属的绿色荧光蛋白标记研究多集中于枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短 小芽孢杆菌等，而对于巨大芽孢杆菌的研究鲜有报道。
[0005] 经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103333908A公开（公告）日 2013. 10. 02,公开了一种以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2及其制备方法和应用，所述衍生 质粒是以绿色荧光蛋白作为报告基因的启动子筛选载体。所述制备方法包括以下步骤：敲 除噬菌体中质粒复制表达非必需的基因，融合氯霉素基因、克隆复制起始位点、克隆结合转 移元件、多克隆位点插入到所述噬菌体基因区域，获得PSW2表达载体；同时将绿色荧光蛋 白插入多克隆位点，筛选不同强度的启动子序列，构建生成启动子筛选载体。该技术提供的 穿梭质粒能够在大肠杆菌内和不同的希瓦氏菌中复制表达，同时可作为基因回补载体应用 于希瓦氏菌基因的功能鉴定，也可以在低温下高效表达外源基因。但该技术所涉及的希瓦 氏菌为革兰氏阴性菌，转化相对容易，且菌株本身不具备高效降解硝酸盐的能力，无法应用 于次生盐渍化土壤的修复。
[0006] 中国专利文献号CN104878038A公开（公告）日2014. 09. 02,公开了一种低温诱 导高效异源表达载体PSW4及其制备方法和应用，所述pSW4来源于专利CN103333908A中对 穿梭载体pSW2的改造，所述制备方法包括以下步骤：敲除质粒pSW2上FpsB序列，启动子PR1869及RBS序列的克隆，His-Tag的克隆，连接报告基因GFP筛选高效表达株。该技术 提供的低温高效表达载体既能够在不同的希瓦氏菌中复制及表达，同时在模式细菌大肠杆 菌中也能有效利用。但该技术同样存在转化方法不能用于革兰氏阳性菌，且菌株无法用于 土壤次生盐渍化监测的缺陷。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种用于土壤次生盐渍化监测的绿色 荧光蛋白的表达及应用方法。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明涉及一种用于土壤次生盐渍化监测的绿色荧光蛋白的表达方法，将gfp 基因连接到大肠杆菌-巨大芽孢杆菌的穿梭质粒PHIS1525上，构建成pHIS1525 -GFP质 粒，转化大肠杆菌，然后提取该质粒，通过原生质体转化方法将重组质粒转入巨大芽孢杆菌 NCT- 2中，获得了表达绿色荧光蛋白的巨大芽孢杆菌菌株NCT- 2 -GFP。
[0010] 所述的gfp基因，即绿色灰光蛋白基因，其核甘酸序列如Seq ID No. 1所不。
[0011] 所述的原生质体转化方法，具体包括以下步骤：
[0012] 1)设计引物GFP-sense和GFP-anti，以绿色荧光蛋白基因序列为模板，进行PCR 扩增，扩增产物与载体pMD18 -T连接，将连接产物pMD18 -T-GFP转化大肠杆菌Transl09 感受态，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的阳性克隆；
[0013] 2)分别提取质粒pMD18 -T-GFP和pHIS1525,同时进行双酶切后回收产物进行连 接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的阳 性克隆，并进行酶切和测序验证，构建了表达载体PHIS1525 -GFP;
[0014] 3)制备巨大芽孢杆菌NCT- 2的原生质体，并提取质粒pHIS1525 -GFP，将质粒转 化巨大芽孢杆菌NCT-2中，通过四环素抗性筛选和荧光显微镜观察来挑选阳性克隆并测序 验证，获得了表达绿色荧光蛋白的巨大芽孢杆菌NCT- 2 -GFP。
[0015] 所述的巨大芽孢杆菌NCT-2于2011年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo. 4698。
[0016] 所述的引物为：
[0017] GFP - sense :5' - GCAGATCTGAATGGTGAGCAAGGGCGAG' - 3
[0018] GFP - anti :5' - GGCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG' - 3〇
[0019] 步骤1)中所述的阳性克隆是指含有质粒pMD18 -T-GFP的大肠杆菌Transl09。
[0020] 所述的双酶切中，位点为BglII和BamHI。
[0021] 步骤2)中所述的阳性克隆是指含有质粒pHIS1525 -GFP的大肠杆菌DH5α。
[0022] 步骤3)中所述的阳性克隆是指含有质粒pHIS1525 -GFP的巨大芽孢杆菌NCT-2。
[0023] 本发明涉及上述巨大芽孢杆菌菌株NCT- 2 -GFP的应用，将其发酵后施用于次生 盐渍化土壤，以实现对土壤中Ν03_含量的动态监测。
[0024] 所述的动态监测是指：通过定期观察并计算所述土壤的采样中存活菌体的数量和 扩散情况得以实现。 技术效果
[0025] 现有的野生巨大芽孢杆菌在土壤中的动态变化难以检测，本发明提供表达绿色荧 光蛋白的巨大芽孢杆菌NCT- 2 -GFP及其制备方法和应用，通过实时监测荧光菌株以确定 其在土壤中的动态变化，具有操作简单和检测直观的优点。
【附图说明】
[0026] 图1为实施例中pMD18-T-GFP重组载体及酶切验证电泳图；
[0027] 图中：M :DL 2000DNA Marker ;1 :质粒pMD18-T-GFP;2 :质粒pMD18-T-GFP酶 切；
[0028] 图2为实施例中pHIS1525 -GFP重组载体酶切验证电泳图；
[0029] 图中：M :DL2000DNAMarker;1:质粒pHIS1525 -GFP酶切；
[0030] 图3为实施例中表达绿色荧光蛋白的巨大芽孢杆菌NCT- 2 -GFP的荧光观察图。
【具体实施方式】 实施例1
[0031]pMD18 -T-GFP载体的构建
[0032] 根据绿色荧光蛋白gfp基因序列，设计相应引物扩增该基因连接到pMD18 -T载体 上。
[0033] 设计引物如下：
[0034] GFP - sense :5，- GCAGATCTGAATGGTGAGCAAGGGCGAG，- 3
[0035] GFP - anti :5' - GGCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA