一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种通过定向进化手段获得源于无乳链球菌 Streptococcus agalactiae ATCC-BAA611的谷胱甘肽合成酶基因gshF基因的突变基因，以 及在构建毕赤酵母和酿酒酵母谷胱甘肽生产菌株中的应用。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽（L-Glutathione)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的生物活性 三肽，全称为5-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸。
[0003] 在细胞内，谷胱甘肽主要以还原型谷胱甘肽（GSH)和氧化型谷胱甘肽（GSSG)两种 形式存在，其中主要以还原型为主。谷胱甘肽具有游离的巯基和很强的供电子或质子氢的 能力，因此谷胱甘肽具有重要的生理功能：（1)作为胞内最丰富的抗氧化剂，保护DNA、蛋白 质和其它生物分子抵抗氧化损伤；(2)通过谷胱甘肽-S-转移酶完成对外源物质的解毒作 用；（3)参与氨基酸的吸收及转运；(4)参与细胞信号转导，维持细胞正常生命活动，其代谢 异常可导致细胞病变如纤维化；(5)调节淋巴细胞的功能，发挥抗病毒作用。因此，谷胱甘 肽在医药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用。
[0004] GSH含有氨基、羧基、巯基和酰胺等多种给电子配位基团，可以和细胞内的有毒金 属呙子结合，从而起到解毒作用。大量的研究证明，有毒的金属呙子（如Hg2+、Cu2+、Cd2+、 Ni2+)能使细胞内的GSH的含量大大降低。有毒金属离子通过和GSH结合排除体外，对金属 离子细胞毒性起到保护作用。因此，近年来对GSH与金属离子的相互作用的研究越来越受 到重视。
[0005]目前，谷胱甘肽（GSH)的生产方法主要有化学合成法、固定化细胞法、酶法和发酵 法。化学合成法生产GSH工艺已较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复 杂、需光学拆分且存在环境污染等问题；酶法生产谷胱甘肽需要获得相关的酶系，需要消耗 ATP，需要加入前体氨基酸等物质，造成成本较高；发酵法生产GSH就是选育GSH合成能力强 和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下 游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量。由于该方法所用原料可再生，产物对环境无污 染等优点而越来越受人们的关注。目前国内外发酵法合成GSH的菌种主要是酿酒酵母、毕 赤酵母、产朊假丝酵母、大肠杆菌等，而生产菌株主要依靠传统的诱变育种方法获得。
[0006] 利用基因工程构建高产谷胱甘肽工程菌，主要有两种途径：
[0007] (1)将谷胱甘肽合成途径中的将谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHI)和谷胱 甘肽合成酶（GSHII)在宿主细胞中过量表达。在大肠杆菌中过量表达大肠杆菌的 GSHA和GSHB，重组菌JM109(pVB303)谷胱甘肽的合成量达到34. 8mg/g湿菌体（Liao XY,Shenff,ChenJ,etal.Improvedglutathioneproductionbygeneexpressionin Escherichiacoli.LettApplMicrobiol，2006, 43 (2) :211-214.);在巴斯德毕赤酵母的基 因工程改造中，中国专利申请号201110343872.4公开了来源大肠杆菌的GSHA和GSHB在 巴斯德毕赤酵母组成型启动子GAP下过量表达，与对照菌株相比提高了谷胱甘肽的合成量。 来源酿酒酵母的GSHI和GSHII在重组毕赤酵母GS115 (pAGPZHGSH)表达并进行高密度发 酵，GSH的产量达到 4. 15g/L(FeiLW，YangY,ChenSX.Improvedglutathioneproduction bygeneexpressioninPichiapastoris.BioprocessBiosystENG, 2009, 32:729-735)〇 中国专利申请号200710036487. 9、200810039695. 9和200910176777. 2的专利也分别公开 了酿酒酵母的GSHI和GSHII在重组毕赤酵母中过量表达来提高GSH的合成量，与对照菌 株相比提高了GSH的表达量；在酿酒酵母的基因改造中，过量表达自身的GSHI和GSHII， 在摇瓶条件下GSH产量达 5. 4mg/l/0D，而对照组为 1. 83mg/l/0D(KiriyamaK,HaraKY,Kondo A.ExtracellularglutathionefermentationusingengineeredSaccharomyces cerevisiaeexpressinganovelglutathioneexporter.ApplMicrobiolBiotechn ol，2012,96 (4):1021-1027)。
[0008] (2)将双功能谷胱甘肽合成酶GshF在宿主细胞中过量表达。双功能谷胱甘肽合 成酶GshF同时具有γ时具有γ和GS两个功能域，使两步催化反应更加紧密，其主要来源 有无乳链球菌（Streptococcusagalactiae)、嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus)、 单增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes)、多杀巴斯德菌（Pasteurellamultocida)等。 中国专利申请号201110003488.X公开了对含有嗜热链球菌的谷胱甘肽合成酶GshF的重组 大肠杆菌BL21/PET28a-GshF和JM109pTrc99a-GshF进行诱导表达，在补加三种氨基酸前体 及ATP的条件下，其分批发酵GSH产量为4. 5g/L。同样中国专利申请号201110369992. 1公 开了单增李斯特氏菌的GshF在巴斯德毕赤酵母中的表达，重组菌在摇瓶条件下GSH产量为 190mg/L，为野生型的4倍多。
[0009] 上述文献、专利所报道的高产谷胱甘肽工程菌，均是通过过量表达谷胱甘肽合成 相关酶来提高GSH合成量，其中GSHA或GSHI由于GSH的反馈抑制，其&约为3mM，使得 GSH产量不会很高，尽管双功能谷胱甘肽合成酶能一步合成GSH，但GSH对来源单增李斯特 菌的GshF的抑制常数&为5mM，依然受GSH反馈抑制。解除GSH对谷胱甘肽合成酶的反馈 抑制是提高谷胱甘肽产量的重要途径，来源无乳链球菌的GshF对GSH的反馈抑制不敏感， 其心约140mM，但其对L-谷氨酸的KJ直为22mM。本发明通过易错PCR突变来源无乳链球 菌的谷胱甘肽合成酶基因gshF，利用高通量的筛选方法获得Km降低，催化效率提高的突变 体，并用于构建谷胱甘肽高产菌株。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种无乳链球菌的gshF基因的突 变基因及其应用。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种无乳链球菌的gshF基因的突变 基因，所述突变基因为gshFMl、gshFM2或gshFM3,所述gshFMl的核苷酸序列为SEQIDN0 : 1、所述gshFM2的核苷酸序列为SEQIDNO:2,所述gshFM3的核苷酸序列为SEQIDNO:3。
[0012] -种由上述突变基因编码的谷胱甘肽合成酶突变体所述谷胱甘肽合成酶突变体 为GshFMl、GshFM2或GshFM3,所述GshFMl由突变基因gshFMl编码，其氨基酸序列如SEQ IDN0 :4所示，所述GshFM2由突变基因gshFM2编码，其氨基酸序列如SEQIDN0 :5所示， 所述GshFM3由突变基因gshFM3编码，其氨基酸序列如SEQIDN0 :6所示。
[0013] -种谷胱甘肽合成酶突变体的合成方法，根据突变基因（gshFMl、gshFM2或 gshFM3)的核苷酸序列设计上游引物和下游引物，利用PCR扩增的方法获得扩增产物，并将 扩增产物与表达载体pET-28a(+)相连后，转化到大肠杆菌BL21宿主细胞中，经诱导表达后 获得谷胱甘肽合成酶突变体；所述突变基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或 SEQIDNO:3。
[0014] 进一步地，所述上游引物的序列为SEQ ID NO: 7,下游引物的序列为SEQ ID NO:8。
[0015] -种突变基因的应用，所述应用为：将突变基因用于制备毕赤酵母工程菌、酿酒酵 母工程菌。
[0016] 进一步地，将突变基因用于制备毕赤酵母工程菌，具体为：将权利1所述的突变基 因（gshFMl、gshFM2或gshFM3)与pGAPZA毕赤酵母表达载体相连接，得到重组质粒，将重组 质粒利用内切酶AvrII酶切线性化，导入巴斯德毕赤酵母菌GS115,得到表达权利2所述的 毕赤酵母工程菌。
[0017] 进一步地，将突变基因用于制备酿酒酵母基因工程菌，具体为：根据突变基因 (gshFMl、gshFM2或gshFM3)的核苷酸序列设计上游引物和下游引物，利用PCR扩增的方法 获得PCR扩增产物；将酿酒酵母启动子TEF1P、终止子TEF1T、Ecorl线性化载体pRS426与 PCR扩增产物共同转化酿酒酵母By4741，利用酿酒酵母By4741自身重组系统得到重组质 粒，并得到表达权利2所述谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母工程菌，所述谷胱甘肽合成酶突变 基因选自gshFMl、gshFM2 或gshFM3。