一种鸡油菌的dna条形码标准基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种鸡油菌的DNA条形码标准基因及其应 用。
【背景技术】
[0002] 鸡油菌复合种(SkwiAsreUiAs·ciAariiA?speciescomplex(CCSC)是全球最重要 的野生食用菌之一，是一种食药兼用的珍稀物种，为全球六大菌根食用菌之一。在云南又 名黄丝菌、黄花蘑、黄菌、黄食菌、杏菌、蛋黄菌、鸡蛋黄、伏菌子等。全球鸡油菌类群的产值 每年超过10亿美元。云南是鸡油菌的一个重要产地，然而在需求的促进下，即使在鸡油菌 收获旺季，新鲜的鸡油菌子实体价格也高达250元/kg。近年来由于生境破坏严重，野生菌 的过度采摘现象越来越严重，人工培育技术尚未建立，导致市场供应量降低，鸡油菌市场上 不良商贩以次充好、以假充真的现象屡见不鲜。另一方面，由于对鸡油菌资源缺乏系统的认 知，国内外市场销售种类鱼目混杂，优劣不等，导致低价出口，实际价值未能真实体现。不仅 如此，由于公众缺乏对鸡油菌的鉴别能力，食用毒蘑菇导致死亡的事件时有发生。由于形态 结构极为相近，且鸡油菌子实体颜色变化上具有很强的连续性，因此仅依靠形态进行的物 种划分具有了较强的人为性。目前，暂以鸡油菌复合种（CCSC)来定义那些形态上难以区分 的物种，CCSC包含以下的 21 个种：CCtewi/iiArix,C C. ferruginascens, C. ame thys teus, C. lewisii，C· lateritius，C· confluens，C. spectaculus，C. roseocanus，C. flavus，C. phasmatis，C· Isabel linus, C. tomentosus，C. avellaneus，C. tabernensis，C. appalachiensis，C. decolorans，C· tere/Lsis, 和eiAariiAs。其中 这个种就是我们常吃的 鸡油菌，具有较高的食用、药用价值以及经济价值，并在维持和保护森林生态多样性中具有 重要作用。但由于鸡油菌复合种外部形态特征变异较大，而可用的显微特征不多，这对区分 不同的种带来一定的困难，尤其要将CciAarii/s与复合种内另外二十个近缘种区分开来 更加困难。因此，急需建立其分子鉴定方法，通过形态型划分与分子数据分析相结合的方法 来解决其鉴别和分类问题，并通过这些分子数据研究其遗传多样性，为其种质资源的保护 和利用提供科学依据。
【发明内容】
[0003] 为克服形态学鉴定鸡油菌存在的缺陷，本发明提供了鸡油菌分子鉴定的标准基因 序列及鉴定方法，可以快速准确地将该物种从易混淆物种或复合种中鉴定出来，为鸡油菌 的种质资源挖掘、保护和利用提供有力的研究工具。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 一种鸡油菌的DNA条形码标准基因，所述DNA条形码标准基因序列SEQIDNO. 1 :GAGAGGAGCGACTAAGGTGCACCTCACTGCACCCATGTCTATACATCACCTCTCTGCTTGCTTATAGAATT TATTATGTCTGGCGTGGTTCACTTGCGCCATCCGTCTATCATCCACCATCATGGTCATTGCCCATATACTGACTAC TCATTTCTCTATGTTACCGTGGTCGAAAACTCGCAATAGTCGGATCATGCTTTCATTGAACGTCTCAAACATATACG TGATGTCAAGGTTCGAATGGCAAAGGTCCACGACCACTGCAAGGGCAAGATGATTTGTGACGCCACCGAGCCGGAGC TTGACGGTGATGGCCAGCCTTTGCCAGTTCTGGATGCGTTAACAAAGATTGGTTGTGGTCACGTTCAACCCTCGATC CGTAAAGAAGGTTTGAAATTATTTATGGTGTATAAGAAGTCAAAAGATGAGGATGAGCAGGTGTGTGCCCTGCCTCC TTTTTTTTCAAGTATGATCGACCTGTGTTGCAGGACATGCGATTGGCCTTGCCAGACAAGCGCCTGTTCACGGCTTT GGAGGTCTACAACAACTTGCGCAAGATATCCGATGAACATCTTGAGCTTATGGGGTTATCTGTGGAATATGCTCGAC CTGAATGGATGATACTTACTG〇
[0005] 应用所述的标准基因进行分子鉴定的方法，包括以下4个步骤： (1)从样品组织中分离提取基因组DNA; ⑵以步骤（1)所提取的基因组DNA为模板，用鸡油菌RPB1特异性引物，进行聚合酶 链式反应； (3) 对步骤（2)扩增得到的DNA产物进行测序； (4) 将测序结果进行手工拼接，与所述基因序列RPB1的进行同源性比对，若同源性在 99%以上，即可将该样品鉴定为鸡油菌（(SkwiAareWiAs·ciAariiA?)。
[0006] 进一步，所述RPB1特异性引物序列为： 正向引物RPB1-S5' -TTTGGGCGGTGAGGACTA-3'， 反向引物RPB1-A5'-GTGGGACGGGTAAGACAG-3' ； 进一步，所述聚合酶链式反应中，其扩增条件为95°C预变性3min，接下来94°C变性 30s，50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共进行30-35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0007] (1)根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法，确保条带的纯度及可靠性。测 序结果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的鸡油菌样品提取基 因组DNA，利用引物进行聚合酶链式反应（PCR)扩增出样品的RPB1基因，将扩增产物测序后 分析比对，优选SEQIDNO. 1引物序列扩增样品的RPB1基因序列片段作为标准基因。为了 实现上述目的，一种用于鸡油菌分子鉴定标准检测基因如下所述的基因序列SEQIDNO. 1 : GAGAGGAGCGACTAAGGTGCACCTCACTGCACCCATGTCTATACATCACCTCTCTGCTTGCTTATAGAATT TATTATGTCTGGCGTGGTTCACTTGCGCCATCCGTCTATCATCCACCATCATGGTCATTGCCCATATACTGACTAC TCATTTCTCTATGTTACCGTGGTCGAAAACTCGCAATAGTCGGATCATGCTTTCATTGAACGTCTCAAACATATACG TGATGTCAAGGTTCGAATGGCAAAGGTCCACGACCACTGCAAGGGCAAGATGATTTGTGACGCCACCGAGCCGGAGC TTGACGGTGATGGCCAGCCTTTGCCAGTTCTGGATGCGTTAACAAAGATTGGTTGTGGTCACGTTCAACCCTCGATC CGTAAAGAAGGTTTGAAATTATTTATGGTGTATAAGAAGTCAAAAGATGAGGATGAGCAGGTGTGTGCCCTGCCTCC TTTTTTTTCAAGTATGATCGACCTGTGTTGCAGGACATGCGATTGGCCTTGCCAGACAAGCGCCTGTTCACGGCTTT GGAGGTCTACAACAACTTGCGCAAGATATCCGATGAACATCTTGAGCTTATGGGGTTATCTGTGGAATATGCTCGAC CTGAATGGATGATACTTACTG。
[0008] (2)样品的鉴别：通过将待鉴别的样品序列与标准基因进行比对，基于同源性和基 于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种，获得序列间的相似性，相似度最高 或匹配度最高或遗传距离最近的对应物种即为待鉴别的物种；具体如下： a.基于同源性鉴定规则来鉴别物种 根据测序结果，如果与所述基因序列SEQIDNO. 1的同源性在99%以上，即可判断所述 的待测样品为鸡油菌（CciAarii/6·)。
[0009] b.基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种 将标准基因序列和待