人源蛋氨酸亚砜还原酶a表达基因、载体、菌株及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的表达基因、 载体、菌株及方法。
【背景技术】
[0002] 蛋氨酸亚讽还原酶（methoninesulfoxidereductase，Msr)是目前发现的唯一可 在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残疾氧化结构变化和功能损失的抗氧化酶系统。MsrA存 在于所有已知的真核细胞、真细菌及大部分古细菌中，说明它对于细胞生命至关重要。这种 酶能够保护细胞免受氧化应激，同时有证据表明它能延缓衰老进程及神经退行性疾病的恶 化。原因有二：其一，它能修复由于蛋氨酸氧化而失活的蛋白质；其二，它能通过逆转蛋白 质中蛋氨酸氧化/还原来清除活性氧。
[0003] 蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)是一种很好的抗氧化酶和蛋白修复酶，在体内扮演多 种角色，与多种疾病和皮肤衰老密切相关，如：白内障、白癜风、光老化等等。蛋氨酸亚砜还 原酶A，具有对抗这类疾病有潜力。另外，蛋氨酸亚砜还原酶A还可以像S0D-样添加到化 妆品、保健品和药品当中，因此具有非常好的应用前景。
[0004] 目前能大量生产的蛋氨酸亚砜还原酶A为鼠源性蛋氨酸亚砜还原酶A，如基于比 色法检测蛋氨酸亚砜还原酶活性新方法的建立及应用一文，含有鼠源性MsrA(rMsrA)表达 序列的重组质粒连接到PET-32a载体，使用平板培养筛选出转染成功的菌落，扩增并诱导 大量表达，提取重组蛋白，并采用Ni-层析柱纯化得到融合蛋白。使用轻链肠激酶酶切处 理后再次过柱纯化，得到纯化的基因重组TAT-MsrA酶，可以用于大量表达目的蛋白。此方 法得到的MsrA重组蛋白纯度高达92%，抗原活性显示阳性反应。
[0005] 人源蛋氨酸亚砜还原酶A虽然在人体应用上，具有更优秀的生物效应以及更小的 副作用，而人源性的蛋氨酸亚砜还原酶A，尚无法在体外大量表达，从而大量生产。因此亟 需一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达系统，从而工业化大量生产人源蛋氨酸亚砜还原酶 A蛋白。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶 A的表达基因、载体、菌株及方法，其目的在于通过对人蛋氨酸亚砜还原酶A基因的修饰和 优化，配合适合的表达系统和表达条件，实现人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的体外大量表 达，由此解决人源性蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白无法体外大量表达的技术问题。
[0007] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A 的表达基因，所述人蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因为：
[0008] (1)由SEQNO. 1所示的DNA序列编码的基因；
[0009](2)由SEQNO. 1所示的DNA序列经增加、缺失或替换一个或多个密码子具有同等 活性的由（1)衍生的DNA序列编码的基因。
[0010] 按照本发明的另一方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体，所述 载体包含如权利要求1所述的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因。
[0011] 按照本发明的另一方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株，所述 菌株含有如权利要求2所述的蛋氨酸亚砜还原酶A表达载体。
[0012] 按照本发明的另一方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的制备方法，包括 以下步骤：
[0013] (1)菌株培养：将如权利要求3所述的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大 培养，直至0D在0. 5至0. 7之间；
[0014] ⑵诱导表达：将步骤⑴中培养的菌株，在以下条件下培养3小时至6小时获得 诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在20°C至30°C之间，异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷浓度在0. 2mM至0. 5mM之间，摇床转速在150rpm至220rpm之间；
[0015] (3)超声破碎：采用超声波脉冲破碎步骤（2)获得的诱导表达菌株获得破碎液；
[0016] (4)蛋白提纯：将步骤（3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜 还原酶A。
[0017] 优选地，所述制备方法，其步骤（3)的破碎条件如下：破碎脉冲持续3至5秒，间隔 3至5秒，超声脉冲破碎20分钟至45分钟。
[0018] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于对人源蛋氨 酸亚砜还原酶A的表达基因序列从信号肽序列、偏好密码子、GC含量、mRNA二级结构方面进 行优化调整，并配合相应的载体和表达菌株，能够取得在体外通过细菌培养工业化批量生 产人源蛋氨酸亚砜还原酶A的有益效果。
【附图说明】
[0019] 图1是实施例2的蛋白凝胶电泳照片，其中图1A是TAT-hMsrA-6P、TAT-hMsrA-28a 在Rosetta(DE3)中测试表达图，图 1B是TAT-hMsrA-6P、TAT-hMsrA-28a在BL21 (DE3)中测 试表达图；
[0020] 图2是实施例3的蛋白凝胶电泳照片，其中图2A是TAT-hMsrA-6PBL21 (DE3)大 量表达后纯化浓缩的图片，图2B是TAT-hMsrA-28aBL21 (DE3)大量表达后纯化浓缩的图片
[0021] 图3是实施例4的蛋白凝胶电泳照片，TAT-hMsrA-28aBL21 (DE3)在异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0. 5mM时，不同温度诱导情况下上清和包涵体蛋白电泳图 片。
[0022] 图4是实施例5的蛋白凝胶电泳图片，其中图4A是TAT-hMsrA-28aBL21 (DE3)在 20°C诱导温度下、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0. 2mM时的纯化图片，图4B是浓缩后 的电泳图片。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0024] 本发明提供的人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因为：
[0025] (1)由SEQNO. 1所示的DNA序列编码的基因；
[0026] (2)由SEQNO. 1所示的DNA序列经增加、缺失或替换一个或多个密码子具有同等 活性的由（1)衍生的DNA序列编码的基因。
[0027] 所述基因为于N端添加了穿膜肽序列全长hMsrA序列，经剪切修饰以及从成熟序 列的大肠杆菌稀有密码子、GC含量和mRNA的二级结构方面进行优化后的序列。该基因能 在原核生物，例如大肠杆菌中表达重组的人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白，具有穿膜效果，能 有效促进皮肤对该蛋白的吸收，并经实验验证，具备生物学活性。
[0028] 为大量表达本发明提供的人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因，本发明还提供了 所述基因的配套表达系统。所述系统包含用于构建重组菌株的表达载体及用于大量表达的 菌株。
[0029] 所述人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体，包含本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶 A的表达基因，并带有tac启动子或T7启动子，优选pGEX-6P-l载体或pET-28a载体。
[0030]PGEX-6P-1载体，带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达，可提高目的蛋白 的表达量；载体上的GST是一个尚度可溶的蛋白，可提尚外源蛋白的可溶性表达，而且GST 标签可用PreScission?蛋白酶从融合产物中切除。pET-28a是T7启动子，也可实现化学 诱导的高水平表达，Histag只有6个His，约0.84KD，分子量很小一般不影响目标蛋白的 功能，易表达出有活性的蛋白。
[0031] 所述人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株，为大肠杆菌，含有本发明提供的蛋氨 酸亚砜还原酶A表达载体。优选采用BL21(DE3)和Rosetta(DE3)菌株。BL21(DE3)是 Ion蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型，可以保持蛋白的稳定不被降解，适合T7启动子的载体； Rosetta(DE3)系列是来自BL211acYl，它含有大肠杆菌（Escherichiacoli)稀有的密码子 tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA，可降低外源蛋白稀有密码子对表达的影响，适合 T7启动子的载体。
[0032] 利用本发明提供的人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因及系统，表达人源蛋氨酸 亚砜还原酶A蛋白的方法，包括以下步骤：
[0033] (1)菌株培养：将本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，直 至0D在0. 5至0. 7之间，优选培养至0D值为0. 6 ;
[0034] (2)诱导表达：将步骤⑴中培养的菌株，在以下条件下培养3小时至6小时获得 诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在20°C至30°C之间，异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷浓度在0. 2mM至0. 5mM之间，摇床转速在150rpm至220rpm之间；
[0035] (3)超声破碎：采用超声波脉冲破碎步骤（2)获得的诱导表达菌株获得破碎液，破 碎条件如下：破碎脉冲持续3至5秒，间隔3至5秒，超声脉冲破碎20分钟至45分钟；
[0036] (4)蛋白提纯：将步骤（3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜 还原酶A。
[0037] 以下为实施例：
[0038] 实施例1人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体构建
[0039] 选择PGEX-6P-1载体和pET_28a载体，载体由武汉华美生物科技有限公司提供。
[0040] 1、将目的基因构建到PGEX-6P-1和pET-28a载体上，根据SEQNo. 1序列设计引 物：
[0041]F:CCGGAATTCGGCTATGGTCGCAAAAAACGT，
[0042]R:CCGCTCGAGTTATTTTTTGATACCAACCGGACA。
[0043]两种载体设计的引物相同，分别进行PCR扩增，50ul体系，质粒模版lul，上下游引 物各lul，10XPfuBuffer5ul，dNTPmixture(10mM)lul
[0044]PfuDNA酶（2. 5u/ul) 0· 5ul，用ddH20 补足体积到 50ul。PCR反应条件为： 94°C5min;94°Clmin，55°Clmin，72°Clmin，35 个循环；72°ClOmin。反应结束后取 5yL PCR产物用lOg/L琼脂糖凝胶电泳观察，结果显示出1条大小约为700bp的特异带。
[0045] 2、双