专利名称：利用酶拆分法制备l-硒代蛋氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸的生物拆分方法，尤其是涉及一种利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法。
背景技术：
硒是人体必需的微量元素之一，它是人体红细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH--Px)的组成成份，它主要的作用是参与酶的合成，保护细胞膜的结构及其功能，免遭过度氧化损害和干扰的重要物质，研究表明缺硒会引起人类很多疾病，如贫血、冠心病、大骨节病、克山病及糖尿病等。而适量补硒具有增强机体免疫功能和抗癌、防癌、保护心脏、延缓衰老的作用。科学研究发现，人体对硒的正常摄入量为40—240Mg/kg. d，硒主要来源于与人类生活息息相关的生物样品，如大蒜、枸杞、紫菜、肉、蛋、鱼类等。无论是植物性或动物性食物，其中所含有的硒都来自于土壤，所以人是否缺硒主要取决于所生活的区域土壤中的含硒量，而我国存在一条东北至西南走向的低硒带，在该地区种植的食物中硒含量较低，远远达不到人体的需要，所以生活在该地区的人群必须靠补充硒来满足体内的营养需要。目前采用的补硒产品主要是无机亚硒酸钠强化的食品及保健品，如亚硒酸钠片、富硒食盐、硒宝康、黄金搭档等，均含无机硒化物。实验证明l.无机硒对人的毒性较有机硒大，生物利用率也远低于有机硒化物。2.过量的硒对机体有一定的毒害，毒性的大小与其化学形态有关。而人体从生物样品中摄入的硒主要是以硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸形式存在的，属于有机硒化合物。氨基酸由于有手性中心而具有不同的构型。不同构型的硒代氨基酸其生理活性和生物可利用性存在很大差异。通常只有L-构型的硒代氨基酸能被人体组织所利用，而对于D-构型或消旋的硒代氨基酸则会对人体产生较大的危害。目前通过化学合成法制备的硒代氨基酸一般为DL-外消旋型的化合物，要作为食品、饲料的添加剂及医药应用皆要求L-氨基酸，所以必须对化学合成的DL-氨基酸进行光学拆分。目前常用的拆分方法有化学拆分法和生物拆分法等，化学拆分法合适的拆分剂难寻且成本高、拆分过程须用大量的有机溶剂及化工原料、生产周期长、毒副作用大、工业生产受限制；生物拆分法以酶为拆分剂、生产工艺简单、反应条件温和、无公害、对环境污染小、完全能适合工业化生产。氨基酸的生物拆分法以氨基酰化酶(E. C. 3. 5. 1. 14)为酶源是尤其有效的，该酶存在于各种动物、植物器官以及微生物细胞内或发酵液中，是生物体进行氨基酸代谢过程中的一种重要的水解酶、活性高、来源广、易得到、生产成本低，用于大规模氨基酸拆分方面已被大量报道，但在DL-硒代蛋氨酸拆分方面的应用国内外尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用化学合成的DL-硒代蛋氨酸为原料，利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步骤第一步氨基酰化酶的制备
将新鲜动物内脏100重量份切除内膜洗净，加入pH7. 0冷冻0-5'C的磷酸盐缓冲溶液100重量份，置于捣碎机中打碎成细桨，再加入冷冻0-5-C磷酸盐缓冲溶液150重量份，在0-5'C下，搅拌浸取30-40min，将浸取混合液置于冷冻离心机中，0-5'C条件下离心分离30min后，取上清液在相同条件下再重复离心分离两次，取最后得到的上清液慢慢加入碾细的固体(NH4) 504至30-50%饱和，在0-5'C下搅拌使其均匀后，置于冰箱中0-5""C放置过夜，将上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷冻离心机中，在温度0-5'C条件下，离心沉降得盐析沉降物，将其装入透析袋并放入去离子水中，于0-5'C透析12-24h，用BaCl2检验透析液无S(V2—离子时，透析完毕；将透析后的酶液冷冻离心除去杂蛋白后，用PH7.0磷酸盐缓冲液稀释，在0--4'C条件下保存于冰箱中备用；
第二步N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸的制备取NaOH和Na2C03按照2:5-6重量份的比例添加到60份水中配成缓冲液，将20重量份的DL-硒代蛋氨酸搅拌加入使之溶解，冷却到2(TC以下，缓慢滴加乙酸酐14-15重量份，继续搅拌2小时后，用茚三酮显色呈阴性即可；然后用浓HC1调溶液pHl-2，密封后放置20小时析出淡黄色结晶，经抽滤、去离子水洗涤，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；
第三步L-硒代蛋氨酸的制备
a、 拆分取第二步中所得的N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸18-20重量份，用去离子水400重量份稀释，用6 mol/LNaOH调节pH7. 0-8.0,加入2重量份的0. lmol/LCoCl2溶液，再加入氨基酰化酶，酶用量为700U/mraol底物，在20_40°C下，保温40-110h，然后用乙酸中和至pH5-6，加入活性炭脱色，于80-85'C加热搅拌后，过滤除去活性炭，将滤液减压蒸发至干，得N-乙酰-D-硒代蛋氮酸与L-硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液待用，剩余物为L-硒代蛋氨酸粗品；
b、 精制将上述所得L-硒代蛋氨酸粗品溶于80-9(TC热水中，用HC1调pH5， 5-6.0，加入l-4g/L活性炭处理，热滤，滤液冷却至室温，再滴加乙醇至出现白色混浊为止，于0-6'C放置数小时结晶，抽滤，即得精制的L-硒代蛋氨酸
精品o
本发明的优点在于采用化学合成的DL-硒代蛋氨酸为原料，经乙酰化后，利用从动物肾脏(如牛、猪)中提取的氨基酰化酶的立体专一性地去乙酰化，从而达到拆分DL-硒代蛋氨酸制备L-硒代蛋氨酸的目的。
具体实施例方式
本发明所述的利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步骤第一步氨基酰化酶的制备
将新鲜动物内脏100g切除内膜洗净，加入100mlpH7. 0冷冻0-5'C的磷酸盐缓冲溶液，置于捣碎机中打碎成细浆，再加入冷冻0-5。C磷酸盐缓冲溶液150ml，
6在0-5'C下，搅拌浸取30-40min，将浸取混合液置于冷冻离心机中，于转速4500rpm，温度0-5'C条件下离心分离30min后，取出上清液在相同冷冻离心条件下再重复操作两次，取最后得到的上清液慢慢加入碾细的固体(MU 2S04至30-50%饱和，在0-5'C条件下搅拌0.5h使其均匀后，置于冰箱中在0-5-C条件下放置过夜，将上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷冻离心机中，于转速4500rpm，温度0-5'C条件下，离心沉降45min后得盐析沉降物，将其装入透析袋并放入去离子水中，于0-5'C透析12-24h，在其间经常更换去离子水，并用BaCl2检验透析液无S0/—离子时，透析完毕；将透析后所得的酶液冷冻离心除去杂蛋白后，用pH7. 0磷酸盐缓冲液稀释，在0—4'C条件下保存于冰箱中备用，经测定，酶活力为16000 u/ml;
第二步N-乙酰-DL-硒代蛋氮酸的制备
将2. Og(O. 05mol)NaOH和5. 3g (0. 05mol)勛2(:03与60mlH20中配成的缓冲液加到反应瓶中，搅拌下加入DL-硒代蛋氨酸20g使之溶解，冷却到2(TC以下，缓慢滴加乙酸酐14. 3ml，约1. 5h滴完，继续搅拌2h后，用茚三酮显色呈阴性说明a -氨基已全部乙酰化；然后用浓HC1调溶液pHl-2，密封后于冰箱在小于5'C条件中放置20h析出淡黄色结晶，经抽滤、0-5'C冰冷的去离子水洗涤，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品20.0g， m.p.126-128°C，产率为82. 4%;
第三步L-硒代蛋氨酸的制备
a、拆分取第二步中所得的N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸19g (0.08mol)，加入去离子水400ml稀释，用6 mol/LNaOH调节PH7. 0-8. 0，加入0. lmol/LCoCl2溶液2ml，再加入氨基酰化酶，酶用量为700U/mmol底物，在20-40。C条件下，保温40-110h，然后用乙酸中和至PH5-6，以停止酶的活力，再加入活性炭脱色，于80-85'C加热搅拌0.5h后，过滤除去活性炭，将滤液减压蒸发至干，得N-乙酰-D-硒代蛋氨酸与L-硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液(含N-乙酰-D-硒代蛋氨酸的乙酸乙酯提取液)待用，剩余物为L-硒代蛋氨酸粗n
b、精制将上述所得L-硒代蛋氨酸粗品溶于80-90'C热水中，用HC1调pH5. 5-6.0，加入1-4g/L活性炭处理0. 5h，热滤，滤液冷却至室温，再滴加乙醇至出现白色混浊为止，于0-6'C放置数小时结晶，抽滤，即得精制的L-硒代蛋氨酸精品6. 7g，产率为85%, m. p. 264-265。C， [ a ]D12= +18. 2 (C二l， lmol/L HC1)。
D-硒代蛋氨酸的消旋化将第三步a中所得的拆分后含N-乙酰-D-硒代蛋氮酸的乙酸乙酯提取液减压浓縮，升温100-130'C，以3ml/min的速度滴加一定量的醋酐，反应时间20min ，后冷却到室温，加HCl调pH2.5，浓縮后，入冰箱中在0-5-C条件下结晶，得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸，收率为71.鄉，供制备L-硒代蛋氨酸拆分用。
利用氨基酰化酶对DL-硒代蛋氨酸进行光学拆分是一种十分有效的方法，反应条件温和，分离纯化方便，产品光学纯度高，可以对化学合成的多种氨基酸进行光学拆分，同时可以制得D-型和L-型两种光学活性产物。该方法克服了生物发酵法和不对称合成法制备L-硒代蛋氨酸收率低、生产成本高的缺点，而且该方法使用的酶活性高、来源广、易得到，对大规模生产十分有利，可作为对化学合成新型氨基酸进行光学拆分的一种新途径。
权利要求
1、一种利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法，其特征在于它包括下述步骤第一步氨基酰化酶的制备将新鲜动物内脏100重量份切除内膜洗净，加入pH7.0冷冻0-5℃的磷酸盐缓冲溶液100重量份，置于捣碎机中打碎成细浆，再加入冷冻0-5℃磷酸盐缓冲溶液150重量份，在0-5℃下，搅拌浸取30-40min，将浸取混合液置于冷冻离心机中，0-5℃条件下离心分离30min后，取上清液在相同条件下再重复离心分离两次，取最后得到的上清液慢慢加入碾细的固体(NH4)2SO4至30-50％饱和，在0-5℃下搅拌使其均匀后，置于冰箱中0-5℃放置过夜，将上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷冻离心机中，在温度0-5℃条件下，离心沉降得盐析沉降物，将其装入透析袋并放入去离子水中，于0-5℃透析12-24h，用BaCl2检验透析液无SO4-2-离子时，透析完毕；将透析后的酶液冷冻离心除去杂蛋白后，用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释，在0--4℃条件下保存于冰箱中备用；第二步N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸的制备取NaOH和Na2CO3按照2∶5-6重量份的比例添加到60份水中配成缓冲液，将20重量份的DL-硒代蛋氨酸搅拌加入使之溶解，冷却到20℃以下，缓慢滴加乙酸酐14-15重量份，继续搅拌2小时后，用茚三酮显色呈阴性即可；然后用浓HCl调溶液pH1-2，密封后放置20小时析出淡黄色结晶，经抽滤、去离子水洗涤，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；第三步L-硒代蛋氨酸的制备a、拆分取第二步中所得的N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸18-20重量份，用去离子水400重量份稀释，用6mol/LNaOH调节pH7.0-8.0，加入2重量份的0.1mol/LCoCl2溶液，再加入氨基酰化酶，酶用量为700U/mmol底物，在20-40℃下，保温40-110h，然后用乙酸中和至pH5-6，加入活性炭脱色，于80-85℃加热搅拌后，过滤除去活性炭，将滤液减压蒸发至干，得N-乙酰-D-硒代蛋氨酸与L-硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液待用，剩余物为L-硒代蛋氨酸粗品；b、精制将上述所得L-硒代蛋氨酸粗品溶于80-90℃热水中，用HCl调pH5.5-6.0，加入1-4g/L活性炭处理，热滤，滤液冷却至室温，再滴加乙醇至出现白色混浊为止，于0-6℃放置数小时结晶，抽滤，即得精制的L-硒代蛋氨酸精品。
全文摘要
本发明公开了一种利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步骤1.将新鲜动物内脏加磷酸盐缓冲液打碎、分离，沉淀物离心沉降透析后用磷酸盐溶液稀释为氨基酰化酶备用；2.取NaOH和Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>加水配成缓冲液，将DL-硒代蛋氨酸搅拌加入使之溶解，滴加乙酸酐调整为阴性，用浓HCl调溶液pH1-2，密封放置析出淡黄色结晶，抽滤、去离子水洗涤，用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；3.将N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸用去离子水稀释，NaOH调节，加入CoCl<sub>2</sub>溶液和氨基酰化酶后用乙酸中和、活性炭脱色后，滤液蒸发至干，用乙酸乙酯提取得L-硒代蛋氨酸粗品，精制后即得L-硒代蛋氨酸精品。
文档编号C12P13/00GK101671704SQ200910172259
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者王小松 申请人:王小松;姚永强