TG' - 3
[0036] 上下游引物分别设计了Bglll和BamHI酶切位点，用含有酶切位点的引物扩增gfp 基因序列，并将PCR产物与pMD18-T载体混合，用T4DNA Ligase (TaKaRa)过夜连接。
[0037] 将连接产物转入Trans 109大肠杆菌感受态细胞内，并涂布氨节青霉素抗性平板。
[0038] 通过菌落PCR筛选含有重组质粒pMD18 -T-GFP的阳性克隆，挑取阳性克隆，在氨 苄青霉素浓度为50μg/mL的LB培养基中培养10小时并提取其质粒。
[0039] 所述的gfp基因序列PCR扩增的条件为：95°C预变性3min;94°C变性40s，60°C退 火30s，72°C延伸lmin;30个循环后，72°C终延伸lOmin。
[0040] 所述的菌落PCR条件为：95°C预变性3min;94°C变性40s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin;30个循环后，72°C终延伸lOmin。 实施例2
[0041]pHIS1525 -GFP载体的构建
[0042]提取质粒pHIS1525和pMD18 - T - GFP，用Bglll和BamHI分别对两种质粒进行双 酶切，回收酶切产物，用T4DNA Ligase (TaKaRa)过夜连接。
[0043] 将连接产物转入DH5a大肠杆菌感受态细胞内，并涂布氨苄青霉素抗性平板。
[0044] 通过菌落PCR筛选含有重组质粒pHIS1525-GFP的阳性克隆，挑取阳性克隆，在氨 苄青霉素浓度为50μg/mL的LB培养基中培养10小时并提取其质粒。
[0045] 所述的菌落PCR条件为：95°C预变性3min;94°C变性40s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin;30个循环后，72°C终延伸lOmin。 实施例3
[0046] 巨大芽孢杆菌NCT- 2原生质体的制备与转化
[0047] 所述的巨大芽孢杆菌具体为：BacillusmegateriumNCT- 2,分离自上海市崇 明岛设施栽培12 - 15年的大棚，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101， 保藏编号为CGMCCNo. 4698。
[0048] 在巨大芽孢杆菌NCT- 2的菌悬液中加入终浓度为0.lmg/mL的溶菌酶和4%的 Tween80,在35°C、200rpm的条件下培养30min后，离心并重悬。
[0049] 将重组质粒pHIS1525加入已制备好的上述原生质体中，再加入PEG6000 -P轻柔 混合，加入培养基后35°C、80rpm培养90min。
[0050] 将上述菌液倒入含有四环素（10mg/L)的抗性LB平板上，35°C培养至有单菌落出 现。
[0051] 通过菌落PCR筛选含有重组质粒pHIS1525 -GFP的阳性克隆，挑取阳性克隆，在四 环素浓度为10μg/mL的LB培养基中培养10小时并提取其质粒。
[0052] 所述的菌落PCR条件为：95°C预变性3min;94°C变性40s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin;30个循环后，72°C终延伸lOmin。 实施例4
[0053] 荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的巨大芽孢杆菌NCT- 2 -GFP
[0054] 取少许重组菌株的菌悬液制成玻片，采用OLYMPUSBX51荧光显微镜观察重组菌株 的荧光，选择WB滤波器，有绿色荧光蛋白表达的菌体清晰可见（图3)。
[0055] 将上述巨大芽孢杆菌NCT - 2 - GFP发酵后施用于待测的土壤中（优选为次生盐渍 化土壤），通过定期观察并计算所述土壤的采样中存活菌体的数量和扩散情况可以实现对 土壤质量的动态监测。
[0056] 上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同 的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所 限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
【主权项】
1. 一种用于±壤次生盐溃化监测的绿色巧光蛋白的表达方法，其特征在于，将奸P基 因连接到大肠杆菌-巨大芽抱杆菌的穿梭质粒抑IS1525上，构建成抑IS1525 -GFP质粒， 转化大肠杆菌，然后提取该质粒，通过原生质体转化方法将重组质粒转入巨大芽抱杆菌 NCT- 2中，获得了表达绿色巧光蛋白的巨大芽抱杆菌菌株NCT- 2 -GFP; 所述的巨大芽抱杆菌NCT- 2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo. 4698。2. 根据权利要求1所述的表达方法，其特征是，所述的原生质体转化方法，具体包括W 下步骤： 1)设计引物GFP-sense和GFP-anti,W绿色巧光蛋白基因序列为模板，进行PCR扩 增，扩增产物与载体PMD18-T连接，将连接产物PMD18-T-GFP转化大肠杆菌Transl09感 受态，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的阳性克隆； 2) 分别提取质粒PMD18 -T-GFP和抑IS1525,同时进行双酶切后回收产物进行连接， 将连接产物转化大肠杆菌D册α感受态，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的阳性 克隆，并进行酶切和测序验证，构建了表达载体PHIS1525 -GFP; 3) 制备巨大芽抱杆菌NCT-2的原生质体，并提取质粒PHIS1525 -GFP，将质粒转化巨大 芽抱杆菌NCT- 2中，通过四环素抗性筛选和巧光显微镜观察来挑选阳性克隆并测序验证， 获得了表达绿色巧光蛋白的巨大芽抱杆菌NCT- 2 -GFP。3. 根据权利要求2所述的表达方法，其特征是，所述的引物为： GFP - sense :5' - GCAGATCTGAATGGTGAGCAAGGGCGAG' - 3 GFP-anti:5' -GGCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG' - 3。4. 根据权利要求2所述的表达方法，其特征是，步骤1)中所述的阳性克隆是指含有质 粒pMD18 -T-GFP的大肠杆菌Transl09。5. 根据权利要求2所述的表达方法，其特征是，所述的双酶切中，位点为Bglll和 BamHI。6. 根据权利要求2所述的表达方法，其特征是，步骤2)中所述的阳性克隆是指含有质 粒抑IS1525 -GFP的大肠杆菌畑5α。7. 根据权利要求2所述的表达方法，其特征是，步骤3)中所述的阳性克隆是指含有质 粒抑IS1525 -GFP的巨大芽抱杆菌NCT- 2。8. -种基于上述任一权利要求中所述的巨大芽抱杆菌菌株NCT- 2 -GFP的应用，其特 征在于，将其发酵后施用于次生盐溃化±壤，W实现对±壤中M)r含量的动态监测。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述的动态监测是指：通过定期观察并计算 所述±壤的采样中存活菌体的数量和扩散情况得W实现。
【专利摘要】一种用于土壤次生盐渍化监测的绿色荧光蛋白的表达及应用方法，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点的绿色荧光蛋白gfp基因序列，将其与pMD18‐T质粒连接，重组质粒与穿梭质粒pHIS1525分别酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α中，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的阳性克隆。提取重组质粒pHIS1525‐GFP，将其转入已制备好的巨大芽孢杆菌NCT‐2原生质体中，转化子能够表达绿色荧光蛋白。将转化菌株接种到次生盐渍化土壤中，通过监测荧光菌株来分析巨大芽孢杆菌NCT‐2在次生盐渍化土壤中的存活情况。本发明具有快速简便且可实时监测的特点，有利于科学有效地指导该菌株菌肥的施用。CGMCC No.469820110321
【IPC分类】C12R1/11, C12N15/75, C12Q1/06, C12N1/21
【公开号】CN105238808
【申请号】CN201510629664
【发明人】周培, 初少华, 张丹, 支月娥, 詹学佳, 毛亮, 王大欣
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年9月29日