一种小麦耐盐基因及其应用的制作方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及耐盐基因及其应用。

背景技术：

土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

目前，利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种小麦耐盐基因和其在植物耐盐性状改良中的应用。

技术方案：一种小麦耐盐基因，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述小麦耐盐基因编码的蛋白。

所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

含有上述基因的植物表达载体。

上述基因在培育抗盐植物中的应用。

上述植物是普通小麦。

上述植物表达载体在培育抗盐植物中的应用。

有益效果：利用植物基因工程技术，本发明克隆得到了小麦耐盐基因，并首次将该基因转入普通小麦中，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高，预示其可广泛用于培育耐盐农作物品种，尤其是在培育耐盐小麦品种中将有重要作用。

附图说明

图1为基因全长cDNA 序列的扩增结果；

图2为转基因小麦阳性系的鉴定图，其中“-”为阴性对照，“+”为阳性对照；

图3为盐胁迫对转基因小麦株系与对照株系根系生长的影响。

具体实施方式

实施例1、耐盐基因的克隆

1.1提取小麦Total RNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2mL的离心管中，每100mg材料约加入1mL的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2mL氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4.4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5mL的离心管中，加入500μL的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min或过夜；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1mL的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积（30-50μL）的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

1.2 cDNA反转录

反转录酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1.12μL体系：Oligo（dT） 1μL

Total RNA 100ng-5μg

dNTP 1μL

DEPC水 补至12μL

2.65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μL

0.1M DTT 2μL

RNase (Invitrogen) 1μL

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μL M-MLV RT，混匀，37℃反应50min；

5.70℃温育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μL RNase H（Invitrogen），37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3 开放阅读框的克隆和序列测定

1．引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物: HKT-B1-F (ATACTTACCAACGAATGGGTTCTC)，HKT-B1-R(GTCTGCTACTAGGTTATACTATCC)，扩增基因的开放阅读框。

2．PCR 反应体系（50μL）：

2×GC bufferⅠ 10μL

模板cDNA 1μL

dNTPs（2.5mM each） 0.5μL

Primer1 (10μM) 1μL

Primer2(10μM) 1μL

LA Taq(TaKaRa) 0.5μL

ddH₂O 加至终体积50μL

3．PCR 反应程序为： 94℃ 预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸2min，循环35 次；72℃延伸7min。

4．扩增片段回收后与pEASY-T1载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由南京金斯瑞公司完成。

实施例2、植物表达载体的构建

利用植物表达载体pGA3626，选用KpnI和BspTI分别对pGA3626 和含有目的基因的pEASY-T1 载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T4 DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

（1）质粒pGA3626空载体和pEASY-T1的KpnI和BspTI双酶切

碱裂解法提取pGA3626 空载体和pEASY-T1 质粒，各取10μg 酶切，酶切体系如下：

KpnI 1μL

BspTI 1μL

pGA3626载体/ pEASY-T1质粒 1~2μL

10×Buffer K 1μL

ddH₂O 补充至 20μL

于30℃恒温水浴锅酶切2 小时以上。双酶切后以1×TAE 为电泳缓冲液，将酶切产

物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pGA3626中14kb 的载体大片段和pEASY-T1 中大约1.5 kb 的目的基因条带，回收该条带。

（2）pGA3626质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

（3）经酶切和脱磷的pGA3626载体片段(约14kb)和pEASY-T1 双酶切回收片段（约1.5kb）以摩尔比1:4 的比例进行16℃连接过夜。

（4）连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/mL 的LB 固体平板上37℃培养16 小时左右。

（5）重组子的鉴定

① 质粒的PCR 验证

挑取单菌落分别接种于5mL 含Kan 的LB 液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR 扩增，体系如下：

PCR 反应条件如下：预变性94℃ 3min，35 个循环为：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR 产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

② 质粒酶切鉴定

提质粒进行KpnI和BspTI 双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例3、转基因小麦的创制、验证和表型鉴定

2.1 转基因小麦的创制

采用合作实验室建立的生长点转化方法（国家发明专利ZL200410075773.2），将构建的植物表达载体转化小麦。

2.2 转基因小麦阳性株系的验证

(1) CTAB法提取基因组DNA。

(2) PCR鉴定阳性植株。

PCR 扩增以转化株系的基因组DNA为模板，引物、PCR 反应体系和反应条件见1.3。验证结果见图2。

2.3 转基因小麦阳性株系的表型鉴定

小麦材料：载体转基因阳性株系和对照普通小麦济南177号。

培养条件：水培法在无菌滤纸上20℃培养2天，然后转移到1/2 Hoagland培养液 (Hoagland and Arnon,1950)中，置于培养室（光周期12小时，光处理与暗处理的温度分别为22℃和20℃，湿度50%，光合有效辐射为300μmol m-2s-1 ），培养液每天更换。

处理条件：小麦幼苗培养至两叶期时，进行空白对照处理、盐处理（50mM NaCl处理第1天，之后NaCl浓度每天递增50mM，一直到200mM），处理时间为7天，鉴定表型，如图3所示，载体转基因阳性株系根系长度、地上部生长情况明显好于对照株系，说明载体转基因可促进小麦的耐盐性，证明该基因可用于小麦等植物的耐盐性改良。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院南京土壤研究所

<120> 一种小麦耐盐基因及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggttctc tgcatgtctc ctgcagtacc actcaacata gcaagcttca gagggtttac 60

caactcctgt ttttccatgt gcacccgttc tggctccatt tcttgtactt tgtaaccatc 120

tccttcttag gtttcgtgat cctgaaagcc ctgcccatga agaccagcat ggtctcgagg 180

cccatagacc ttgacctgat cttcacctcg gtgtcggcca ccacggtgtc gagcatggtg 240

gccgtggaga tggagtcctt ctccaacccc cagctcctac tcctgaccat ccttatgctc 300

ctcggcggcg aggtgttcac cagcatgctt ggcctttact ttacctacat caagtccaag 360

aagaaagaag ccccccatga ccatggtgat ggtggtggca aagtcgaacc agcaccgtct 420

agcctagagc tccctgctac caccttcatg gacgatagca ctgcacagaa ccagatggag 480

caagggttca acaaggagca gccccgatac ggccgagcct tcctcaccag gttgctcctg 540

ttcatagtgc tgggctatca cgtggtggtg cacctcgccg gctactccct gatgctgctc 600

tacctgagcg tcgtctccgg cgcaagggct gtgctcgccg gcaaggggat cagcctgcac 660

accttctccg tattcaccgt cgtctcgaca ttcgccaatg gtggcttcgt gccgaacaac 720

gaagggatgg tcgtcttccg gtccttcccg ggcctcctgc tcctcgtcat gccgcacgtc 780

ctcctcggca acacgctctt ccctgtcttc ctcaggctgg ccatctgggc tctccggagg 840

gtcaccagga ggcccgagct cggccagctg cagagcatcg gctatggtca cctgctgacg 900

agccggcaca cctgcttctt ggctttcacc gtggccacgt tcgtgctggc gcagctgtcg 960

ctcttctgcg ccatggagtg gggctccaac gggctgcacg ggctcaccgc cgcgcagaag 1020

ctcgttgcgg cactgttcat gtcggtcaac tctaggcaca ccggcgagat ggtcgtggac 1080

ctttccacca tgtcgtcagc cgttgtggtg ctctacgtgg tcatgatgta cctaccacct 1140

tacactacat ttctaccagt ggaagacgac agtgaccaac aagtgggagc agatcagcac 1200

caccagaaaa gggtaacaag catatggcgg aagctgctca tgtcgccgct ctcgttcttg 1260

gccatcttca tcgccgtcgt gtgcatcacg gagcggcggc agatctccga tgaccccctc 1320

aacttcaacg tcctcaacat caccgtcgag gttatcagtg cgtacggaaa cgtggggttt 1380

agcaccgggt acagctgtgc ccggcaggtg actgccgacg gcggctgcag ggatacgtgg 1440

gttggcttct ctgggaagtg gagctggcaa gggaagctgg ttctcattgc tgtcatgttc 1500

tacggcagac tcaagaagtt cggcatgcat ggtggcgagg catggaggat agtataa 1557

<210> 2

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Leu His Val Ser Cys Ser Thr Thr Gln His Ser Lys Leu

1 5 10 15

Gln Arg Val Tyr Gln Leu Leu Phe Phe His Val His Pro Phe Trp Leu

20 25 30

His Phe Leu Tyr Phe Val Thr Ile Ser Phe Leu Gly Phe Val Ile Leu

35 40 45

Lys Ala Leu Pro Met Lys Thr Ser Met Val Ser Arg Pro Ile Asp Leu

50 55 60

Asp Leu Ile Phe Thr Ser Val Ser Ala Thr Thr Val Ser Ser Met Val

65 70 75 80

Ala Val Glu Met Glu Ser Phe Ser Asn Pro Gln Leu Leu Leu Leu Thr

85 90 95

Ile Leu Met Leu Leu Gly Gly Glu Val Phe Thr Ser Met Leu Gly Leu

100 105 110

Tyr Phe Thr Tyr Ile Lys Ser Lys Lys Lys Glu Ala Pro His Asp His

115 120 125

Gly Asp Gly Gly Gly Lys Val Glu Pro Ala Pro Ser Ser Leu Glu Leu

130 135 140

Pro Ala Thr Thr Phe Met Asp Asp Ser Thr Ala Gln Asn Gln Met Glu

145 150 155 160

Gln Gly Phe Asn Lys Glu Gln Pro Arg Tyr Gly Arg Ala Phe Leu Thr

165 170 175

Arg Leu Leu Leu Phe Ile Val Leu Gly Tyr His Val Val Val His Leu

180 185 190

Ala Gly Tyr Ser Leu Met Leu Leu Tyr Leu Ser Val Val Ser Gly Ala

195 200 205

Arg Ala Val Leu Ala Gly Lys Gly Ile Ser Leu His Thr Phe Ser Val

210 215 220

Phe Thr Val Val Ser Thr Phe Ala Asn Gly Gly Phe Val Pro Asn Asn

225 230 235 240

Glu Gly Met Val Val Phe Arg Ser Phe Pro Gly Leu Leu Leu Leu Val

245 250 255

Met Pro His Val Leu Leu Gly Asn Thr Leu Phe Pro Val Phe Leu Arg

260 265 270

Leu Ala Ile Trp Ala Leu Arg Arg Val Thr Arg Arg Pro Glu Leu Gly

275 280 285

Gln Leu Gln Ser Ile Gly Tyr Gly His Leu Leu Thr Ser Arg His Thr

290 295 300

Cys Phe Leu Ala Phe Thr Val Ala Thr Phe Val Leu Ala Gln Leu Ser

305 310 315 320

Leu Phe Cys Ala Met Glu Trp Gly Ser Asn Gly Leu His Gly Leu Thr

325 330 335

Ala Ala Gln Lys Leu Val Ala Ala Leu Phe Met Ser Val Asn Ser Arg

340 345 350

His Thr Gly Glu Met Val Val Asp Leu Ser Thr Met Ser Ser Ala Val

355 360 365

Val Val Leu Tyr Val Val Met Met Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr Thr Phe

370 375 380

Leu Pro Val Glu Asp Asp Ser Asp Gln Gln Val Gly Ala Asp Gln His

385 390 395 400

His Gln Lys Arg Val Thr Ser Ile Trp Arg Lys Leu Leu Met Ser Pro

405 410 415

Leu Ser Phe Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Val Cys Ile Thr Glu Arg

420 425 430

Arg Gln Ile Ser Asp Asp Pro Leu Asn Phe Asn Val Leu Asn Ile Thr

435 440 445

Val Glu Val Ile Ser Ala Tyr Gly Asn Val Gly Phe Ser Thr Gly Tyr

450 455 460

Ser Cys Ala Arg Gln Val Thr Ala Asp Gly Gly Cys Arg Asp Thr Trp

465 470 475 480

Val Gly Phe Ser Gly Lys Trp Ser Trp Gln Gly Lys Leu Val Leu Ile

485 490 495

Ala Val Met Phe Tyr Gly Arg Leu Lys Lys Phe Gly Met His Gly Gly

500 505 510

Glu Ala Trp Arg Ile Val

515

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atacttacca acgaatgggt tctc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtctgctact aggttatact atcc 24